MINISTRIO DA SADE INSTITUTO NACIONAL DE CNCER COORDENAO DE ENSINO E DIVULGAO CIENTFICA ESPECIALIZAO EM PATOLOGIA CLNICA EM ONCOLOGIA

MECANISMOS DE RESISTENCIA AOS ANTIBITICOS

Juliana Francisco Nunes

RIO DE JANEIRO Fevereiro, 2010

JULIANA FRANCISCO NUNES

MECANISMOS DE RESISTENCIA AOS ANTIBITICOS

Trabalho apresentado ao Instituto Nacional de Cncer como requisito parcial para a concluso do Curso de Especializao em Patologia Clnica em Oncologia (Nvel Mdio)

ORIENTADORA: RENATA OLCIO JARDIM DOS SANTOS

RIO DE JANEIRO

Fevereiro, 2010

AGRADECIMENTOS:

Quem tenho eu no cu seno a ti? E na terra no h quem eu deseje alm de ti? Aquele a quem amo mais do que a minha prpria vida! Me, Pai e Irms no preciso falar.... Sophia o grande amor da minha vida: que quando eu mais precisava que dormisse l estava ela do meu lado me pedindo a Tititapra brincar. Lilah que tantas vezes esquentou meus ps ao computador. A minhas amigas, mais que irms Aline e Juliana pelo amor e apoio incondicional. Talita, foi voc quem me incentivou a fazer a prova. Passei e a culpa toda sua! Obrigada pelo incentivo! Aos meus lderes Rafael e Lia Quesada: Amo vocs demais!!! A minha Mami Renata Garcia Costa pelo apoio e pela fora. Renata que me orientou, no sendo somente no TCC. A Suzan que com incentivos e suas agulhas maravilhosas me ajudaram a ter uma vida mais saudvel! Marly, obrigado por tudo!! A Dr Ilda por ter cedido o espao do Laboratrio para esse maravilhoso tempo que passei no HC1. Aos Setores: Micologia, Bacteriologia, Urinlise/ Parasitologia, Radioimunoensaio, Bioqumica, Hematologia, Sorologia, Planto, Imunologia e Coleta. A todos que direta ou indiretamente me ajudaram a concluir mais uma etapa da minha vida. Catarina, Santina e Stephanie, que mesmo por alguns meses, agradeo pela companhia no Alojamento e em especial Catarina que me apoiou e me incentivou a conquistar meus sonhos! Ao pessoal do Alojamento: Muito obrigada pela companhia!

Simone Nolasco: sua companhia foi o diferencial!

DEDICO : Aquele que comeou a Boa Obra a quem amo mais do que minha prpria vida! Papai Eu te amo muito!!!!

SUMRIO

1. RESUMO

Desde que Alexander Fleming descobriu o primeiro antibitico, a penicilina, em 1928, o homem e a bactria disputam uma corrida e a liderana da competio vem se alterando o tempo todo. A previso, porm, de que os antibiticos, as drogas milagrosas do sculo XXI, terminem vencidos pela bactria, um dos seres mais primitivos na face da Terra. A resistncia bacteriana um dos maiores desafios do Controle de Infeces em Servios de Sade. A emergncia da resistncia o sinal mais evidente de que no est sendo levada a srio, ameaa das doenas infecciosas, minando a possibilidade de tratamento. A utilizao deve ser criteriosa quanto ao uso de antibiticos e laboratrio de microbiologia deve ser o suporte fundamental para importantes aes de controle.

Palavras Chave: Mecanismos de Resistncia Bacteriana, ESBL, MBL;

2. INTRODUO Desde que Alexander Fleming descobriu o primeiro antibitico, a penicilina, em 1928, o homem e a bactria disputam uma corrida e a liderana da competio vem se alterando o tempo todo. A previso, porm, de que os antibiticos, as drogas milagrosas do sculo XXI, terminem vencidos pela bactria, um dos seres mais primitivos na face da Terra. Se isso de fato acontecer, a humanidade far uma viagem no tempo em marcha r: voltar era em que as mulheres morriam de parto por causa de contaminao, quando uma simples infeco de ouvido infantil podia se transformar numa terrvel meningite e pequenos cortes, s vezes, provocavam at complicaes fatais. HISTRICO BREVE Em 1877, Pasteur e Jouber foram os pioneiros destes produtos. Pasteur observou que algumas colnias eram capazes de produzir substncias antagnicas a outros microorganismos. Dentre os agentes antimicrobianos (desinfetantes, compostos fenlicos, iodados, entre outros) utilizados no principio da humanidade, muitos apresentavam elevada toxidade relativa ao paciente, isto foi o que motivou os pesquisadores a desenvolverem drogas com propriedades mais seletivas e de menor toxidade ao paciente. Em 1928, Fleming contribuiu valorosamente com o primeiro componente atravs da contaminao acidental de uma colnia de Staphylococcus que foi lisada pelo Penicilium notatum. A era moderna da quimioterapia antimicrobiana inicia-se em 1936 com a introduo, na clnica, das sulfonamidas. Em 1941, a introduo da penicilina tornou-se um marco histrico na Medicina por revolucionar os princpios teraputicos at ento usados nas doenas infecciosas. Em 1941, Howard Walter Florey, Alexander Fleming e Ernst Boris Chain iniciaram a utilizao experimental desta substncia no tratamento de processos infecciosos em seres humanos, que lhes renderam o prmio Nobel de medicina em 1945. Atualmente a maioria dos antibiticos produzido

sinteticamente, alguns podem ser totalmente sintticos (cloranfenicol) enquanto outros, parcialmente sintticos (penicilinas semi-sintticas). 3. OBJETIVOS

O Objetivo deste trabalho estudar os mecanismos de ao dos antibiticos e resistncia bacteriana e alertar contra o uso inadequado de antibiticos de amplo espectro evitando assim a ocorrncia e incidncia de bactrias multirresistentes.

