1.

Introduccin

TECNICAS PARA AISLAR MOLECULAS

La mayor parte de las investigaciones bioqumicas requieren la purificacin, al menos parcial, de las sustancias objeto de estudio. Esto requiere generalmente un gran esfuerzo ya que una clula contiene miles de sustancias diferentes, la molcula que buscamos puede ser extremamente inestable o encontrarse a concentraciones muy bajas. En este tema se presenta una visin general de las tcnicas ms usuales empleadas para la purificacin de protenas, aunque muchas de ellas son aplicables a la separacin de la mayora de las molculas biolgicas. El conocimiento del proteoma, conjunto de protenas de un organismo, ha pasado a ser el reto de la comunidad cientfica y de las empresas biotecnolgicas, una vez que ya se ha completado la secuenciacin del genoma de varios organismos incluyendo el genoma humano. El conocimiento de las secuencias de DNA que integran nuestros genes no tiene un gran valor, si no se identifica cual es la funcin de dichos genes, en su caso, para que protenas codifican. El programa proteoma busca la caracterizacin de todas las protenas de la clula humana, identificando su secuencia de aminocidos. Cuando se obtenga toda la secuencia de aminocidos del proteoma humano se podr relacionar mediante potentes programas informticos la secuencia de aminocidos de una protena con el gen que la codifica. Los mtodos de secuenciacin tradicionales (basados en la degradacin de Edman) son demasiado lentos para abordar esta ingente tarea, la secuenciacin de los pptidos debe hacerse por espectometra de masas. Naturalmente las tcnicas de purificacin y aislamiento de protenas son esenciales para abordar toda esta tarea. 2. Mtodos de rotura celular y extraccin de protenas El primer paso en el aislamiento de una protena es la rotura celular, para posteriormente poder extraer la protena con un tampn adecuado. El mtodo de rotura a elegir depende de las caractersticas mecnicas del tejido o clulas de donde se va a aislar la protena, as como de su localizacin. Entre los distintos mtodos ellos estn: Lisis celular. Vlido para clulas sin pared celular como las clulas de tejidos animales, pero no es suficiente para clulas vegetales o bacterias. Consiste en suspender las clulas en una solucin hipotnica (ms diluida que el interior celular). Debido a la diferencia osmtica el agua difunde al interior de la clula, causando su hinchamiento y rotura. Destruccin mcanica. Entre estos mtodos se encuentran la homogenizacin (hacer pasar las clulas entre un tubo y un pistn de vidrio que ajustan casi totalmente); moler en un mortero con arena o almina; molino con perlas de vidrio, la prensa de French (que hace pasar las clulas a gran velocidad a travs de un pequeo orificio), la sonicacin (someter las clulas a vibraciones de ultrasonido Congelacin-descongelacin. La rotura se produce al someter las clulas a un cambio brusco de temperatura, congelando primero a -196 C (con nitrgeno lquido) y pasndolas rpidamente a temperatura ambiente (25 C).

Tras la rotura o bien, si se requiere, durante el proceso de rotura, se utilizan tampones de extraccin para solubilizar las protenas. Pueden utilizarse como tales disoluciones acuosas de tampones especficos para protenas solubles o bien que contengan adems detergentes si se pretende purificar protenas asociadas a membranas, si bien en este caso hay que cuidar que la enzima no se desnaturalice. Una vez que la protena se ha extrado de su entorno natural est expuesta a muchos agentes que pueden daarla. Los cambios bruscos de pH, cidos y bases fuertes, temperaturas extremas y la accin de las proteasas (enzimas que hidrolizan los enlaces peptdicos) son los principales factores que pueden desnaturalizar las protenas. Para evitar o minimizar estos factores la manipulacin de las protenas durante el proceso de purificacin suele llevarse a cabo en disoluciones tamponadas, a bajas temperaturas (4C) y se procura que el proceso sea lo ms corto posible, adems en ocasiones es necesarioaadir el tampn de extraccin agentes protectores de grupos funcionales especficos de la protena o bien inhibidores de proteasas. El resultado de todos estos tratamientos es un lisado u homogenado que contiene una mezcla de enzimas, membranas y clulas rotas. Esta preparacin se somete a centrifugacin (10.000 15.000 rpm) para eliminar los restos celulares y separar, el sobrenadante, que contiene las protenas solubles, del precipitado que adems de restos celulares tambin contienen protenas asociadas a membranas y que para solubilizarlas requiere un tratamiento adicional con detergentes. En cualquier caso, la fase soluble (con o sin detergente) constituye el extracto crudo donde se encuentra la protena de inters objeto de la purificacin. A la hora de centrifugar hay que tener en cuenta que la centrfuga sea refrigerada, balancear los tubos y asegurarse siempre que los rotores estn fijos. Para purificar una protena es imprescindible tener un mtodo para detectar cuantitativamente su presencia. Es deseable que este mtodo sea especfico y fcil de llevar a cabo. En este sentido es mucho ms cmodo trabajar con enzimas, pues se detectaran mediante su ensayo de actividad, en caso de purificar protenas no enzimticas, se requieren mtodos de seleccin ms especficos. 3. Mtodos cromatogrficos para separacin de protenas Las separaciones cromatogrficas se basan en las diferencias de carga, tamao o afinidad de las diferentes protenas. Uno de los mtodos ms habitualmente utilizados para la separacin de protenas es la cromatografa en columna, aunque tambin existe la cromatografa en papel y en placa. La columna est rellena con un material slido con las caractersticas qumicas adecuadas (fase estacionaria), y una solucin tamponada se hace pasar a travs de la columna (fase mvil). El extracto crudo se aplica en la parte superior de la columna y va poco a poco entrando en la columna con la fase mvil. Cada protena migrar a distinta velocidad segn su grado de afinidad por la fase estacionaria. Generalmente estas cromatografas se realizan de una forma semiautomtica, la fase mvil se hace pasar a la columna a travs de una bomba peristltica y un colector de fracciones va recogiendo el eluyente que sale de columna. Este colector hace que el tubo vaya cambiando cada cierto nmero de gotas o de volumen. Despus hay que localizar en que tubo o tubos est la protena que se pretende purificar. Existen distintos tipos de cromatografas en tres ellos:

Filtracin en gel o cromatografa de exclusin molecular. La fase estacionaria esta constituida por partculas de polmeros de diferente porosidad. La separacin se basa en el tamao de las partculas. Las protenas ms grandes que no pueden penetrar en los poros de las partculas de la matriz de filtracin son eluidas con ms rapidez que las protenas ms pequeas que penetran por los poros de las partculas y siguen un camino ms tortuoso y ms largo. El tamao de los poros internos depende de la naturaleza del polmero en cuestin, y permite la entrada a protenas por debajo de un determinado peso molecular Cromatografa de intercambio inico. En ella, la columna est rellena con un soporte al que van unidos grupos cargados positivamente (intercambio aninico) o negativamente (intercambio catinico). Estos grupos cargados normalmente estn neutralizados por iones del tampn. Estos iones son reversiblemente reemplazados por las protenas con ms tendencia a unirse al soporte. Las protenas cargadas pueden por lo tanto unirse a intercambiadores catinicos o aninicos dependiendo de su carga neta. Las protenas ms cargadas se unirn ms fuertemente al intercambiador y por lo tanto sern ms difciles de eluir. La afinidad con la que una protena se une a un intercambiador inico depende de la fuerza inica del medio, debido a la competencia entre los grupos cargados de la protena y los iones de la fase mvil. Una vez pegadas las protenas, para eluirlas retirarlas) de la columna, se suele ir subiendo la fuerza inica de la fase mvil (aumentando la concentracin de sal, NaCl), de esta forma se eluyen rimero las protenas mas dbilmente retenidas y cuando la fuerza inica sea mayor saldrn las protenas ms cargadas y por lo tanto ms retenidas. Cromatografa hidrofbica. Se trata de un mtodo similar al anterior con la nica diferencia de que la fase estacionaria es apolar (hidrofbica), es decir, la protena se pega al soporte por los resto de aminocidos apolares, cuanto ms residuos de esttipo tenga en su superficie, ms apolar ser, ms se retendr en la columna y se eluir ms tarde. En este caso a elusin se realiza aumentando la apolaridad de fase mvil. Cromatografa de afinidad. Muchas protenas tienen la capacidad de unirse especficamente a ciertas molculas, mediante uniones fuertes, pero no covalentes. En esta tcnica la molcula que se une especficamente a la protena se conoce con el nombre de ligando y se une covalentemente a una matriz inerte. Cuando el extracto con la mezcla de protenas se aplica a la columna, la protena buscada se unir al ligando inmovilizado mientras que las dems saldrn de la columna con el tampn. En este caso tambin se utiliza el incremento de fuerza inica para eluir las protenas.

