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REVISÃO DE MICROSCOPIA
Com a ajuda do microscópio não há nada tão pequeno que possa escapar às
nossas investigações; portanto há um novo e visível mundo descoberto a ser
entendido. Robert Hookie (Micrographia, 1664).
2005
Tipos de microscopia
Histórico
Desde a antiguidade povos como os egípcios, gregos e romanos
conheciam a arte de talhar e polir cristais de rochas e usam essas primeiras lupas
primitivas como objetos decorativos. No entanto, somente em meados do século
XIII, um monge chamado Alejandro Spina divulgou o segredo e a construção da
fabricação de lentes corretivas. Os primeiros estudos científicos datam do século
XVII conduzidos por Johanes Kepler que estudou os fenômenos óticos e a
formação de imagens no olho.
Atanásio Kircher (1601-1680) foi o primeiro a usar a palavra
microscopium nome dado ao microscópio daquela época (Gato, 2005).
Muitos atribuem a invenção do microscópio a Galileu, porém foi Antonie
van Leeuwenhoek, (1632-1723), quem realmente aperfeiçoou o instrumento e o
utilizou na observação de seres vivos. Seu microscópio era dotado de apenas
uma lente de vidro, permitindo um aumento de até 300 vezes. Com este
instrumento Leeuwenhoek estudou os glóbulos vermelhos do sangue e constatou
a existência dos espermatozóides (Embrapa, 2005).
Robert Hooke, em 1665 publicou seu livro intitulado “Micrographia”
onde descreveu o microscópio e como ele havia descoberto a circulação do
sangue nos peixes. Em seu microscópio, Robert Hooke incorporou o ajuste fino
e acrescentou mais uma lente (Embrapa, 2005).
Após o aprimoramento, os microscópios ficarão constituídos por 2
sistemas de lentes de cristal (oculares e objetivas) que produzem ampliações de
imagem que vão em geral de 100 a 1000 vezes (Embrapa, 2005).
Em 1932, surgiu o microscópio eletrônico permitindo aumentos de 5 mil
a 500 mil vezes. A diferença básica entre os microscópios ótico e eletrônico é
que neste último não é utilizada a luz, mas sim feixes de elétrons. No
microscópio eletrônico não há lentes de cristal e sim bobinas, chamadas de lentes
eletromagnéticas. Estas lentes ampliam a imagem gerada pela passagem do feixe
de elétrons no material e a projetam em uma tela onde é formada uma imagem
de pontos mais ou menos brilhantes. No entanto, é impossível observar material
vivo neste tipo de microscópio. O material a ser estudado passa por um
complexo processo de desidratação, fixação e inclusão em resinas especiais,
muito duras, que permitem cortes ultrafinos por meio das navalhas de vidro de
ultramicrótomo (Embrapa, 2005).
Na história da microscopia, 200 anos foram necessários para que o
microscópio deixasse de se ser um instrumento exótico e pouco acessível para
ser usado em uma escala mais ampla. Então, a partir do séc. XIX, graças aos
estudos realizados por microscopistas puderam afirmar o conceito de célula
como verdade científica, surgindo a ciência da biologia celular (Melo, 2002).
Microscopia de luz
Microscópios são aparelhos nos quais lentes de vidro são associadas de
tal forma que se consiga reproduzir para o olho humano, uma imagem
aumentada e detalhada de objetos, células, tecidos e órgãos, que à vista
desarmada não seria possível de se observar mais detalhes (Taboga, 2001).
O microscópio de luz é assim chamado devido sua fonte luminosa que é
uma luz branca oriunda de um filamento de tungstênio (Melo, 2002). O conjunto
de lentes é formado pelas objetivas e oculares. A objetiva, a primeira lente e a
que está mais próxima do objeto, capta a luz filtrada pelo condensador e projeta
uma imagem real, invertida e aumentada da estrutura. A lente ocular, presta-se a
aumentar a imagem projetada pela objetiva, para ser captada pelo olho do
observador (Parreira, 2005) (Figura 1).
No microscópio ótico, a luz que chega aos nossos olhos para formar a
imagem, atravessa primeiro o objeto em estudo. Por isto, o material a ser
observado não pode ser opaco. Muitas vezes, para se obter material biológico
translúcido o suficiente para ser bem observado ao microscópio, é preciso
preparar convenientemente o material que quer estudar. Para isto são feitos
cortes muitos finos, de preferência com uma máquina, chamada micrótomo. O
material a ser cortado recebe um tratamento de desidratação e inclusão em
parafina que facilita o manuseio e permite que sejam cortadas fatias muito finas
(Embrapa, 2005).