4. CONCEITOS PRINCIPAIS SOBRE ANTIBITICOS Segundo Waksman, os antibiticos podem ser classificados como substncias muito diferentes entre si quimicamente, produzidos originalmente pelo metabolismo de certas espcies de fungos (griseofulvina, penicilina, gentamicina, estreptomicina) e bactrias (polimixina B, bacitracina), tendo como propriedade comum atividade bactericida (inativao de todos microorganismos) ou bacteriosttica (controle do crescimento bacteriano) em condies propcias, sobre microorganismos sensveis. So drogas utilizadas no tratamento de doenas infecciosas, assim como os quimioterpicos, que apresentam toxidade apenas para o microorganismo invasor, resguardando a integridade do paciente. 4.1. DEFINIO So substncias que inibem o crescimento de microorganismos ou os destroem. Quando estes agentes so originalmente produzidos por espcies de microorganismos, portanto de origem natural, so denominados antibiticos. Quando so produzidos de forma sinttica, denominam-se quimioterpicos. Classificao dos Antimicrobianos 1. Bactericidas: Atuam na membrana plasmtica ou na parede celular AGENTES ANTIMICROBIANOS

bacteriana, inibindo sua sntese e provocando sua destruio. Como exemplo temos os antibiticos: penicilina, cefalosporina e vancomicina que atuam sobre as enzimas responsveis pela sntese da parede. A bactria pode adquirir resistncia produzindo enzimas (transferases e -lactamases), que alteram ou degradam drogas, por inibio da permeabilidade da membrana plasmtica e pelo efluxo de drogas - bombeamento de drogas para fora da clula.

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2. Bacteriostticos: Atuam sobre o material gentico bacteriano (cromossomo e plasmdeos) bloqueando a replicao do DNA e a transcrio. Atuam tambm sobre os ribossomos, RNA mensageiro e transportador bloqueando a sntese de protenas. Dessa forma, as bactrias ficam estticas e morrem. Como exemplo temos a tetraciclina, o cloranfenicol e os novssimos zyvox e synercidi. Os antibiticos so produtos de enorme importncia no apenas na rea de sade, como tambm na economia, visto que apenas nos Estados Unidos, cerca de 100.000 toneladas so produzidas anualmente. Embora aproximadamente 8000 substncias com atividade antimicrobiana sejam conhecidas e, a cada ano, centenas de novas substncias sejam descobertas, pouqussimas so efetivamente aproveitadas e utilizadas como agentes antimicrobianos, visto que muitas destas no atendem aos requisitos mnimos para seu emprego teraputico. Paralelamente, no podemos deixar de mencionar o crescente problema em relao ao surgimento de espcies bacterianas resistentes aos diferentes antibiticos. Este talvez corresponda ao principal desafio de pesquisadores, visto que a multirresistncia vem se disseminando nas populaes microbianas, sejam patognicas ou no.

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5. CARACTERSTICAS GERAIS DAS DROGAS ANTIMICROBIANAS Toxicidade Seletiva: caracterstica que todo antimicrobiano deveria apresentar, pois se reflete na capacidade de atuar seletivamente sobre o microrganismo, sem provocar danos ao hospedeiro. Esta expressa em termos do ndice teraputico: relao Bactria/ Antibitico, onde: A) Dose teraputica: concentrao para tratamento. B) Dose txica: concentrao a partir da qual txica. Droga que atuam sobre funes microbianas inexistentes em eucariontes geralmente tem maior toxicidade seletiva e ndice teraputico (Penicilina). Espectro de ao: Refere-se diversidade de organismos afetados pelo agente. Geralmente os antimicrobianos so de pequeno ou de amplo espectro. Atualmente, uma srie de laboratrios vem trabalhando em busca de isolar e purificar antimicrobianos de espectro restrito, que atuam especificamente sobre um ou um pequeno nmero de microrganismos. No entanto, atualmente os antibiticos comercializados enquadram-se nas categorias de pequeno e amplo espectro de ao (Figura 1).

Fig. 1: Exemplos de diferentes drogas antimicrobianas, classificadas de acordo com o espectro de ao. (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

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Quanto sntese: Microbiana, qumica ou semi-sinttica. A) Microbiana - geralmente por uma ou poucas bactrias (actinomicetos) e vrios tipos de fungos filamentosos. Geralmente correspondem a produtos do metabolismo secundrio. B) Qumica - Sulfonamidas, Trimethoprim, Cloranfenicol, Isoniazida alm de outros antivirais e antiprotozorios. C) Semi-sintticos - so antibiticos naturais, modificados pela adio de grupamentos qumicos, tornando-os menos suscetveis microrganismos (ampicilina, carbencilina, meticilina). Quanto ao: Bacteriostticos ou Bactericidas Os bactericidas podem ser bacteriostticos dependendo da concentrao, ou do tipo de organismo. Os bacteriostticos tm sua ao vinculada resistncia do hospedeiro. CMI (Concentrao Mnima Inibitria): A droga bactericida geralmente elimina o agente em concentraes de 2 a 4 vezes maior que a bacteriosttica, sendo o inverso falso. Dois parmetros indicam a eficincia da droga. a) Atingir concentraes efetivas nos tecidos e entrar em contato com o microrganismo. b) No alterar os mecanismos naturais de defesa do hospedeiro. inativao pelos

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6. MECANISMOS DE AO

DOS ANTIMICROBIANOS

Vrios so os possveis alvos para os agentes antimicrobianos. O conhecimento dos mecanismos de ao destes agentes permite entender sua natureza e o grau de toxicidade seletiva de cada droga (Figura 2).

