第三章 培养用液

培养液是维持细胞生存和生长所需的基本溶液。除培养液外，还有各种杂用液。培养用液主要分为三
类：
平衡盐溶液(Balanced Salt So1ution：BSS)
天然培养基(NaturalMedium)
合成培养基(Synthetic Medium)
BSS 又称生理盐水或盐溶液。本身具有维持渗透压，调控酸、碱度平衡的作用，同时能供给细胞生存
所需的能量和无机离子成分；用作洗涤组织、细胞以及配制各种培养用液的基础溶液。
天然培养基在细胞培养中使用最早，也最有效，主要来自动物体液或从组织中分离提取制备的成分，
其营养性较高，但成分复杂，个体差异较大，另外在来源上也有一定的限制。
合成培养基是按人和动物体内细胞所需成分模拟合成的、配方恒定的一种较理想的培养基。但对动物
细胞来说，它也只能维持细胞的生存，要想使细胞生长和增殖，还需补充部分天然培养基，即把两者混合
在一起使用，效果才更好。合成培养基的出现，促进了组织培养的发展，减少了生物个体差异的影响。细
胞生长在合成培养基中健康透明，利于延长细胞在体外存活的时间。
由于培养液是细胞赖以生存的环境，制备过程要操作严格，避免混入杂质。使用的成分应精心选择，
必须用质量最优的试剂，容器要仔细清洗和消毒。制备好的培养用液要标注上名称、配制日期，妥善贮存。

第一节 水和平衡盐溶液

一、水

水是细胞赖以生存的主要环境；营养物质和代谢产物都必须溶解在水中，才能为细胞吸收和排泄。而
且，水溶液对维持细胞形态、进行生物化学反应、温度传导、调节渗透压和酸碱度的平衡都有着重要作用。
体外培养细胞对水的质量很敏感，要求很高。水的纯度不够，即使杂有一些含量极微的有害元素，有时也
会对细胞产生不利的影响，甚至引起细胞中毒死亡。因此，配制培养液用的水必须经过纯化。
细胞培养实验室需用纯净的水，分离子交换水和蒸馏水两种。前者由于仍然带有非离子物质和有机物，
在组织培养中很少使用。组织培养必须使用玻璃蒸馏器制备的三次蒸馏水；二次蒸馏水或外购的金属蒸馏
器制的蒸馏水只能用于清洗器皿。
蒸馏水的贮存对保持水的质量有很大影响；周围环境和空气能使水污染，或改变其 pH，所以贮存水
的容器要尽量减少启开的次数，避免和外界多接触，存放时间不宜太长，一般不要超过两周，最好现制现
用。

二、平衡盐溶液

BSS 种类：(表 3-1)

BSS 是从 Ringer 生理盐水发展起来的，主要由无机盐和葡萄糖组成。BSS 中的无机离子不仅是细胞生
命所需成分，而且对维持渗透压、缓冲和调节溶液的酸碱度方面，起着重要作用。BSS 内含少量的酚红，
作为溶液酸碱度变化的指示剂；溶液变酸时呈黄色，变碱时呈紫红色，中性时呈桃红色，借此易于观察到
培养液 pH 的变化。

1
 表 3-1 是几种常用 BSS 中的组
成成分的比较。Hanks 液和 Earle 液
是配制各种培养液最常用的基础溶
液，它们的主要区别在于缓冲系统
不同。Hanks 液缓冲能力较弱，需利
用空气平衡；Earle 液含有高浓度的
NaHCO3，缓冲能力较强，需用 5％
的二氧化碳平衡。
钙、镁离子是细胞膜的重要组
成成分，它们有促使细胞凝聚作用。
因而配制离散细胞用的消化液和细
胞洗涤液时，宜采用钙、镁离子含量低的 Dulbecco 液和无钙、离子的 D-Hanks 液，或更为简单的 PBS 液。

第二节 天然培养基

天然培养基包括：血清、组织提取液、如鸡血浆，鸡胎汁等。其中血清是一种仍在广泛应用中的天然
培养基，市场有产品出售。而血浆应用较少，因此用时多自己制备。

一、鸡血浆的制备

鸡血浆为最早用于培养的液体，含有纤维蛋白原和一定的营养成分，当与鸡胚胎汁混合后，能发生凝
固，构成细胞生长的环境，利于细胞向三维空间生长，缺点是易于液化。因制备血浆后不再做无菌处理，
全过程必须在严密无菌条件下进行。利用生长一年左右体大、健壮的雄鸡，采血前一天禁食，多喂水，制
备方法如下：
(1) 肝素溶液制备：配制浓度 20m8／100m1 生理盐水肝素液，9 磅 10 分钟高压或滤过灭菌，每小瓶
中分装入 0.5m1 贮 4℃冰箱中备用；
(2) 动物准备：缚鸡于手术架上，令仰卧，从鸡翅取血；展开鸡翅，拔除翅根局部羽毛，选血管粗大
部位，碘酒和酒精棉球消毒；
(3) 采血：取 20ml 无菌注射器，先吸入肝素液少许，湿润注射器内壁后，用 16 号针头刺入静脉，吸
血 10ml，立即注入离心管中，摇匀；
(4) 分离血浆：3000 转／分离心 10 分钟后吸出上清血浆，分装入小瓶中，-20℃冰箱贮存备用。
也可采用从鸡的心脏穿刺取血，方法是从锁骨上窝部进针，直接穿入心脏；取血量大而快，用此法来
血亦可。

