Amonio

Nmeros de catlogo: 200-02 Presentaciones: 12 x 20 mL

USO Para la determinacin cuantitativa in vitro de amonio en plasma. PRECAUCION Evitar la ingestin y el contacto con la piel y ojos. Vase la Hoja de Seguridad del Material REACTIVOS Reactivo de Amonio: 12 x 20 mL de solucin acuosa (despus de reconstituido) que contiene un amortiguador, 2.2. mM de ADP, 3.5 mM de -cetoglutarato y 0.2 mM de NADPH. Reactivo de Amonio GLDH: 1 x 2 mL de solucin acuosa que contiene un amortiguador, 1200 U/mL de GLDH, y un conservador. Estndar de Amonio: 1 x 15 mL de una solucin acuosa de sulfato de amonio, (amonio) 117 mol/L (2.0 g/mL). Estndar de Amonio: 1 x 15 mL de una solucin acuosa de sulfato de amonio, (amonio) 294 mol/L (5.0 g/mL). RESUMEN DE LA PRUEBA El amonio circulante en personas normales en raras ocasiones est bajo, a pesar del hecho de que el amonio se produce continuamente de la dieta y del metabolismo de los aminocidos. Las determinaciones de amonio en sangre se han utilizado en el diagnstico de coma asociado con disfuncin heptica causada por cirrosis y neoplasmas. La determinacin de amonio es muy til en el diagnstico y pronstico de Sndrome de Reye. El anlisis de amonio en sangre siempre ha sido un proceso tedioso y que consume mucho tiempo. Los anlisis de amonio por lo general se han basado en dos enfoques: la difusin del amonio desde un medio alcalino con atropamiento en cido (1) o la separacin del amonio de una muestra utilizando una resina de intercambio inico (2). El anlisis de DCL es un mtodo enzimtico (3) que no requiere de la preparacin de la muestra y no utiliza reactivos corrosivos. PRINCIPIO El amonio reacciona con el -cetoglutarato y el fosfato dinucletido de nicotinamida adenina reducido (NADPH) para formar L-glutamato y NADP. La reaccin es catalizada por la glutamato deshidrogenasa. La disminucin en absorbancia a 340 nm debida a la oxidacin de NADPH es proporcional a la concentracin de amonio (3, 4). GLDH -Cetoglutarato + NH4+ + NADPH L-glutamato + NADP+ + H2O El uso de NADPH como cofactor en lugar de NADH minimiza la interferencia por piruvato y lactato deshidrogenasa reduciendo as el tiempo de incubacin de la reaccin (5).

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PREPARACION DEL REACTIVO El reactivo de amonio se prepara adicionando 20 mL de agua desionizada al nmero requerido de viales. La preparacin del reactivo de GLDH depende de los parmetros especficos del analizador. ESTABILIDAD Y ALMACENAMIENTO DEL REACTIVO Los reactivos incluidos son estables hasta la fecha de caducidad indicada en las etiquetas. El reactivo reconstituido es estable por 2 semanas a 2-8C y 24 horas a 18-26C. Las indicaciones de estabilidad se basan en estudios en tiempo real. DETERIORO DEL REACTIVO La solucin del reactivo debe ser clara. La turbidez indica deterioro. El reactivo de amonio debe tener una absorbancia de ms de 0.750 cuando se lee a 340 nm contra agua desionizada. EQUIPO Y MATERIALES Materiales proporcionados Se proporcionan los reactivos para la determinacin de amonio. Materiales requeridos Espectrofotmetro o analizador capaz de leer la absorbancia con exactitud a 340 nm. Agua desionizada para reconstituir el reactivo y para la preparacin del blanco de reactivo. RECOLECCION Y PREPARACION DE LA MUESTRA La exactitud de la determinacin de amonio depende en gran medida de la recoleccin de la muestra. El suero no es una muestra aceptable. Recolecte sangre de una vena libre de estasis en un tubo al vaco con EDTA. Libere el vaco residual e inmediatamente coloque la muestra en hielo y procselo en el laboratorio tan pronto como sea posible. Separe el plasma de la muestra sin dilacin. No use muestras bemolizadas. El anlisis de amonio debe llevarse a cabo antes de 30 minutos. El plasma puede almacenarse bien cerrado hasta por 2 horas procurando mantener la muestra en hielo o en refrigeracin.