Fig. 2: Principais estruturas ou etapas metablicas afetadas por antibiticos. (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

1) Inibio da sntese da Parede Celular: estes agentes antimicrobianos correspondem aos mais seletivos, apresentando um elevado ndice teraputico. Penicilinas, Ampicilina e Cefalosporinas: contm em sua estrutura um anel lactmico, que interage com protenas denominadas PBPs (Penicillin Binding Protein ou Protenas Ligadoras de Penicilina), inibindo a enzima envolvida na transpeptidao, responsvel pela ligao entre as cadeias de tetrapeptdeos do peptidioglicano (Figura 3). Com isso, h o impedimento da formao das ligaes entre os tetrapeptdeos de cadeias adjacentes de peptideoglicano, ocasionando uma perda na rigidez da parede celular. Acredita-se tambm que tais drogas podem atuar

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promovendo a ativao de enzimas autolticas, resultando na degradao da parede.

Fig.3: Mecanismo de ao dos antibiticos -lactmicos (Adaptado de Atlas, R.M., Principles of Microbiology, 1997)

Bacitracina: Interfere com a ao do carreador lipdico que transporta os precursores da parede pela membrana. Resulta na no formao das ligaes entre o NAM e NAG. Vancomicina: liga-se diretamente poro tetrapeptdica do peptideoglicano. ainda a droga de escolha para linhagens resistentes de S. aureus. 2) Ligao Membrana Citoplasmtica: so agentes antimicrobianos que muitas vezes exibem menor grau de toxicidade seletiva. Polimixinas: Ligam-se membrana, entre os fosfolipdeos, alterando sua permeabilidade (detergentes). So extremamente eficientes contra Gram negativos, pois afetam tanto a membrana citoplasmtica como a membrana externa. Ionforos: Molculas hidrofbicas que se misturam na membrana citoplasmtica, permitindo a difuso passiva de compostos ionizados para dentro ou fora da clula (Figura 4).

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Fig.4: Exemplo de um antibitico que atua como ionforo (Adaptado de Atlas, R.M., Principles of Microbiology, 1997).

3)

Inibio

da

sntese

de

cidos

nuclicos:

seletividade

varivel.

Novobiocina: se liga a DNA girase, afetando o desenovelamento do DNA, impedindo sua replicao. Quinolonas: Inibem a DNA girase, afetando a replicao, transcrio e reparo. Rifampicina: Ligao RNA polimerase DNA-dependente, bloqueando a transcrio. 4) Inibio da traduo: So geralmente bastante seletivos. Correspondem a um dos principais grupos de agentes antimicrobianos, uma vez que a sntese protica corresponde a processo altamente complexo, envolvendo vrias etapas e diversas molculas e estruturas (Figura 5).

Fig.5: Diferentes etapas da traduo que podem ser afetadas por agentes antimicrobianos (Adaptado de Atlas, R.M., Principles of Microbiology, 1997).

Estreptomicina e Gentamicina: Liga-se subunidade ribossomal 30S, bloqueando-a e promovendo erros na leitura do mRNA. Interferem com a formao do complexo de iniciao. Tetraciclina: Liga-se subunidade ribossomal 30S (stio A), impedindo a ligao do aminoacil-tRNA. Cloranfenicol: Liga-se subunidade ribossomal 50S e inibe a ligao do tRNA e da peptidiltransferase, inibindo a elongao. Eritromicina: Liga-se subunidade ribossomal 50S e inibe a elongao.

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Fig.6: Exemplos de drogas que interferem com a sntese protica (Adaptado de Atlas, R.M., Principles of Microbiology, 1997).

5) Antagonismo metablico: geralmente ocorre por um mecanismo de inibio competitiva. Sulfas e derivados: inibio da sntese do cido flico, pela competio com o PABA (Figura 7). Trimethoprim: bloqueio da sntese do tetrahidrofolato, inibindo a dihidrofolato redutase.

Fig.7: Similaridade estrutural entre a sulfanilamida e o PABA (importante precursor da sntese de purinas) (Adaptado de Atlas, R.M., Principles of Microbiology, 1997).

Isoniazida: afeta o metabolismo do NAD ou piridoxal, inibe a sntese do cido miclico - "fator corda".