二、鸡胚浸出液的制备

鸡胚浸出液内含有生长因子、大分子核蛋白和小分子氨基酸等，有刺激细胞生长作用，为早年培养使
用的培养用液，现已被合成培养液所代替，但在某些研究中仍有一定应用价值，制取过程如图 3-1 所示：

(1) 孵化：选健康受精鸡卵，置入 37℃温箱孵化；箱内置有水皿，以保持箱内湿度，每日翻动卵一次

(180 度)；
(2) 处理：孵育至 9～12 日，取出鸡卵置小烧杯中，令气室端向上，用碘酒和酒精消毒蛋壳；
(3) 取胚：用消毒剪剪除气室端蛋壳，小心拨开尿囊膜，用弯玻棒或弯镊伸到胚体颈下方，轻轻挑起

2
 鸡胚置入平皿中；
(4) 清理：去掉胚眼、血块、尿囊膜等物；用 BSS 冲洗鸡胚；
(5) 粉碎：置入烧杯中用剪刀剪碎胚体后，再用组织研磨器研磨；或放入 20～50m1 注射器中(无针头)
直接压挤入无菌小烧杯中；
(6) 浸出：加入等量的 Hanks 液，用吸管轻轻吹打均匀，密封后置 37℃温箱中 30 分钟；
(7) 分离：3000 转／分，离心 30 分钟，无菌取上清分装入小瓶中，-20℃保存；用前再离心一次，取
上清使用；全部操作过程要保持无菌，要剔除尿囊膜和眼睛等，以免对细胞产生不良作用。

三、血清(Serum)

血清为天然培养基中最为重要和在组织培养中最常使用的天然培养基。血清之所以成为培养中不可少
的成分，主要因血清中含有很多种不可缺少的能维持细胞生长增殖的成分。在按人体内成分模拟制成的合
成培养基中，细胞所需成分虽相当齐全，但仍然缺少很多能影响细胞增殖和各种生物学性状的未知成分，
故只有补充血清后，细胞才能更好地生长增殖和进行一定的功能活动。因此在当前血清仍然为培养细胞中
不可缺少的天然培养基。

(一)种类

血清分为人血清和动物血清两大类。培养人细胞用人血清，物种相同，对细胞有利，但价格昂贵，且
有因个体差异造成的生物活性不均一和易混有其它成分如肝炎和爱滋病毒等缺点，故使用较少。在组织培
养中还是以动物血清更为常用。动物血清可来自牛、马、猪、免等动物，以牛和马血清为好。两者中牛血
清比马血清用得更多；牛血清分胎牛血清和小牛血清两种。胎牛血清是从母牛剖腹取出的胎牛中分离出的
血清，价格昂贵。小牛血清是从刚出生，但尚未哺乳的小牛分离出的血清。如厂家产品能做到符合这一要
求，小牛血清的质量与胎牛血清的差异也并非很大。如小牛出生后已哺乳，从这种小牛分离出的血清可能
含有较多的生物活性物质，其质量显然就不如前者。当前血清仍为主要的常用天然培养基。

(二)血清中成分

1．蛋白质：
蛋白质是血清中主要成分，它们的主要作用有：
① 一些蛋白在培养中携带金属离子、脂肪酸和自身是激素，
② 还有一些蛋白质，主要为白蛋白和球蛋白。纤维粘连素(Fibronectin)能促细胞附着； α2 巨球蛋白
有抑制胰蛋白酶的作用。胎牛血清中含有胎球蛋白(Fetuin)也能促细胞附着。转铁蛋白(Transferrin)
能结合铁离子，减少其毒性和被细胞所利用。
③ 还有一些蛋白的作用目前还不清楚。
2．多肽：
凝成血块后析出的血清有促细胞增殖作用，要比去掉血细胞后分离出的血清作用强。现已清楚，是因
在凝血过程中从血小板释放出一种多肽血小板促生长因子(Platelate Derived Growth Factor; PDGF)的结果。
PDGF 是具有促细胞分裂多肽家族成员之一，可能是血清中的主要促细胞增殖因子。PDGF 有促成纤维细
胞和胶质细胞增殖的作用，但对上皮细胞增殖的作用可能为抑制和促细胞分化。现也已从组织中分离出其
它生长因子如 FGF、EGF、MSA 等，但其在血清中的含量不一定很多。
3．激素：
激素对细胞的作用是多方面的，它们的作用通路也较难追溯。胰岛素有促细胞摄取葡萄糖和氨基酸的

