Optimizacin de la PCR

En la prctica, la PCR puede fallar por varias razones, entre ellas:

La PCR es una tcnica de gran sensibilidad, es decir, necesita una mnima cantidad de ADN para obtener un gran nmero de copias, as que puede ser muy propensa a errores si se lleva a cabo en condiciones inadecuadas de esterilidad, que conduzcan a la amplificacin de ADN no correspondiente a la muestra a analizar (y por tanto a conclusiones inciertas). La contaminacin con ADN extraos puede solucionarse con protocolos y procedimientos que separen espacialmente distintas etapas, y la limpieza exhaustiva de la superficie de trabajo entre la realizacin de una PCR y la siguiente. Por ejemplo, en laboratorios de deteccin gentica, se suele hacer una divisin para la preparacin de la muestra por un lado (donde se cierran los tubos) y otro donde se encuentra la maquinaria para realizar la PCR. Disponen tambin de cabinas de seguridad biolgica para reducir vapores cargados de amplicones de enfermedades, y la leja, las lmparas de UV y psoralenos son tambin muy recurridos para esta limpieza extensiva

Las tcnicas de diseo de cebadores son importantes en la mejora de la obtencin de productos de PCR y en evitar la formacin de productos falsos. Algunas consideraciones al disear estos cebadores son:

Cada cebador debe integrar entre 18 y 24 bases. Los cebadores muy cortos hacen que nuestra PCR no sea muy especfica, y los que se excedan en longitud harn que perdamos rendimiento en la reaccin. La proporcin entre bases pricas y pirimidnicas sea 1:1 (40-60% a lo sumo), y que empiecen y terminen con 1 2 bases pricas. Los cebadores no deben incluir en su secuencia regiones que sean complementarias entre s, o se formarn dmeros entre ellos.

Existe una gran variedad de polimerasas disponibles, pudiendo elegir la que ms se ajuste a nuestras necesidades. Por ejemplo, algunas tienen actividades inexistentes en otras o las realizan de forma ms eficiente, o funcionan en intervalos de temperatura en los cuales otras se desnaturalizan o pierden funcionalidad.

Los componentes del tampn de reaccin debern ajustarse a las exigencias de nuestras enzimas.

El termociclador, por supuesto, debe ser capaz de reproducir correctamente los ciclos de la PCR: para ello, diversas casas comerciales nos ofrecern termocicladores elaborados con materiales que hagan ms eficaces el desarrollo y el transcurso de las etapas, adems de diversas facilidades de manejo. Dentro del laboratorio, su manejo, mantenimiento y ubicacin ser clave.