等温滴 定量热 ( ITC)的原 理与技 术

等温滴定量热法（ Isothermal Titration Calorimetry， ITC）是微量热法的一种，它是近

年来发展起来的一种研究生物热力学与生物动力学的重要结构生物学方法，它通过高灵敏

度、高自动化的量热仪器连续和准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线，原位（ in

situ）、在线（on-line）和无损伤地提供热力学信息[12]。

1. 概述

等温滴定量热实验将一种反应物滴定到含有反应所必须的另一反应物的样品溶液中。每

次滴定后，反应热放出或吸收，这些都可以被 ITC 所检测到。检测到的热效应的热力学分析

提供了结合反应相关的能量过程的定量特征，可以直接测量与常温下发生的反应过程相关

的能量学参数。

2 ． 特 点

ITC 具有一系列特点，使得它特别适用于生物大分子的研究[12]：

ITC 能测量到的热效应最低可达 125 nJ，最小可检测热功率 2 nW，生物样品最小用量

0.4 µg，而且这些年来 ITC 的灵敏度得到了提高，降低了响应时间（小于 10 s）。

ITC 不需要固定或改变反应物，因为结合热的产生是自发的。

ITC 比那些选择分析方式（如分析型超速离心法， AU）快，一个单纯的 AU 实验需要

几个小时甚至几天去完成，而典型的 ITC 实验只需 30－60 分钟，再加上几分钟的响应时间。

整个实验有计算机控制，使用者只需输入实验的参数（温度、注射次数、注射量等）计算机

就可以完成整个实验，再由 Origin 软件分析 ITC 得到的数据。其精确度高以及操作简单。

3．结构与原 理

ITC 的结构如图一所示。热槽中有两个完全一样的滴定池，一个是样品滴定池，一个是

参比滴定池。两个滴定池各自包含一个滴定控制器和转子，滴定池外壁由热电堆包围，并且

附有能量补偿反馈元件。实验进行时，样品池中加入反应所需要的反应物，参比池中加入不

与滴定剂发生反应的物质，然后两边同时滴定。样品滴定池中由于有反应的发生，所以会产

生热量的变化，温度升高或降低。温度的变化通过热电偶测出，并输入电脑。电脑根据检测

信号给出反馈信号，能量补偿反馈元件对放出反应热的体系进行降温处理；对吸收反应热
的体系进行升温处理，使得体系的温度保持在恒定水平。正是由于有了这样的能量补偿系统，

滴定反应器的温度被强制维持在恒定值，加快了实验进行的速度。在反应物滴定完成后，有

时还需要进行空白实验，以扣除稀释热的影响。

图一

4．实验结果 示意图及 结果分析

ITC 实验的结果由电脑自动记录并作图(图二所示)。

横 坐 标 是 滴 定 反 应 的 时 间 (min) ， 纵 坐 标 是 热 功 率 (µ

cal/sec)。由于有能量补偿系统，谱图的基线为一水平线，

峰形尖锐。峰底与峰尖之间的峰面积为每次注射时释放或

吸收的总热量。此原始图谱并不直观，往往需要处理成等

温曲线，以便更好的说明实验结果。

将横坐标由时间转化为两反应物的摩尔比或是

滴定剂的物质的量，把每个峰的面积做积分作为纵

坐标，就得到了处理后的等温曲线（图三）。
图三
滴定进行到一定程度，被滴定反应物中的结合位点被滴定剂饱和，反应热的变化来源

于滴定剂的稀释热，曲线的变化越来越平缓，且趋近于零。曲线等量点处的摩尔比，反映了

反应物的结合位点数(n)的信息[13]。通过电脑自带的程序进行非线性最小二乘法的分析，就

可以获得结合常数（Ka）、结合位点数（n），结合焓（△H）的数据结果[14]。反应的吉布斯

自由能与反应常数直接相关，因此，我们可以根据式（1）计算出反应的吉布斯自由能。

VG   RT ln K （1）

又因为， G  H  T S 。根据获得的生成焓和吉布斯自由能的数据可以计算出反应

的熵变。

如果对不同温度下的反应体系做 ITC 实验，得到等压不同温度下的反应焓，因为

dH
Cp  （2）
dT

根据（2）式计算便可获得体系的恒压热容变化。

参考文 献：

[12]梁毅，结构生物学，北京：科学出版社，2005

[13]John E Ladbury, Babur Z Chowdhry, Chem. Bio., 1996,3(10):791

[14]Ilian Jelesarov, Hans Rudolf Bosshard, J. Mol. Recognit., 1999,12:3

[22] Matthew J. Cliff, Aldo Gutierrez, John E. Ladbury, J. Mol. Recognit., 2004, 17: 513

[23] Matthew J. Cliff, John E. Ladbury, J. Mol. Recognit. 2003, 16:383

[24] Abdessamad Ababou, John E. Ladbury, J. Mol. Recognit, 2006, 19: 79