3
作用；它的这些作用可能与其能促细胞分裂相关。有一些生长因子如 IGF1，IGF2 等，也能与细胞表面的胰
岛素受体相结合，从而具有与胰岛素同样的作用。在胚胎血清中含促生长激素更多，它们可能与 Stomatodin
相结合而发生促细胞增殖效应。在血清中也含有不定量的氢化考的松，它可能兼有促细胞贴附和增殖作用；
但有人证明，在一定条件下，如细胞密度高时，对细胞可能有抑制作用和诱导其发生分化。
4．其它成分：
血清亦含有氨基酸、葡萄糖、酮酸等一些营养成分。这对含有多种营养成分的合成培养基来说意义不
大。血清置换实验证明，血清中也含有一些与蛋白相结合状态的微量元素，对培养细胞是有意义的。此外
血清中并含有抑制细胞增殖成分，其中有的可能为血清制备过程中混进的。γ球蛋白组分可能含有与培养
细胞有交叉反应的抗体，用热灭活方法可被除掉，而不伤害多肽生长因子，不过有时也难免去除掉一些其
它有用的成分。因之热灭活血清法比不灭活也不一定总令人满意。

(三)血清的制备和评价
和其它天然培养基一样，血清也能在实验室自己制备，尤其制备小动物血清，因用量较少，是很容易
的。采血可从动物体表大的静脉或动脉用注射器直接抽血采集。若从动脉采集，一般需用乙醚等麻醉动物，
解剖出动脉或心脏再抽血。然后立即注入无菌管中，室温静置，待凝血坚实血清析出后，吸出上清、3000
转一 4000 转／分离心；然后再分离一次上清，即可应用。制备中一切操作如不能做到完全无菌，则最终
血清尚须通过 0.22μm 微孔滤膜滤过处理。血清是比较粘稠液体，滤过缓慢，比较麻烦。因此操作中要保
证做到无菌才好。
一般细胞培养多用牛血清，用量较大，现牛血清已商品化。从国外或国内均可定购到各厂家的小牛血
清制品，因此已无自制必要。血清可制成单牛血清和混合血清。单牛血清来源于一个小牛，混合血清为多
个牛血清的混合物，一般血清均为混合血清，有成分互补的优点，更适于细胞生长。
血清虽为当前细胞培养中不可缺少的天然培养基，但其含有很多难以控制的复杂不明成分，加上供血
动物的个体差异，有不利分析细胞生物学反应之弊。因此长久以来，人们一直在研究不用血清的无血清培
养基，并已取得很大进展。预期将来天然培养基必将被更加完善的无血清培养基所取代。关于无血清培养
基问题后面将单独叙述。

四、水解乳蛋白(Hydrolytic albumin)

水解乳蛋白系乳白蛋白经蛋白酶和肽酶水解的产物，是常用的天然培养基。含有丰富的氨基酸；开始
是为猴肾细胞培养设计的，但以后也用于培养其它很多细胞系，包括初代培养细胞等，效果很好。近年由
于广泛使用合成培养基，已代替了乳白蛋白。但其成分简单，在培养基不足等特殊情况下尚有其应用价值。
一般配制成 0.5％的溶液，使用时配比：80％～85％乳白蛋白液 + 15％～20％小牛血清或 40％乳白蛋白液
+ 40％合成培养基 + 15％～20％小牛血清。
水解乳白蛋白为蛋黄色粉末，易潮解结块，但不影响使用。其溶液呈微酸性。不同商品间，在色泽、
氨基酸含量和营养价值上可能有一定差异，甚至影响细胞的生长，在更换品种时应进行预试验，以检测质
量。配法如下：
(1) 称量：称 0.58 水解乳蛋白粉入烧杯中，加少许灭菌 Hanks 液调成糊状
(2) 溶解：补加 Hanks 液至 100m1，不断搅拌，令充分溶解，置室温 1～2 小时，并不时搅拌
(3) 过滤：滤纸滤过，分装入瓶中
(4) 灭菌：10 磅 10 分钟高压蒸汽灭菌后，4℃冰箱保存。