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7. RESISTNCIA BACTERIANA Este tema tornou-se um motivo de preocupao crescente entre os profissionais da rea de sade, pois a cada ano observamos o aumento de linhagens resistentes aos mais diversos agentes antimicrobianos. As bactrias surgiram na terra h cerca de 3,5 bilhes de anos, em ambientes hostis: temperaturas altssimas, radiaes ultravioleta e csmicas, tempestades e falta de nutrientes. Elas superaram tudo e evoluram para ocupar hoje todos os habitats, at aqueles de condies mais extremas. Sua grande capacidade de adaptao est associada estrutura genmica, que garante a troca de genes entre as bactrias, usando para isso elementos no cromossmicos: plasmdios, transposons e at bacterifagos. Estes ltimos destroem as bactrias hospedeiras, mas podem carregar e espalhar genes bacterianos. A causa primria a mutao espontnea e a recombinao dos genes (reproduo), que criam variabilidade gentica sobre a qual atua a seleo natural, dando vantagens aos mais aptos. As drogas atuam como agentes seletivos, favorecendo as raras bactrias resistentes presentes na populao. O uso abusivo dos antimicrobianos contribui para aumentar a presso seletiva dessas drogas, criando ambiente muito favorvel s bactrias resistentes. A resistncia aos antimicrobianos pode ser de dois tipos: Natural ou Intrnseca: ausncia da estrutura, ou via metablica alvo. uma caracterstica natural de determinados grupos de bactrias, sendo espcie ou gnero especfica e delimita o espectro de atividade dos antimicrobianos. A resistncia intrnseca pode muitas vezes ser utilizada para confirmar a correta identificao de uma bactria, alm de servir como marcador no monitoramento de procedimentos padronizados. Adquirida: Atravs de mutaes espontneas e seleo, ou por recombinao aps transferncia de genes. Dentre os principais mecanismos de resistncia podemos citar: Mutao: Cromossmicas, a emergncia da resistncia ocorre medida que as bactrias se replicam. Durante o processo de replicao podem ocorrer erros que modifica a seqncia de codificao do DNA e conseqentemente, alterao da

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informao contida no DNA original, produzindo clulas com uma mutao especfica que ser transferida a futuras geraes. Algumas mutaes so benficas para a bactria como resistir ao de um antibitico, oferecendo uma vantagem competitiva em seu ambiente e as mutaes so consideradas a forma menos freqente de resistncia extrnseca. Como a resistncia cromossmica depende de mutao espontnea, evento raro, ela dirigida quase sempre a uma s droga e os genes so transferidos com freqncia relativamente baixa. Por isso, seu impacto clnico menor que o da resistncia plasmidial. Transferncia de DNA: A Transferncia pode ocorrer por: a) Conjugao: a transferncia dos genes de resistncia atravs de plasmdios, havendo necessariamente, contato entre as clulas bacterianas (Figura 8).

Fig.8: Esquema de conjugao bacteriana

Alm do DNA cromossmico, as clulas bacterianas podem conter pequenas molculas circulares de DNA denominadas plasmdios. Certos plasmdios possuem genes responsveis pela sntese de enzimas que destroem um antibitico antes que ele destrua a bactria. So os chamados plasmdios R (de resistncia aos antibiticos). Eles tambm possuem genes que permitem sua passagem de uma bactria para outra (fator F) (Figura 8). Quando dois ou mais tipos de plasmdios R esto presentes em uma mesma bactria, os genes de um deles podem passar para outro por recombinao gnica:

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conjugao, transformao e transduo. Esse mecanismo faz com que surjam plasmdios R portadores de diversos genes para resistncia a diferentes antibiticos. Os plasmdios podem estar integrados no cromossomo, sendo capazes de transferir genes cromossmicos. Muitos so promscuos, isto , passam o gene de resistncia para espcies no aparentadas geneticamente. b) Transduo: A transferncia dos genes de resistncia realizada por intermdio de um vrus (Figura 9).

Fig.9: Transduo partir de um bacterifago (vrus).

c) Transformao: Transferncia dos genes de resistncia da clula doadora para a receptora sem contato entre as clulas d) Transposio: Genes determinantes de resistncia podem transferir-se de um plasmdeos a outro, para o cromossomo ou para um bacterifago. O elemento responsvel pela transferncia o transposon. Descobriu-se em 1974 que grande parte dos genes de resistncia considerados plasmidiais ou cromossmicos esto localizados sobre transposons e apresentam as propriedades destes: disseminao rpida dentro da clula ou entre clula.

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Os transposons so segmentos de DNA com grande mobilidade, eles codificam a enzima transposase responsvel por sua transferncia para outros segmentos de DNA. Eles so promscuos: criam as variaes invadindo diversos stios do DNA hospedeiro, mas s vezes exageram, produzindo mutaes letais (Figura 10).
Fig.10: Figura esquemtica da transposio de genes

Impermeabilidade droga: Muitas bactrias Gram negativas so resistentes penicilina G por serem impermeveis droga, ou por apresentarem alteraes em protenas de ligao penicilina. No caso das sulfonamidas, o microrganismo pode tambm apresentar uma menor permeabilidade droga. Inativao: Muitas drogas so inativadas por enzimas codificadas pelos microrganismos. Por exemplo, a penicilinase (-lactamases) uma enzima que cliva o anel -lactmico inativando a droga. Outras drogas podem ser inativadas em decorrncia de modificaes introduzidas pelo microrganismo, tais como a adio de grupamentos qumicos. Assim, muitos microrganismos so capazes de promover a fosforilao ou acetilao de antibiticos. Alterao do stio de ligao do Antibitico (alvo): Os antibiticos ligam-se a stios especficos na bactria. Se esse stio for alterado, o antibitico no pode efetivar a ligao e torna-se ineficiente contra o microorganismo. Essa alterao fsico-qumica, diminui a atividade da droga pelo stio e faz com que haja perda da atividade antimicrobiana. Exemplos: Staphylococcus aureus resistente a meticilina. Streptococcus pneumoniae resistente penicilina.