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LIMITACIONES E INTERFERENCIAS Evite la contaminacin por amonio del ambiente del laboratorio. Los metales pesados interferirn en la reaccin al inhibir la GLDH. ambiental en los anlisis de amonio ocasiona resultados inexactos a menos que se apliquen los procedimientos de descontaminacin antes mencionados. Se evaluaron las interferencias para este mtodo de amonio debidas a ictericia, lipemia y hemlisis en un analizador Beckman CX 5 utilizando un criterio de importancia de variancia >10% a partir del control. Los datos para plasma y orina son similares a los presentados para el suero. Se analizaron las concentraciones de bilirrubina de 0-40 mg/dL (0-684 mol/L) con resultados aceptables a un nivel de 8 mg/dL (137 mol/L); a este nivel, se observ una interferencia negativa de 6.4% en una muestra de amonio con 109 mol/L (1.86 g/mL). La lipemia produce una interferencia importante con este mtodo; por tanto, no deben usarse muestras lipmicas. Se analizaron las concentraciones de hemoglobina de 0-1000 mg/dL (0-155 mol/L) con resultados aceptables a un nivel de 200 mg/dL (31.0 mol/L); a este nivel, se observ una interferencia negativa de 6.8% en una muestra de amonio con 117 mol/L (1.99 g/mL). Se recomiendan muestras no bemolizadas. Una muestra con una concentracin de amonio que exceda el lmite de linealidad deber diluirse con solucin salina a 0.9% y volver a analizar incorporando el factor de dilucin en el clculo del resultado. Debe tenerse cuidado de cerrar fuertemente la tapa del estndar para evitar la contaminacin pore amonio del ambiente. PROCEDIMIENTO Condiciones Siga las instrucciones indicadas para la adaptacin de la tcnica a analizadores automatizados especficos o contacte al servicio tcnico de DCL para determinar los parmetros especficos del instrumento. Genrico Longitud de onda (Primaria) .....................................340 nm (Secundaria)................................. Temperatura .......................................18-26C Paso de luz .........................................1 cm Tipo de reaccin .................................Punto final Tiempo de reaccin ............................7 min Volumen de muestra...........................200 L Volumen de reactivo ...........................3.0 mL Volumen de Inicio (GLDH) .................20 L Volumen total ......................................3.22 mL Relacin muestra/reactivo ..................1:15 CALIBRACION Se incluyen los estndares de amonio con el equipo y pueden usarse conforme a las instrucciones para calibrar el procedimiento. CONTROL DE CALIDAD Se deben analizar un suero control de nivel normal y otro de nivel anormal segn se requiera. Los resultados debern caer dentro de 2 desviaciones estndar del valor establecido. CALCULOS El analizador calcula la concentracin de amonio de cada muestra. Amonio Pgina 3 de 4 Analizador automatizado 340nm 280 nm 37C Depende del instrumento Punto final 2 10 min 25 L 270 L 18 L 288 L 1:12

VALORES DE REFERENCIA (7) 10-47 mol/L (0.17-0.80 g/mL) Se sugieren estos valores como referencia. Se recomienda que cada laboratorio establezca el rango normal para el rea donde est localizado. CARACTERSTICAS DE RENDIMIENTO Resultados Estas caractersticas de rendimiento se obtuvieron en los laboratorios de DCL aplicando procedimientos automatizados. Las concentraciones de amonio se expresan en mol/L (g/mL). Para convertir g/mL a mol/L, multiplique por 58.71. Rango de Linealidad El procedimiento manual es lineal hasta 1175 mol/L (20 g/mL). La linealidad empleando procedimientos automatizados depender de la relacin muestra/reactivo utilizada. Estudios de Precisin (NCCLS EP5-T2) Se estableci la precisin corrida a corrida al analizar 2 estndares acuosos 12 veces al da.
Amonio mol/L Estndar 1 Estndar 2 110 574 Media g/mL 1.87 9.78 Desviacin Estndar mol/L 3.5 6.5 g/mL 0.06 0.11 Coeficiente de Variacin % 3.2 1.1

La precisin dentro de la corrida se estableci ensayando 2 estndares acuosos 25 veces.

Amonio mol/L Estndar 1 Estndar 2 119 571 Media g/mL 2.03 9.73 Desviacin Estndar mol/L 2.3 2.9 g/mL 0.04 0.05 Coeficiente de Variacin % 1.9 0.5

Exactitud Se hizo una comparacin entre este mtodo y un mtodo enzimtico similar usando 49 muestras que oscilaron de 0.7 mol/L to 910 mol/L. El coeficiente de correlacin fue de 0.999. El anlisis de regresin lineal dio la siguiente ecuacin: Este mtodo = 1.12 (mtodo de referencia) + 4.1 mol/L (0.7 g/mL) DESECHO Diluya con grandes volmenes de agua, deseche en el sistema de drenaje conforme a las regulaciones federales, provinciales, estatales y locales. REFERENCIAS 1. Conway, E.J., Biochem J. 29:27 (1935). 2. Kingsley, G.R., and Tager H.S., Standard Methods of Clinical Chemistry 6:115, Washington D.C. 1970, American Assoc. of Clinical Chemistry. 3. Ratcliff, C.R., and Hall, F.F. Selected Methods of Clinical Chemistry 9:85, Edited by Willard R. Faulkner and Samual Meites, American Association for Clinical Chemistry, Washington D.C. (1982). 4. Da Fonseca-Wollheim, F., J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 11,421 (1973). 5. VanAnken, H.C., and Schiphorst, M.E., Clin. Chim. Acta 56, 151 (1974). 6. Young, D.S., Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests, AACC Press, Washington, Third Ediiton, 1990. 7. Mondzac, A., Ehrlich, G.E., Seegmiller, J.E., An enzymatic determination of ammonia in biological fluids. J. Lab Clin. Med. 66:526, 1965. Amonio Pgina 4 de 4