五、胶原

胶原是细胞生长良好的基质，它是从动物特定组织中用人工法提取出的，利于组织和细胞的固定，亦
4
属天然培养基。胶原主要用于细胞的附着，能改善细胞表面性质，促细胞生长。胶原可来自大鼠尾腱、鼠
真皮、牛真皮、牛眼水晶体等，其中以鼠尾胶原最为常用和制备简便，可配制成 0.1％～1％的醋酸溶液，
制法如下：
(1) 取组织：取体重 250g 左右大白鼠一只，从尾根部切断鼠尾，置 75％酒精中浸泡 30 分钟；无菌条
件下将鼠尾切成 1.5cm 小段，剔除皮毛，抽出尾瞪置平皿中；
(2) 溶解：取 1.5g 剪碎尾腱浸入 150ml 醋酸溶液(0.01～0.25M)，置 4℃冰箱中，并不时摇动，48 小时
后，移入灭菌离心管中；
(3) 分离：以 4000 转／分离心 30 分钟，吸取上清液，10 磅 10 分钟高压灭菌后分装入小瓶中，-20℃
冰箱保存；
(4) 使用方法：用吸管吸少许胶原涂于灭菌培养瓶内壁培养面上，不宜太厚，以倾斜瓶时不流动为准；
(5) 向培养瓶内通以氨气后封上瓶盖；或用浸有氨水的棉球堵塞瓶口(或不用氨气处理，而是置 37℃温
箱过夜；或置室温 48 小时，再用无菌蒸馏水冲洗凉干亦可)，作用 30 分钟，待胶原凝固，然后用
无菌生理盐水冲洗、凉干，即可使用。

第三节 合成培养基

合成培养基是根据研究和了解细胞所需成分基础上配制而成的。目的在于创制出与体内相似的生存环
境。合成培养基有固定的组成成分，利于控制实验条件标准化。合成培养基的应用极大的促进了培养细胞
的发展。·合成培养基已成为现今普遍使用的培养基。但合成培养基尚未成为十分完全的培养基，它只能
维持细胞不死，不能促细胞增殖生长，使用时还需添加天然培养基，主要是牛血清。牛血清中含有促细胞
增殖的各种生长因子和其它利于细胞生存的物质，因此当前使用合成培养基时尚需添加天然培养基。

一、合成培养基的种类(表 3-2)

动物体内所有细胞虽有共同的需要，但随细胞种类不同又有所别。因此合成培养基的种类也很多。当
然有的培养基原初虽为培养个别细胞所设计，而其适应性却很广，能适于很多细胞生长，RPMI 1640 就属
这类培养基。不过在很多情况下，还应加以选择，选择的条件除理论上考虑个别细胞的特殊生理需要外，
重要的是看其究竟能否促细胞生长增殖。所有合成培养基都含有一些共同成分，因此在组成上大同小异；
差异在于基本成分量的变化和少数特殊成分的存在与否。MEM(Minimum Essential Medium: MEM)是常用
的培养基之一，今列举九种类型的 MEM 培养基的组成供参考，从今可见一般：
(1) 199
最初，人们曾设想制备出不加任何天然成分的合成培养液。一开始有人试验在生理盐水中加入一些氨
基酸或葡萄糖，发现可以延长鸡胚组织存活的时间。1950 年在此基础上， “199”合成培养液问世，开始了
合成培养液的历史。 “199”培养液含有 69 种成分，几乎包括了所有的氨基酸、维生素和一些核酸衍生物、
生长激素、脂类，加上硝酸铁和 Earle 生理盐溶液。这是一个较为复杂的合成培养液，曾被广泛用作各类
细胞的培养。但事实上如只用“199”进行培养细胞，仅能短期维持生存，细胞并不能长期生长和增殖，
只有加了血清之后才能成为生长培养基。后来在“199”的基础上，补加了还原剂、辅酶而省略了几种 B
族维生素，改良成为“858”培养液。它可以在不加血清的情况下，能支持几种细胞系较长时期地培养。
与此同时人们又设计了一种更为复杂的 NCTCl09 培养液，它能支持许多细胞系的生长。虽然如此，在用
这些培养基时，如果不加血清，对大多数细胞来说仍只限于维持生存，却不能使细胞长期生长和增殖。 “199”
和“109”等合成培养液由于成分较为复杂，近年己很少使用。
(2) MEM Eagle:
目前常用的 MEM Eagle 培养液。它仅含有 12 种必需氨基酸、谷氨酰胺和八种维生素，成分简单，可
广泛适应各种已建成细胞系的培养。同时，易于添加或减少某些成分，也特别适于特殊研究的细胞培养工
5
作。在它们的基础上，后又改良成 BME (Basal Medium Eagle：BME)和 DMEM (Dulbecco MEM) 二种培养
液，应用也十分广泛。BME 删去了一部分必需氨基酸，增添了一些非必需氨基酸。用 BME 培养时，要求
隔天更换培养液一次，保证了细胞透亮，易于观察。DMEM 增加了各成分的用量(加倍)，葡萄糖用量可选
择高糖(1000mg／L)或低糖(400mg／L)；低糖对于生长速度较快、附着性稍差的肿瘤细胞生长有利。高糖
则特别适用于附着性较差，但又不希望它脱离原来生长点的克隆培养，效果较好，所以常用于杂交瘤技术
中骨髓瘤细胞和 DNA 转染的转化细胞的培养。
(3) RPMI l640:
也是一种常用的培养液，最初是针对淋巴细胞的培养而设计。问世后发现它能广泛适应许多种类的细
胞的培养，包括正常细胞和肿瘤细胞的培养，而且成分简单，和 MEM 一样，应用已极其广泛。
(4) Mc-Coy5A 和 Ham F12
是两种特殊用途的合成培养液。Mc-Coy5A 是一种为肉瘤细胞设计的培养液。发现它除适用于原代细
胞培养、组织活检的细胞及淋巴细胞生长外，还特别适用较难培养的细胞。Ham F12 是在 Ham F10 基础上
改良的，它们和其它合成培养液不同的是使用了一些微量元素的无机离子，如 Cu2+、Zn2+、Fe2+等。可以
在血清含量较少(2％～10％)的情况下培养细胞，而且特别适用单细胞的培养，因此常用作单细胞克隆化培
养。
除上述几种培养液外，还有许多种其它培养基，但特点不明显，不再赘述。