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Bombeamento para o meio externo - Efluxo da droga: a propriedade de expulsar ativamente os antibiticos para fora da clula, contribuindo para uma concentrao inadequada da droga e conseqentemente, ao no efetiva. Exemplo: No caso da resistncia as tetraciclinas, em bactrias entricas. Biofilmes: Mais recentemente, outro aspecto que vem sendo cada vez mais levado em considerao refere-se ocorrncia dos biofilmes e sua importncia na teraputica antimicrobiana, pois o conhecimento sobre a ocorrncia de biofilmes microbianos em nosso organismo levou a uma quebra do paradigma de tratamento das doenas infecciosas. Certamente, para que os antibiticos possam ser empregados de forma mais eficaz, ser necessrio um maior conhecimento acerca dos biofilmes formados naturalmente em nosso organismo. Pois, somente a partir da elucidao da ecologia dos biofilmes naturais do homem, teremos maiores chances de tratar de forma adequada s vrias doenas infecciosas.

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INATIVAO ENZIMTICA DE ANTIBITICOS 8.1. O QUE SO -LACTAMASES? Segundo a definio do Nomenclature Comitte of the Internacional Union of Biochemistry, so enzimas que catalizam a hidrolise de amidos, amidinas e outras Ligaes CN (Carbono Nitrognio), separando a base do substrato. Com o avano das metodologias moleculares, se conhecem mais de 260 tipos de -lactamases e novas enzimas so descritas com freqncia. Essas enzimas podem ser produzidas por diferentes espcies com caractersticas distintas. Nas bactrias Gram-positivas essas enzimas so secretadas para o meio extra celular, apresentando uma atividade menor quando comparada as -lactamases produzidas pelas bactrias Gram-negativas que se situam no meio periplasmtico. Essa localizao facilita e favorece uma maior concentrao, com ao mais eficaz, ante aos antimicrobianos que precisam atravessar esse espao para atingir seus alvos (PBPs).

CLASSIFICAO DAS -LACTAMASES Em 1989 foi proposta uma classificao, por Bush , cujo agrupamento inclui enzimas -lactamases de todos os grupos bacterianos e que correlaciona substratos e propriedades de inibio, integrando caractersticas funcionais. Quatro grupos so definidos de acordo com o substrato e os perfis de inibio: Grupo 1: - lactamases que no so inibidas pelo cido Clavulnico. Grupo 2: -lactamases de amplo espectro, geralmente inibidas pelo Acido Clavulnico. Grupo 3: Metalo--lactamases que atuam sobre penicilina, cefalosporinas e carbapenmicos; no inibidas pelo cido Clavulnico e inibidas pelo EDTA. Grupo 4: - lactamases que so inibidas pelo cido Clavulnico.

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CODIFICAO DAS - LACTAMASES O cromossomo bacteriano contm todos os genes essenciais para a viabilidade da clula e nico, fechado e circular. Muitas bactrias tambm contm informaes em pequenos fragmentos de DNA extra-cromossomial denominada plasmdios. O numero de plasmdios pode variar por clula e esto localizados no citoplasma e podem ser replicados e incorporados no cromossomo da clula-filha passando de uma espcie a outra. Outro elemento gentico importante na resistncia bacteriana o transposon (fragmentos de DNA mveis), que podem carregar informaes sobre a resistncia bacteriana e esto localizados nos plasmdios ou nos cromossomos. A codificao da enzima -lactamase pode estar no DNA cromossomial ou extra-cromossomial (plasmdeos e transposons). ORIGEM DA NOMENCLATURA DAS -LACTAMASES O nome das - lactamases tem relao de como e onde foi descoberta. A lactamase TEM deriva de Temoniera, uma jovem paciente grega da qual foi isolado o primeiro microorganismo com essa caracterstica. Essa enzima ficou conhecida como TEM-1, e as enzimas subseqentes descritas com estas caractersticas foram incorporando diferentes nmeros. O nome da -lactamase SHV deriva de uma propriedade bioqumica dessa mesma enzima TEM, porm com varivel sulfidrila (SulpHydryl Variable) e tambm passou a incorporar nmeros para distinguir caractersticas menores. Algumas enzimas foram nomeadas segundo a preferncia de substratos ou espectro de ao. Ao longo dos anos, essa diversidade de nomenclaturas contribui para uma falta de sistematizao na compreenso e nos estudos dessas enzimas (OXA, PSE, IMP, CTX etc.).

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CODIFICAO GENTICA DA ENZIMA -LACTAMASE De um modo geral, as -lactamases plasmideo-mediadas so diferente sas cromossmicas, mas existem ambigidades. Por exemplo, a -lactamase SVH-1, comumente um tipo plasmdeos mediada, tambm pode se apresentar como lactamase cromossmica da Klebsiela pneumoniae. A expresso da enzima pode ser: a) Constituitiva: a produo enzimtica independente de um agente indutor. b) Indzivel: a produo enzimtica se manifestar quando a bactria for exposta ao agente indutor (-lactmico). O potencial de induo varia entre os diferentes agentes. Algumas espcies produzem -lactamases cromossmicas por via constituitiva ou de forma indzivel e outras so plasmideo-mediadas. LACTAMASES DE ESPECTRO AMPLIADO ESBL So enzimas mediadas por genes plasmidiais, no indzivel, capazes de hidrolisar a cadeia Oximino--lactmica presente na estrutura qumica da droga, o que faz com que seu espectro de ao se estenda aos -lactmicos de amplo espectro como as cefalosporinas de 3a gerao (Ceftazidima, Cefotaxima e Ceftriaxona) e monobactmicos (Aztreonam), mas no conferem resistncia as Cefamicinas (Cefoxitina e Cefotetam) e carbapenmicos (Imipenem e Meropenem). A produo de ESBL ocorre predominantemente em Klebsiela spp. em menor grau na Escherichia coli, mas pode ser encontrada em vrios patgenos clinicamente importantes e um problema significativo no tratamento de infeces graves por esses agentes. Microorganismos como Proteus mirailis, Citrobacter diversus, Citrobacter freudii, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Serratia marcescens, Salmonella spp., Pseudomomas aeruginosa, Sthenotrophomonas maltophilia, Acinetobacter baumani j foram descritos como produtores de ESBL. Diferentes ESBLs variam em relao a eficincia cintica e o grau de resistncia in vitro aos diferentes compostos