Na microscopia de luz existem vários tipos de aparelhos, os quais
apresentam sistemas de lentes e filtros que selecionam um ou outro tipo de luz,
diversificando as imagens formadas. Estes aparelhos são chamados microscópios
especiais e são chamados: microscópio de campo claro, campo escuro,
fluorescência, invertido, confocal (microscopia de varredura confocal) e de
polarização.
a. Microscopia de campo claro
O microscópio de campo claro é o mais comum microscópio de luz
(Melo, 2002). Nesse microscópio, o campo de visão aparece iluminado e os
objetos que estão sendo observados apresentam-se mais escuros (Reis, 2003).
Segundo Weiss et al. (1991), a microscopia de campo claro apresenta
algumas vantagens como menor toxicidade por necessitar de menores
concentrações de corantes; baixo contraste, devido ao uso de baixas
concentrações de cromóforos naturais ou especialmente corantes vitais, pode ser
grandemente aumentados; observações feitas no comprimento de onda de
máxima absorção aumentam o contraste. Entretanto, apresenta algumas
limitações como objetos de fase exibem mínimo contraste em foco e mostra
contraste oposto por cima e abaixo do foco.
e. Microscopia de fluorescência
A microscopia de fluorescência é, provavelmente, a mais versátil e
poderosa técnica para localizar proteínas dentro da célula pela microscopia de
luz (Lodish et al., 2003).
Fluorescência é a propriedade de algumas substâncias para, após serem
excitadas com radiação de baixo comprimento de onda, emitirem radiação de
maior comprimento de onda. Algumas substâncias absorvem a energia da
radiação ultravioleta emitindo depois radiação dentro do espectro de luz visível.
Microorganismos corados por um corante fluorescente aparecem como objetos
luminosos quando observados com luz ultravioleta. É com os recursos desta
técnica que se evidenciam, por exemplo, os antígenos quando associados a
anticorpos acoplados a moléculas fluorescentes, e quantifica-se pelo processo de
fluorometria os objetos de estudo da citoquímica normal e patológica (Taboga,
2001).
O mais fluorescente corante é chamado de fluorocromo, capaz de emitir
luz visível (Lodish et al., 2003). Dois exemplos de fluorocromo é o corante
alaranjado de acridina que se liga aos ácidos nucléicos conferindo uma
fluorescência amarelo esverdeada ao DNA e avermelhada ao RNA, e a eosina,
que apesar de não ser um fluorocromo se comporta como tal, aumenta a
fluorescência natural da elastina (Taboga, 2001). Os fluorocromos, quando
conjugados com anticorpos, torna possível a identificação de células individuais
que reagem com o anticorpo (aplicação designada de imunofluorescência) (Reis,
2003). Os fluorocromos podem se combinar com estruturas celulares, tornando-
as fluorescentes, tornando-as passíveis de identificação e localização, como
proteínas ou estruturas celulares (Melo, 2002).
O microscópio de fluorescência utiliza um sistema óptico que interage
pouco com a luz. Utiliza-se uma luz de mercúrio de alta pressão, cujos picos
variam entre 312 e 579 nm. Nessa microscopia também há filtros especiais
chamados de filtros de excitação e filtros de barragem (Taboga, 2001). Os filtros
de excitação localizam-se logo após a saída de luz antes do condensador,
selecionando o comprimento de onda desejado. Já, os filtros de barragem
localizam-se entre a objetiva e a ocular, após o objeto, deixando passar somente
a luz fluorescente, então o material fluoresce contra um fundo escuro (Taboga,
2001) (Figura 7).
Microscopia eletrônica
A construção do microscópio eletrônico foi de suma importância para a
observação de organelas e estruturas celulares que até então eram desconhecidas,
pois se encontravam abaixo do limite de resolução do microscópio ótico (Melo,
2002).
Como foi mencionado anteriormente, o poder de resolução do
microscópio óptico está limitado pela abertura numérica e pelo comprimento de
onda da radiação. Não sendo possível aumentar a abertura numérica, a solução
passou pela utilização de radiação de menor comprimento de onda ( ) (Reis,
2003).