二、合成培养液的配制

现今国内外都普遍使用市售商品干粉合成培养基，除专门从事研究培养基者外，各实验室已无必要再
自己配制培养基。干粉型培养基是用球磨机或喷雾法将各种培养液成分混合后制成，具有性质稳定、便于
贮存和运输、使用方法简便等优点。具有维持细胞生存和代谢需要的效果，与传统方式制备的合成培养基
一样好。干粉培养基因颗粒极细，很容易完全溶解于水，配制培养液方法极易掌握，只要按照说明书将规
定重量的干粉溶解在一定量的水中即可；或按比例配制，经过消毒灭菌后即使用。但应注意，不同厂家生
产的同种产品其成分比例可能不全相同，配制方法也不同。有的培养基需加热或通气来帮助溶解，此外还
应注意有的培养基成分不完全，要求另外加入补充成分。如谷氨酰胺就是时常再单独加入的成分。另外一
般都不含 NaHCO3 成分，也需配制时自行加入。但总的原则是配制过程中要使每一种成分都必须充分溶解
和避免出现沉淀。

(一)培养液的制备
(1) 制备出去离子水(玻璃三蒸馏水)；
(2) 加温水至 15—30℃；
(3) 把干粉加入水中，搅拌令之溶解；
(4) 加 NaHCO3；
(5) 加水至最终量；
(6) 必要时用 1N HCl 或 1N NaOH 调节 pH；
因滤过时 pH 可能受影响；
(7) 用 0.22μm 或小于此微孔滤膜滤过除
菌。

(二) 培养液的种类
用各种合成培养基配制培养液时，尚需加一定量的天然培养基血清，否则细胞仍难以长期生存和生长
增殖，因血清中含有多种促细胞生长增殖和促细胞贴附因子。配制时根据添加血清量的多少，构成作用不
同的培养液，用于不同细胞和不同研究目的。此外为防止污染，培养液中尚需加一定量的抗生素。
6
 1. 生长培养液
这是用以维持细胞生长增殖之用，含血清比例较大，是培养细胞工作中最主要的培养用液，其组成为：
基本培养基 80％～90％
血清(多用小牛血清) 10％～20％
抗生素(多用青霉素 l00 单位／ml 和链霉素 100 ug／m1)
这是适用于一般细胞培养用液的组成；为培养特定细胞: 一是要选择适应性培养基，二是尚须添加基
本培养基中缺少或该细胞需要的成分。
2．维持液
这是为维持细胞缓慢生长或不死的培养液，血清含量甚少。一般细胞因缺少生长因子时不能增殖，生
常缓慢；但发生转化或癌细胞因自身有产生促生长增殖因子的能力，在血清缺少情况下仍能生长；据此维
持液可用于选择发生恶性转化的细胞。
基本培养基 95％
血清 2％～5％
注意：如培养正常细胞完全不加血清，可维持细胞不死，但时间过长细胞难免退化。