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SIGNIFICADO CLNICO DAS ESBLS A emergncia dos microorganismos produtores de ESBL tem grande importncia clnica e algumas implicaes teraputicas: Esse mecanismo de resistncia mediado por plasmdios facilitando a A extenso do espectro de resistncia para cefalosporina de espectro transmisso horizontal (bactria - bactria); ampliado (3 e 4 gerao) impe limites para a utilizao de drogas da classe dos - lactmicos, podendo aumentar a prescrio de drogas de amplo espectro como os carbapenmicos ; O TSA tradicional pode no revelar as cepas produtoras de ESBL e determinar a liberao de falsas resistncias principalmente relacionadas as cefalosporinas de 3 e 4 gerao; A seleo dos antibiticos para o tratamento e infeces graves por cepas As ESBLs diferem-se entre si (mesma famlia) por substituies na seqncia de aminocidos (de 1 a 7), os quais alteram configuraes e propriedades do seu stio ativo. As substituies mais importantes so as mutaes que conferem amplo espectro a estas enzimas (Ex.: Posio 164 de Ambler nas TEMs, 179 nas SHVs e 238 em ambas), que ampliam seu stio ativo, o qual produz espao suficiente para interao entre a enzima e os antibiticos - lactmicos de amplo espectro portadores de grandes cadeias Oxiamino-; como resultado, esta modificao faz com que estas enzimas sejam capazes de hidrolisar antibiticos lactmicos como a: Ceftazidima, Cefotaxima, Cefuroxima e Aztreonam. Em contraste como suas parentes prximas (TEM-1, TEM-2 e SHV-1), que reconhecem os antibiticos lactmicos de amplo espectro como substrato, muito fracamente. ESBL um desafio devido complexidade do TSA in vitro e a correlao in vivo.

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OPES TERAPUTICAS Existe a possibilidade de tratamento com cefamicinas, como a cefoxitina, cefotetan e moxalactam, que so geralmente efetivos contra as Enterobactrias produtoras de ESBLs (TEM, SHV e CTX-M). Porm, com terapias prolongadas a Klebsiella pneumoniae, pode adquirir resistncia as cefamicinas. Os aminoglicosdeos tambm podem ser utilizados se a cepa estudada for suceptvel. Porm, devido aos genes que condificam as ESBL, serem transmitidos via plasmdios, existe a possibilidade de transmisso cepa-a-cepa, fator que pode levar rapidamente a transmisso de resistncia a esta classe de frmaco. J que a maioria dos microorganimos produtores de ESBLs serem tambm resistentes aos aminoglicosdeos, principalmente a gentamicina. A utilizao de -lactmicos em associao com inibidores de -lactamases, inicialmente, foi considerado o tratamento de escolha, embora no se demorou muito para verificar-se sua ineficcia in vivo. Inicialmente, foi verificado que estes frmacos esto tambm sujeitos ao aumento da concentrao inibitria mnima (CIM), com o aumento do inculo bacteriano, alm disso, pode haver perda de porinas na membrana externa bacteriana, o que leva tambm reduo na atividade inibitria destes frmacos. Alm do mais, verificou-se que o sulbactam e o tazobactam no possuem bons efeitos contra ESBLs codificadas pelos genes SHV. Outra opo seria a utilizao de fluoroquinolonas, j que inicialmente achava-se que a sua resistncia era somente codificada por via cromossomal. Novamente, esbarrou-se na caracterstica da maioria das bactrias produtoras de ESBLs, possuir este cromossomo. Alm do mais, alguns estudos vm demonstrando que esta resistncia tambm pode ser transferida via plasmdios. As cefalosporinas de 4 gerao demonstram alta capacidade de destruir estes microorganismos in vitro. Relatos demonstram nveis como 95-100% de atividade contra este tipo de microorganismo. Embora estes frmacos demonstrem o mesmo problema apresentado pelas outras cefalosporinas (aumento da CIM, conforme aumento de inculo). Um exemplo deste efeito pode ser visualizado em modelos de infeco em ratos. Atualmente, o cefepime no considerado frmaco de primeira escolha para infeces causadas por microorganismos produtores de ESBLs. Mesmo quando em combinao com a