Em 40 anos a microscopia eletrônica foi inventada, sendo que 2
princípios básicos, propostos no início do século XX, foram primordiais para a
construção do microscópio eletrônico (Melo, 2002). O primeiro, estabelecido,
em 1924, por Louis de Broglie, um físico francês, demonstrou que os elétrons
têm propriedades ondulatórias, à semelhança da luz visível, ultravioleta e raios x.
O comprimento de onda de um elétron em movimento depende da sua
velocidade e esta da energia de aceleração que lhe é imposta (Reis, 2003). O
segundo foi do inglês Bush, que em 1926, demonstrou que um campo
magnético, adequadamente estruturado, poderia ser usado como lentes de
aumento para um feixe de elétrons (Melo, 2002). Então, o comprimento de onda
de um elétron é dado por:
Fotomicrografia
O uso da fotografia para capturar imagens advindas de um microscópio
data da invenção do processo de fotografia. As primeiras fotografias foram
memoráveis devido à qualidade que apresentavam, mas a técnica era muito
trabalhosa e sobrecarregava com longas exposições e era considerado um
processo difícil. O primeiro meio para fotomicrografia foi o filme que até a
década passada era o principal, porém com os avanços da câmera eletrônica e a
tecnologia computacional a imagem digital tornou-se mais barata e mais fácil
para o uso do que a fotografia convencional (Abramowitz, 2005).
A qualidade da fotomicrografia seja digital ou gravada em filme, depende
da qualidade do microscópio. O filme é um severo juiz de quão bom o
microscópio tem sido priorizado para capturar a imagem. É essencial que se
tenha um microscópio bem configurado usando Köhler iluminação e que o
campo e o diafragma condensador estejam ajustados corretamente e que a altura
do condensador esteja otimizada. Então, propriamente ajustado, o microscópio
mostrará imagens do campo todo de visão com boa iluminação e fornecerá o
melhor contraste e resolução (Abramowitz, 2005) (Figura 17).
Figura 17. Exemplo de um microscópio capaz de
observar e fotografar simultaneamente as imagens
através do microscópio com sistema de fotomicrografia
incorporado (microscópio biológico trinocular QUIMIS
Q-106F).
(
Fotomicrografia digital
O principal mecanismo de gravar as imagens vistas através do
microscópio, por muito anos, foi a produção de fotomicrografia por meio do uso
de filmes, porém na última década, os cientistas têm começado a capturar as
imagens por meio de câmeras eletrônicas (Abramowitz, 2005).
As câmeras digitais operam capturando a imagem projetada diretamente
em um chip de computador sem o uso de filmes. Nestes últimos anos, o número
de pixels de informações capazes de serem capturados e estocados pela melhor
câmera digital é próximo, mas ainda pequeno, comparando com a resolução do
filme tradicional (Davidson e Abramowitz, 2005).
A seleção da câmera digital deve ser realizada com muito cuidado,
incluindo exame de espécimes fixados ou vivos, necessidade de imagens em
escala de cinza ou cor verdadeira, sensibilidade a baixo nível de luz como
fluorescência, resolução, velocidade de aquisição de imagem, uso em
investigações qualitativas e quantitativas, taxa de alimentação de vídeo para o
computador ou VCR. Em geral, dois tipos de câmeras estão disponíveis para uso
na microscopia são as câmeras tubo (famíliaVidicon ) ou CCD (dispositivo
duplo de mudança) (Davidson e Abramowitz, 2005).
Um critério para seleção de uma câmera eletrônica para microscopia
inclui sensibilidade da câmera, eficiência quântica, resposta espectral,
capacidade de alcance dinâmico, velocidade de aquisição de imagem e leitura
externa, resposta, velocidade de resposta em relação a mudanças na intensidade
da luz, acerácea geométrica e adaptabilidade de leitura ao microscópio. Um
importante critério para a mais nova câmera digital CCD é a resolução, sendo a
preferida para pesquisa (Davidson e Abramowitz, 2005).
O alcance dos chips disponíveis está entre 64 x 64 pixels até 2048 x 2048
e acima quando se trata de condições bem especificas. Sua grande capacidade de
resolução de imagem a torna a câmera digital uma poderosa rival para as
câmeras de filme (Davidson e Abramowitz, 2005).
Referências bibliográficas
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WEISS, D.G.; MAILE, W.; WICK, R.A. Video microscopy. In: Light
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