三、无血清培养基

目前，大多数动物细胞的体外培养，都不同程度地依赖血清才能生长增殖。天然培养基血清除了供给
细胞的营养成分外，还能促使细胞合成 DNA，对细胞的增殖作用很大。实验证明，提高血清的浓度，细
胞生长的最大密度也随之增加。现已清楚，血清在体外培养细胞中的作用，主要是提供了细胞增殖所必需
的生长因子。但与此同时，因血清的成分十分复杂，特别是对一些基础理论研究，因使用血清之故也可能
影响实验结果。另外血清中也含有一定量的有毒物质和抑制物，对细胞有去分化作用的成分，能影响细胞
功能的表达。因此，许多研究工作需要培养基内不应含有血清和其它天然培养基成分；如研究细胞生长因
子、单克隆抗体的制备以及细胞分泌产物的研究等，都须应用无血清培养基来进行培养细胞。因此无血清
培养技术日益受到人们的重视。
早在 50 年代，一些细胞生物学家就曾试图进行无血清细胞培养的研究。随之设计了
① NCTC109、135、MB752 等成分较为复杂的培养基，它们都能支持 L 细胞系的生长。
② Ham F12 培养基，在不含血清的条件下，成功地克隆了 CHO 细胞。
③ 后来人们又发现在合成培养液内加入一些胰岛素，可以培养 HeLa 细胞。
④ 同时又有一些用于无血清的特殊培养基 MCDB109 问世，可培养较多种类的细胞，如人成纤维细
胞、肿瘤细胞和淋巴母细胞等。
近年来无血清培养研究获得很大进展，已有各种比较好的配方问世，可用于培养多种细胞。但总的来
看尚未达到完全代替血清的程度，因此大多数研究还要使用血清。展望末来，随研究的进展和深入，完全
不用血清培养的时代必将到来。
血清之所以能被广泛用于各种细胞，原因是血清所含的促生长物不仅数量多而且种类全。机体内各种
细胞所需生长条件各不相同，要设计出一种万能无血清培养基是非常困难的，而且也不一定有这种必要。
因此当前无血清培养基的设计上有两种发展趋势，一是继续设计新的、能适应较多种类型细胞体外生长增
殖的培养基。这类无血清培养基虽不断出现，但理想的并不很多。二是在研究生长因子等工作的基础上，
向人工合成培养基内补加一定的激素、生长因子等已知物质来支持细胞的生长和增殖。补加多种成分主要
有激素、生长因子、细胞附着蛋白、金属离子转移蛋白、细胞结合蛋白、脂蛋白、脂肪酸、酶抑制剂和微
量元素等。
无血清培养基由以下成分组成：

7
(一)基础培养液
为无血清培养基的基础溶液；很多种人工合成的培养基多使用的是 HamF12 和 DMEM 培养液(二者以
1：1 相混合)，然后再补加 15mM 的 HEPES 、1.2g NaHCO3／升作为基础溶液。然后根据不同细胞的要求，
再补加其它附加成分。
无血清培养基内由于缺乏天然成分中的大分子物质对细胞的保护作用，细胞生存在这样的培养液中，
对外界刺激耐受性较差。因而对配制溶液的蒸馏水要求较高，必须要使用高纯度的蒸馏水。一般都要使用
三次蒸馏以上的蒸馏水，而最后一次蒸馏应在配制前制备后立即使用。有人认为这是无血清培养的关键之
一。

(二)附加成分
一般根据细胞的生长条件和实验的要求，在基础培养液内尚须添加一定量的其它成分。这些附加成分
主要有两类，
1） 细 胞 外 基 质 (Extracellular Matrix ： ECM) 类 ， 能 帮 助 细 胞 附 着 和 贴 壁 。 主 要 有 纤 粘 连 蛋 白
(Fibronectin)、多聚赖氨酸(Polylysine)；配制浓度为 1mg／m1，溶解在 PBS 中，-20℃保存)、胶原
蛋白等
2） 营养成分，是细胞生长和代谢所必需的。
3） 促细胞生长增殖的生长因子。
4） 还需添加酶的抑制剂，以保护细胞不受培养基内残留酶的损伤。
1. 促贴壁附着成分：
纤维粘连蛋白和层粘连蛋白便是这类能促细胞贴附物。纤维粘连蛋白的配制浓度为 25μg～50μg／
ml。用时先涂在培养瓶皿底物上；层粘连蛋白为 1μg～5μg／ml，可直接加在培养液中。
胶原不仅利于上皮细胞贴壁成分，也是细胞外基质之一，对细胞的生长增殖也有重要作用。
2．促生长增值成分：
无血清培养基中必须含有各种促细胞增殖成分，其确定是根据对细胞生长因子研究的结果，到目前为
止还没有完全统一的配方。仍然是各
实验室根据细胞种类不同确定的。但
是，通常广泛使用的成分有：转铁蛋
白、硒酸钠(Na 2SeO3)、胰岛素等。说
明它们对大多数细胞生长增殖有促进
作用，也许是它们比较容易获得。其
它一些生长因子和激素等，则是根据
个别细胞生长的要求而确定。各种成
分通常配制成贮存干液，按用量大小
分装保存，避免多次冻融。配制方法
和使用浓度详见表 3—3
本表是根据各实验室报道汇总而
成，仅供参考。除上述成分外，还有
前列腺素 E1 (25ng／m1)、促肾上腺皮
质激素 (5ug／m1)、促黄体生成激素
(500ng／m1)等。
3．蛋白酶抑制物：
对于贴壁生长的细胞来讲，做传代培养时仍需要借助胰蛋白酶的消化作用。由于无血清培养缺乏对细
胞的保护剂，残余的酶对细胞的损伤是十分严重的。目前常用酶抑制剂是大豆胰蛋白酶抑制剂 (Soybean
Trypsin Inhibitor)，使用的浓度为 0.1％～0.5％，通常配制在 DMEM／F12 的基础培养液内。使用的方法有
8
两种，一种是在胰蛋白酶作用后的单层细胞中加入适当的抑制剂，以中止胰蛋白酶的作用，但火候不易掌
握。另一种是将抑制剂加入无血清培养基内，以中止残余酶的作用，这种方法简便易行。大豆胰蛋白酶抑
制剂可经过滤除菌后，置-20℃保存。