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amicacina ou outro aminoglicosdeo, pois este uso ainda necessita de mais estudos clnicos antes de ser recomendado como tratamento de escolha. Finalmente, temos os carbepenens (Imipenem, Meropenem) que possuem ao uniforme contra este tipo de microorganismo, seja in vitro ou in vivo. Alm disso, os carbepenens so altamente estveis atividade hidroltica das ESBLs, sem contar sua tima penetrao atravs da membrana externa, principalmente devido a seu peso molecular compacto e sua forma estrutural muito peculiar. Mecanismos de resistncia a estes frmacos j vem sendo detectados, tais como perda de protenas na membrana externa; resistncias especficas contra ESBLs codificadas por TEM, SHV e AmpC foram descritas como resultado da perda de porinas. A aquisio de carbepenases, enzimas capazes de degradar os carbepens, tambm vm sendo descritas por inmeros centros de pesquisa distribudos pelo mundo. 8.2. METALLO--LACTAMASES As MLs so produzidas intrinsecamente por determinados microrganismos, como Stenotrophomonas maltophilia, Bacillus cereus, Chryseobacterium meningosepticum, Chryseobacterium indologenes, Legionella gormanii, Caulobacter crescentus e Aeromonas, spp.. Contudo, desde o incio da dcada de 1990, novos genes que codificam MLs tm sido descritos em patgenos clinicamente importantes, como Pseudomonas spp., Acinetobacter spp. e membros da famlia Enterobacteriaceae. Estes novos genes que codificam as MLs foram encontrados inseridos em estruturas genticas que fornecem mobilidade ao gene, fazendo com que essas enzimas passassem a ser conhecidas como MLs mveis ou MLs adquiridas. Atualmente so conhecidas cinco subclasses de ML adquiridas: IMP (imipenemase), VIM (Verona imipenemase, SPM (So Paulo metalo--lactamase), GIM (German imipenemase) e, mais recentemente, SIM-1, codificada pelo gene blaSIM-1 detectado em sete cepas de Acinetobacter baumannii isolados de um hospital tercirio em Seul, Coria. O primeiro relato de ML adquirida ocorreu em 1994, quando foi descrita uma nova subclasse denominada IMP-1. Essa enzima foi detectada em uma cepa

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clnica de Serratia marcescens isolada no Japo, a qual apresentava fentipo de resistncia a imipenem e cefalosporinas de espectro ampliado. Durante muitos anos a ocorrncia de isolados produtores de IMP-1 foi restrita a esse pas, entretanto, atualmente, a IMP-1 tem sido detectada em diferentes microrganismos, como Acinetobacter spp., Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae isolados de diferentes regies geogrficas. As variantes pertencentes subclasse IMP parecem ser mais prevalentes na sia, sendo comumente encontradas em bacilos Gramnegativos no-fermentadores (BGNNF), Achromobacter xylosoxidans, Pseudomonas spp. e Acinectobacter spp. No entanto, j houve relatos da produo dessas enzimas por microrganismos pertencentes famlia Enterobacteriaceae. O primeiro relato de uma ML no continente americano ocorreu em 2002 por Gibb. Os autores descreveram a deteco de uma cepa de Pseudomonas aeruginosa num hospital canadense que apresentava alto grau de resistncia a ceftazidima e carbepenens. Anlises posteriores revelaram a presena de uma nova enzima, denominada IMP-7. Em 1999, a segunda subclasse de ML adquirida descrita foi denominada VIM-1. A presena dessa enzima foi observada numa amostra de P. aeruginosa isolada em Verona, Itlia. As enzimas pertencentes a essa subclasse apresentam menor nmero de variantes atualmente descritas, bem como distribuio concentrada em determinadas regies geogrficas, quando comparadas s pertencentes subclasse IMP. As variantes de VIM foram encontradas tanto em microrganismos fermentadores de glicose quanto nos no-fermentadores. Essas enzimas so mais prevalentes na Europa, regio onde foi originariamente encontrada em 1999. Posteriormente houve diversos relatos dessas enzimas em microrganismos isolados em pases da Comunidade Europia. No entanto, variantes de VIM tambm foram relatadas na sia e, mais recentemente, nos EUA, no Chile e na Venezuela. A SPM-1, terceira subclasse de ML adquirida, foi identificada em amostra de P. aeruginosa 48-1997 recuperada do trato urinrio de um paciente hospitalizado no complexo Hospital So Paulo, da Universidade Federal de So Paulo (UNIFESP). Essa amostra bacteriana foi enviada ao programa SENTRY, que, em parceria com o laboratrio Bistrol Center for Antimicrobial Research and Evaluation (BCARE), da Universidade de resistncia. de O Bristol, gene Inglaterra, que caracterizou SPM-1 esse novo estar determinante codifica parece

especificamente relacionado espcie P. aeruginosa, uma vez que, at ento, no

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foi detectado em demais microrganismos nosocomiais. Posteriormente, a mesma parceria avaliou cinco cepas de P. aeruginosa provenientes de Dusseldorf, Alemanha, encontrando uma nova e quarta subclasse de ML adquirida, denominada GIM-1.

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8. BIOFILMES COMUNIDADE INVISVEL Os biofilmes so complexos ecossistemas microbianos, podem ser formados por populaes desenvolvidas a partir de uma nica, ou de mltiplas espcies, podendo ser encontrados em uma variedade de superfcies biticas e/ou abiticas. Desta maneira, muitos autores definem biofilmes como associaes de microrganismos e de seus produtos extracelulares, que se encontram aderidos a superfcies biticas ou abiticas. Geralmente, a dinmica de formao de um biofilme ocorre em etapas distintas. Inicialmente temos os organismos denominados colonizadores primrios, que se aderem a uma superfcie, geralmente contendo protenas ou outros compostos orgnicos. As clulas aderidas passam a se desenvolver, originando micro colnias que sintetizam uma matriz exopolissacardica (EPS), que passam a atuar como substrato para a aderncia de microrganismos colonizadores secundrios. Estes colonizadores secundrios podem se aderir diretamente aos primrios, ou promoverem a formao de co-agregados com outros microorganismos e ento se aderirem aos primrios.

