第五 章 微生 物的 生长及 纯培 养

大型真核生物生长
质量、高度的增加
微生物类似
诸多反应 产能、合成代谢
细胞自身物质的增加
各种亚单位的组装（ DNA 、核糖体、
细胞壁等等
质量、体积
微生物 的生长
个体、 群体

个体 生长 个体 繁殖 群体生长
群体 生长= 个体 生长 + 个体繁 殖

由于 微生物 的个 体极小 、生 命周
期短 ，实际 中更 有意义 的生长指群 体
生长 ，也就 是细胞数目 的增 加。
本章要点
微生物生长的测定：
平板菌落计数法、液体稀释法

生长曲线：
延迟期、对数生长期、稳定期、衰亡期

无菌技术

微生物的分离方法：
纯培养
平皿划线分离法、稀释分离法、涂布平板法
好氧 & 厌氧培养，分批 & 连续培养
5.1 微生物生长的测定
生长测 定的重要性
什么微 生物？
纯培养 鉴定 （前面 章节 ）
微生物 的数量 ？
定量 种种 方法（ 本节 ）
微生物 不同、 方法 也不同
三类微生物的主要的繁殖方式

裂殖
芽殖
菌丝 延长
相应的生长测定方法

单细 胞（裂 殖、 芽殖）
直接 法（测 定细 胞数目 ）、 间接法
（测 定细胞 质量 或细胞 组分 ）
菌丝 延长
测定 菌丝生 长的 长度或 菌丝 的质量
微生物 个体微小， 给生长测
定带来 一定困难。 实践经验
发展出 一系列的方 法来进行
测定群 体生长——
5.1.1 直接计数法

显微 计数法
比浊 法
平板 菌落计 数法
液体 稀释法
电子 计数器 法
菌丝 长度测 定法
1 ）显微计数法

血球 计数板 —— 常用做 酵母 菌计数

1 ）显微计数法

血球 计数板
1 ）显微计数法

血球 计数板

样品 稀释 每个 计数小 室里 5 个细胞 左右
原始样品 <10 6 /ml 则不适合 应用
1 ）显微计数法

血球 计数板
优点 ：简便 快速
缺点 ：死活 均计， 即使 借助美 蓝染 色
区分 死活菌 ，离 真实活 菌数 也有差 异
。
2 ）比浊法

菌悬 液：颗 粒对 光的散 射与 吸收
一定浓度 范围 内，细 胞数 量与光 密度 成正
比
2 ）比浊法

分光 光度计
选取 一定波 长（ 400 ～ 700nm ），像
E. coli ， 580 ～ 620nm ，注意 排除
培养 液组分 的影 响
光电 比浊计
常用 于发酵 生产过 程菌 体生长 的监 测
，可 以连续 测定， 简便 快速。但如 果
培养 液含有 其他 颗粒物 或色 素则不 能
使用
3 ）平板菌落计数法

活体 计数
如实反映 样品 活体数 目
3 ）平板菌落计数法

要求 ：稀释 均匀，涂布 充分（涂布 法）或

混合 均匀（ 倾注 法）
计数 ：每个 菌落来 自一 个细胞 ，以 每个平
板 30 ～ 300 个菌落 为宜（ 9cm 平皿
）
结果 ：稀释 度 x 平均菌落 数 ＝ ??
CFU/ml
3 ）平板菌落计数法

广泛 应用于教学 、科研 、食 品检验 、

以及 其他众 多样 品中活 菌检 验
要求 熟练掌 握
4 ）液体稀释法

样品
10 X 系列稀 释
选取 3 个连 续合适 稀释 度，每 个稀
释度 做 5 个平行 测验， 记录 生长的
试管 数
对照最 大概率 表， 再乘稀 释倍 数得
出活 菌量
5 ）电子计数器法

又叫 电阻法 。
菌体通过 小孔 ，电阻 变化 ，引起 脉冲， 记录
，吸入培 养液 体积一 定， 因而脉 冲数与 菌体
数目成正 比。
优点 ： 简便快捷
缺点 ： 需特殊设 备， 对链状 菌、 丝状菌 、含
颗粒杂质 培养 液不适 用。
5 ）电子计数器法
6 ）菌丝长度测定法

主要 用于丝状真 菌的生 长测定

方法 1 ：平板 点种， 每天 测定菌 落直
径， 直至菌 落长 满平板 。
缺点 ：未反 映纵 向生长 ，同 时易受 接
种量 的影响
6 ）菌丝长度测定法

主要 用于丝状真 菌的生 长测定

方法 2 ： U 型管法 ，接种 在臂 的一端
，每 隔一定 时间 测量菌 丝的 长度。
5.1.2 间接计数法

测定 细胞干 重
测定 营养基 质的 消耗
测定 代谢产 物含 量
测定 发酵液 粘度
测定 发酵发 热量
测定 发酵液 酸碱 度
1 ）测定细胞干重

单细胞、 多细 胞均适 用， 含杂质 颗粒 的培养 物除

外
液体培养 离 心或过 滤 洗涤 除去 培养基 成
分
烘干 至恒 重 称重
2 ）测定某种营养基质的消耗

选取 标准： 营养 基质的 消耗 与菌体 生长 成

正比 ，常为 不可 用于合 成代 谢的营 养物 。
步骤 ：测定 营养基 质消 耗后， 与标 准曲线
比对 ，估算 菌体 量
3 ）测定某种代谢产物的含量

选取标 准：代谢产 物含量 与菌 体生长 成

正比

例如， CO 2 作为 有氧发 酵的 代谢产 物， 可

依据 CO 2 量估 算细胞 生长 。全自 动发 酵罐
中采用 红外线 气体 分析仪 来测 定 CO 2 的含
量
4 ）发酵液粘度
依据： 菌体 生长、 代谢 产物积 累使 发酵液
粘度 增加
5 ）发酵放热量
依据： 菌体 生长释 放热 量