(三)无血清培养基的制备
无血清培养开始使用的时间还不长，完全通用的无血清培养基尚处在研究阶段，然而已开始有商品供
选择，如 MCDB、Ultroser 系列无血清培养基等。
以 Ultroser G 为例，它包括有生长因子、附着因子、微量元素、激素、连结素、维生素等六种物质；
此外还含有抑制胰蛋白酶因子，便于用胰蛋白酶传代。U1troser G 为冻干制品，溶解后可用微孔滤膜过滤
除菌，可贮存于 4℃；它的刺激生长作用相当于胎牛血清的五倍。
其它类型无血清培养基在不断问世。如 MEM Iscove 也是一种粉剂无血清培养基，在 MEM 的基础上
外加有转铁白蛋白、牛血清蛋白和黄豆脂质(Soybean Lipids)，也是一种较好的无血清培养基。毫无疑问，
无血清培养基有很大的实用价值，而且是可行的，一定会得到更进一步的发展。
但由于当前尚缺少广泛使用的定型无血清产品；在所需附加物有限的情况下，也可自行配制。培养用
的 ECM 有时可以直接加入培养基内，但更经常的是使 ECM 贴附在细胞生长底物表面；生长表面用玻璃或
是无毒的塑料材料均可。制备过程要在严格无菌条件下进行，具体制备程序如下：
(1) 选择适宜的培养基质(ECM)，按上述条件先制各成贮存干液；
(2) 使用前，贮存干液用高纯度的蒸馏水稀释成 0.1mg／ml 浓度的使用液；
(3) 使用液用 0.22um 孔径的微孔滤膜过滤除菌；
(4) 用吸管吸取使用液，均匀涂于消毒灭菌的细胞培养器皿的细胞生长表面。使用液的用量可按每平方
厘米表面加 50ul 的溶液，为保证其表面全部被溶液浸湿，用量可适当增减；
(5) 室温下静置 5 分钟(使用胶原做基质时，可适当延长时间至 24 小时)，然后吸出多余的溶液；
(6) 再用灭菌蒸馏水 (100u1／cm2) 洗涤涂有 ECM 的表面，然后尽量将水分吸净控干；
(7) 根据不同细胞生长特点，接种适宜浓度的细胞进行培养。

(四)自制无血清培养基举例:

9
 以上仅是个别实验室的应用配方，但仍有很大的参考意义。然而某一种成分是否必需，并不是绝对的，
用量也可以变更。如杂交瘤细胞无血清培养基可去除氨基乙醇；转铁蛋白降至每毫升 5 微克，同样也能获
得继续分泌抗体的结果。

第四节 培养基的选择

在进行细胞培养时，选择何种培养基最为合适? 是培养成败的关键。对初代培养某些特定细胞和企图
建立传代细胞系时尤为重要。遗憾的是至今尚没有确定出为培养各种不同细胞最适的培养基。因此在选择
时一般只能采用两种办法，一是经验法，二是实验法。

一、经验法

所谓经验法即按来自各培养室或
文献报道证明哪些培养基对培养某种
细胞较合适，作为自己应用的依据。
表 3-4 中所列为已被证明较适合的培
养基。
表 3-4 所列为个别实验室的经验，
仅供参考。更为可靠的方法是在参考
他人证明有效结果的基础上，在自用
之前，再做一次选择性实验，可能更
妥。

二、实验法

是通过培养自己所用的细胞进行
选择实验的方法。看看细胞生长增殖
与否可以证明其是否适用。一般可用
多孔培养板(96 孔)做一组细胞生长曲
线两项指标的筛选实验即可。对购置
的新血清等，在使用前亦可用同样方
法进行检验(具体技术方法见培养方法
章节)。

第五节 其它常用液

在组织培养中，除前面介绍的主要培养用液外，还有其它一些必不可少的用液，它们的配制和使用都
很容易掌握。其中包括分离组织和分散细胞用的消化液、调整培养液酸碱度的 pH 调整液、防止发生污染
的抗生素溶液、检查细胞和观察研究细胞的各种染液，以及检查各种用液是否有污染的细菌培养基等。

10
一、消化液

经常使用的是胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二钠(EDTA)两种溶液，它们是传代细胞时用以使细胞脱离附着
底物表面和离散成单个细胞。它们可以单独使用，也可按一定比例与胰蛋白酶混合一起使用，这主要根据
细胞的要求，可自行试验以做取舍。从经济和使用方便考虑，因 EDTA 易获得和易配制，可以选择作为常
用的消化液。