Fig.11: Desenvolvimento de um biofilme. (a) Colonizao primria de um substrato; (b) crescimento, diviso celular e produo do exopolissacardeo (EPS), com o desenvolvimento de micro-colnias; (c) co-adeso de clulas individuais, de clulas co-agregadas e grupos de clulas idnticas, originando um biofilme jovem, de mltiplas espcies; (d) maturao e formao de mosaicos clonais no biofilme maduro. (Adaptado de Rickard et al., Trends Microbiol., 11:94-100, 2003)

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O biofilme corresponde a uma entidade dinmica, pois de acordo com os microorganismos que o compem haver caractersticas fsicas, qumicas e biolgicas distintas. Estas alteraes fazem com que cada biofilme seja nico, de acordo com os microrganismos presentes. Neste sentido, ao longo do tempo a composio microbiana dos biofilmes normalmente sofre alteraes significativas. A figura abaixo ilustra no somente a estruturao fisico-qumica de um biofilme, mas tambm sua evoluo e amadurecimento, dependendo das relaes estabelecidas pelos microrganismos presentes.

PAPEL DOS BIOFILMES NAS INFECES At o momento, a vasta maioria das doenas infecciosas vem sendo tratada eficientemente com antibiticos, entretanto, de acordo com as pesquisas mais recentes, sabemos que tal tipo de estratgia pode ser ineficaz em duas situaes: 1) Com organismos exibindo resistncia inata droga; 2) Em bactrias presentes em biofilmes. Em um biofilme, as bactrias podem ser 1000 vezes mais resistentes a um antibitico, quando comparadas s mesmas clulas platnicas, embora os mecanismos envolvidos nesta resistncia sejam ainda pouco conhecidos. Dentre os possveis mecanismos, acredita-se que possa haver a inativao da droga por polmeros ou enzimas extracelulares, ou a ineficincia da droga em decorrncia de taxas de crescimento muito lentas no interior dos biofilmes. Infeces associadas biofilmes geralmente so de natureza recorrente, visto que as terapias antimicrobianas convencionais eliminam predominantemente as formas platnicas, deixando as clulas sensveis livres para se reproduzir e propagar no biofilme aps o tratamento. Para tornar o quadro ainda mais grave, as bactrias presentes nos biofilmes encontram-se mais protegidas contra o sistema imune do hospedeiro. Exemplos tpicos de doenas associadas a biofilmes incluem as infeces de implantes tais como vlvulas cardacas, cateteres, lentes de contato, entre outros objetos. Os biofilmes podem ainda promover doenas se formados em tecidos, tais como nas infeces pulmonares provocadas por Pseudomonas aeruginosa, em pacientes com fibrose cstica, que so suscetveis a infeces crnicas por esta bactria.

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10.

CONCLUSO A resistncia bacteriana um dos maiores desafios do Controle de

Infeces em Servios de Sade. A emergncia da resistncia o sinal mais evidente de que no est sendo levada a srio, ameaa das doenas infecciosas, minando a possibilidade de tratamento. A utilizao deve ser criteriosa quanto ao uso de antibiticos e laboratrio de microbiologia deve ser o suporte fundamental para importantes aes de controle. Em um artigo publicado na Inglaterra, em 1998, o autor mostra dados relativos ao uso de antibiticos no mundo. Mostra que de todas as drogas utilizadas, 50% se destinam a uso humano e 50% ao agroveterinrio. Da frao de drogas usada em humanos, 20% so em hospitais e 80% comunittria. Desse montante, calcula-se que de 20% a 50% no haja necessidade de uso. Para o uso veterinrio, os dados so mais alarmantes, 20% so usados terapeuticamente e at 80% para uso profiltico e promoo de crescimento. O uso indiscriminado, irresponsvel e ignorante de antibiticos, terapeutica ou profilaticamente, humano ou veterinrio, passando ainda pelo uso no crescimento animal e propsitos agrcolas, tem favorecido a essa presso seletiva, mostrando como resultado a seleo e predominncia de espcies cada vez mais resistentes. O uso descontrolado de antimicrobianos sem dvida foi o que nos levou at a atual situao e selecionou microrganismos altamente resistentes. Por tudo isso, parece ser esse o caminho da volta, ou seja, um controle mais rgido no uso de drogas, desde sua venda em farmcias, passando por um maior controle e conscientizao no uso agropecurio e, finalmente, usado de forma mais racional e prudente em clnica. A rea multiprofissional da sade tem de ser informada e conscientizada do real e grande problema que isso significa. O uso hospitalar tem de ser altamente controlado, pois nesse ambiente que se criam com maior freqncia os exemplares multirresistentes. Os clnicos devem respeitar as decises e deliberaes das comisses que padronizam o uso de drogas no hospital, pois elas so escolhidas com base na microbiota local e no padro de sensibilidade dos microrganismos mais encontrados. Portanto, o controle no uso de antibiticos e combate resistncia bacteriana tem de estar alicerado em dois pontos fundamentais: educao e comunicao. Todos

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os profissionais de sade devem estar juntos nesta luta, cada qual exercendo seu papel, se informando e policiando-se cada vez mais.

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11. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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Normas

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Desempenho

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