6 ）发酵液酸碱度
适用于 菌体 生长或 代谢 产物导 致发
酵液酸 碱度 变化的 微生 物
5.2 微生物群体的生长规律
生长曲线及对生产的指导意义
单细胞 微生物的 典型生长曲 线
延滞期 的特点
生长 速度 为零
细胞 体积 急剧增 大
细胞 内的 RN A 增高 ，细 胞呈嗜 碱性
合成 代谢 活跃， 易产 生诱导 酶
对外 界不 良环境 条件 敏感
影响延 滞期长短的 因素
接种 龄
接种 量
培养 基成 分

发酵工 业上需 尽量 缩短该 期， 提高 设备利

用率 ，以 降低生 产成 本： 1 ）摇瓶 扩大 种子量
； 2 ）增加 接种量； 3 ）种 子培 养基加 入某 些
发酵 培养 基的成 分。
在食 品工 业上， 尽量 在此期 进行 消毒或 灭
菌
指数 期的特 点
生长速度 常数 R 最大
细胞进行 平衡 生长
酶系活跃 ，代 谢旺盛
研究菌 体的 最佳时 期
影响 指数期 微生 物增代 时间 的因素
菌种
营养成分
营养物的 浓度

发酵工业 上通 过连续 流加 或补加 营养物 ，以

达到较高 的菌 体密度
食品工业 上尽 量使有 害微 生物不 能进入 此期
细菌研 究中 常用的 三个 参数
繁殖 代数 （ n ）
指数生长 方式： 1 2 4 8… …2n
设接种时 细胞数为 N1, 时间为 t1, 到时 间 t2 后，
繁殖 n 代，细胞数 为 N2 ， 它们之间的相 互关系为：

N2 = N1*2n

以对 数表示 ：㏒ N2 = ㏒ N1 + n ㏒ 2
㏒ N2 - ㏒ N1
∴n=
㏒2
生长 速度 常数（ R ）
n ㏒ N2 - ㏒ N1
R= =
t2 – t1 t2 – t1

代时 (G)
t2 – t 1 ㏒ 2(t2 – t1)
G= =
n ㏒ N2 - ㏒ N1
稳定 期

特点 ：
1 生长速 率常数 R 等于 0
2 菌体产 量达到 了最 高值
3 合成次 生代谢 产物 （抗生 素、 色素 等）
4 细胞内 出现储 藏物 质，芽 孢菌 内开 始产
生芽 孢
产生 原因 ：
营养 物尤 其是生 长限 制因子 的耗 尽
营养 物的 比例失 调， 如碳氮 比不 合适
有害 代谢 废物的 积累 （酸、 醇、 毒素等 ）
物化 条件 （ pH 、氧 化还 原势等 ）不 合适
生长得 率
表示营 养物质 与稳 定期获 得的 菌体量 关
系
X - X0
Y =
C0 - C

C 0 为限制 性营养 物初 始浓度 ； C 为菌体 生长 后

限制 性营 养物浓 度， 稳定期 ，消 耗完， 为 0

例如 某实 验产黄 青霉 Y ＝ 1: 2. 56, 表示 2.5 g

葡萄 糖可 获得 1g 菌丝体 （干重 ）
初级、 次级代谢产 物

代谢产物与细胞形成的关系
初级代 谢产 物： 与菌 体形 成同步 ，稳 定期
末期 为最 佳收获 期。 通过连 续流 加碳源 、氮
源并 以相 关速度 移走 代谢产 物， 稳定在 对数
期末 或稳 定期提 高产 量。如 酵母 乙醇 发酵

次级代 谢产 物： 不同 步。 产生高 峰在 稳定
期后 期或 衰亡期 。通 过流加 营养 物稳定 在稳
定期 后期 。如 青霉素 生产
衰亡期

特点：
1 R 为负 值
2 细胞的 形态 发生变 化， 出现 不规则 的衰
退形
3 释放次 生代 谢产物 ，芽 孢等
4 菌体开 始自 溶
产生原 因：
生长条 件的 进一步 恶化 ，使 细胞内 的分
解代谢 大大 超过合 成代 谢， 继而导 致菌 体
的死亡

发酵 工业 需掌握 时间 结束发 酵， 避免衰 亡带

菌丝状 微生物的生 长规律
无明 显对 数期， 分为 三个阶 段：
生长 停滞 期（孢 子萌 发或菌丝 长出芽体 ）
迅速 生长 期（菌 丝分 支，形成 菌丝体， 菌丝质 量
）
衰退 期（菌丝质 量 ，出现 空泡 和自溶 ）