(一) 胰蛋白酶溶液
胰蛋白酶主要采自牛或猪的胰脏，是一种黄白色粉末，易潮解，应放置冷暗干燥处保存。主要作用是
使细胞间的蛋白质水解，使细胞相互离散。胰蛋白酶的活力是用解离酪蛋白的能力表示的。经常使用的有
1:125 和 1:250 的两种浓度，即 1 份胰蛋白酶能分
别解离 125 分或 250 分酪蛋白。胰蛋白酶对细胞的分离作用与细胞的类型和细胞的特性有密切关系。不同
的细胞系对胰蛋白酶溶液的浓度、温度和作用时间等的要求也不一样。一般来讲，浓度大、温度高、作用
时间越长，对细胞分离能力也越大，但超过一定的限度也会损伤细胞。胰蛋白酶溶液在 pH8.0，温度为 37
℃时，作用能力最强。此外；许多学者认为，钙离子、镁离子和血清中蛋白质的存在会降低其活力。所以
都常用无 Ca2+、Mg2+的溶液配制。消化细胞时，加入一些血清或含血清的培养液，或胰蛋白酶抑制剂能终
止胰蛋白酶对细胞的继续作用。
在国外生产厂家的目录中，除我们常用的较为粗制的混合型胰蛋白酶外，还有从中提取纯化的各种
亚型的精制胰白酶产品，它们对某种特定组织解离作用较强，可以用于特珠需要，但价格较为昂贵。胰蛋
白酶溶液的配制法如下：
(1) 将 D-Hanks 液或 Dulbecco 盐溶液高压消毒灭菌，用 NaHCO3 液调节 pH 至 7.2 左右；
(2) 称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，先用少许消毒的盐溶液调成糊状，然后再补足盐溶液，搅拌混匀，
置室温 4 小时或冰箱内过夜，并不时搅拌振荡；
(3) 次日先用滤纸粗滤，再进行过滤除菌，分装入瓶中，低温冰箱保存备用，常用浓度为 0.25%或
0.125%；胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可调 pH 至 7.2 左右。

(二)EDTA 溶液
EDTA 是一种化学整合剂，其溶液又称 Versen 液，对细胞有一定的离解作用，并且毒性小，价格低廉，
使用方便。使用浓度一般为 0.02％，但某些个别细胞系要求浓度较高；用无钙、镁盐溶液溶解后，高压蒸
汽灭菌，分装成小瓶，室温或 4℃冰箱保存。

二、pH 调整液

在许多情况下，为了营养成分稳定和延长贮存时间，在配制营养液时都不预先加入 NaHCO3，而在使
用前再加入。因此 NaHCO3 都是单独配制、消毒除菌。此外，为了维持培养液恒定的 pH，以利于细胞的
生长和增殖，还可利用 HEPES 作为添加剂。

(一)NaHCO3 液
常用的浓度有 7.4％、5.6％、3.7％三种，配制时，用三蒸馏水溶解后，过滤除菌，分装小瓶，盖紧瓶
塞，4℃冰箱或室温下保存。或用 10 磅 10 分钟高压蒸气灭菌亦可；可能有部分 NaHCO3 被破环，但操作
简单方便。消毒后要迅速封上瓶口，以免 CO 2 逸出。调节溶液 pH 时，NaHCO3 液要逐滴加入，并不对搅
动培养液，以防加入过量，使 PH 值过度增高；如溶液内含有酚红指示剂，可按颜色变化判定。当 pH 值
超过后，可用高压灭菌的 10％醋酸溶液或通入 CO 2 气体方法调节。
11
(二)HEPES(分子量 238.31)液
HEPES 可按照所需的浓度，直接加入到配制的培养液内，再过滤除菌，通常配制成 lM 的浓度
(1) 用 200m1 双蒸水溶解 47.6 克 HEPES，用 1N NaOH 调节 pH 至 7.5—8.0；
(2) 过滤除菌后，分装小瓶，室温或 4℃保存。
HEPES 的使用，由于细胞的代谢作用，培养液很快变酸成黄色，pH 值下降。另一方面，在细胞接种
量少，生长缓慢时，pH 值要上升。这些对细胞的生长都不利，可以及时更换培养液，但培养基中营养并
未耗尽，因此只调 pH 即可。调 pH 除用 NaHCO3 外亦可用氢离子缓冲剂，它们具有能较长时间控制恒定
的 PH 值的作用，HEPES 就是其中的一种。HEPES 具有较强的缓冲能力；使用最终浓度一般为 10—50 mM，
可以根据缓冲能力的要求而定。

三、抗生素液

培养液内加入适量的抗生素，以预防由于操作不慎而产生的微生物污染。常用的抗生素有青霉素、链
霉素、卡那霉素和庆大霉素等。常用 1×浓度的盐溶液配制成 100×或 200×的贮备液，分装成小瓶，冰冻
保存。使用前根据培养液的量加入到培养液内，每小瓶最好一次用完。
其中最常用的为青霉素和链霉素、培养液中用量为：青霉素 100 单位／ml 培养液；链霉素 100ug／m1
培养液。

12