Todos estos sistemas pueden automatizarse, en base a sistemas cromatogrficos tales como el FPLC, en el que se hace uso de bombas de alta presin (100-400 bares) y columnas con materiales que soportan altas presiones. Este sistema reduce notablemente los tiempos de purificacin y utilizan fases estacionarias con mayor poder de retencin, lo que se incrementa los porcentajes y rendimiento de las purificacione 4. Mtodos electroforticos Para comprobar si la protena de inters se ha separado del resto, es decir si la protena est pura, se requieren las tcnicas electroforticas. La electroforesis de protenas se lleva a cabo generalmente en geles de poliacrilamida. Se trata de geles

porosos, cuya porosidad se puede regular en funcin de la concentracin de acrilamida. Durante la electroforesis la fuerza que provoca la migracin de las protenas es un campo elctrico, y el gel acta como filtro molecular, ralentizando la migracin de las protenas en funcin de su relacin carga/masa. A diferencia de lo que ocurra en la cromatografa de filtracin, en las electroforesis las protenas mayores son retardadas y se mueven ms lentamente a travs del gel, ay que las va frenando el tamao del poro y las protenas ms pequeas avanzan ms rpidamente. En la figura vemos un tpico aparato de electroforesis. El gel se encuentra entre dos placas (normalmente de vidrio). La colocacin de un peine de electroforesis en la parte superior antes de que la acrilamida gelifique permite la formacin de unos pocillos, donde se colocarn posteriormente y una vez retirado el peine, las muestras, que se desplazarn por calles paralelas al aplicar el campo elctrico. Las muestras de protena se disuelven en una pequea cantidad de una solucin tampn, que contiene glicerol, que hace que la muestra se site en el fondo del pocillo y un colorante azul (azul de bromofenol) de pequeo peso molecular que nos indica migracin del frente. El tampn de electroforesis cierra el circuito entre el ctodo (+) y el nodo (-). El sistema se conecta a una fuente de alimentacin y las protenas migran hacia el polo positivo, situado en la base del gel. Despus el gel se saca del recipiente que lo contiene y se incuba en presencia del colorante adecuado (azul de Coomassie), que tie por completo el gel. A continuacin se destie con una disolucin de etanol/actico y el gel queda transparente y las bandas de protenas quedan teidas de color azul. Existen dos tipos principales de electroforesis, en condiciones Nativas las protenas se separan en funcin de su carga/masa; y en condiciones desnaturalizantes la electroforesis se realiza en presencia de un detergente, el SDS (dodecil sulfato sdico). El SDS es un detergente aninico, que se une a todas las protenas en la misma proporcin formando una especie de micela cargada negativamente. La gran carga negativa del SDS enmascara la carga intrnseca de las protenas, con lo que stas se separan solo en funcin de su masa e independientemente de su carga. El nico inconveniente de esta tcnica es que el SDS desnaturaliza las protenas y las protenas multimricas se separan en sus subunidades. Las electroforesis en SDS adems de permitir calcular el peso molecular de las cadenas polipeptdicas, nos indican las distintas subunidades que posee la protena. Generalmente la protena inters se analizan incluyendo calles con marcadores moleculares, que son protenas de peso molecular conocido que nos permiten determinar el peso molecular de la cadena polipeptdica, como se muestra en a siguiente figura. En la calle 1 se encuentran los patrones de peso molecular conocido, en la calle 2 se encuentra la protena sujeta a estudio, de tal manera que se puede hacer una relacin lineal entre el Log del peso molecular de las protenas y la distancia que recorren en el gel (Rf=distancia de la banda/distancia del frente). La siguiente figura nuestra la diferencia entre las electroforesis nativa (NATIVAPAGE) y la electroforesis desnaturalizante (SDS-PAGE). Como se aprecia en la figura una banda en la Nativa, puede dividirse en varias en SDS, si la protena tiene varias subunidades de distinto peso molecular, o bien en una banda de menor peso molecular, si las subunidades poseen el mismo peso molecular. De la figura se deduce que, la protena est pura (pues solo aparece un banda) y que adems posee 2 subunidades de 15000 g/mol (o lo que es lo mismo 15 kDa ) cada una.

TIPOS DE ENLACES
Enlace inico: Este enlace se produce cuando tomos de elementos metlicos (especialmente los situados ms a la izquierda en la tabla peridica -perodos 1, 2 y 3) se encuentran con tomos no metlicos (los elementos situados a la derecha en la tabla peridica -especialmente los perodos 16 y 17). En este caso los tomos del metal ceden electrones a los tomos del no metal, transformndose eniones positivos y negativos, respectivamente. Al formarse iones de carga opuesta stos se atraen por fuerzas elctricas intensas, quedando fuertemente unidos y dando lugar a un compuesto inico. Estas fuerzas elctricas las llamamos enlaces inicos. Ejemplo: La sal comn se forma cuando los tomos del gas cloro se ponen en contacto con los tomos del metal sodio. En la siguiente simulacin interactiva estn representados los tomos de sodio y cloro con solo sus capas externas de electrones Enlace Covalente Los enlaces covalentes son las fuerzas que mantienen unidos entre s los tomos no metlicos (los elementos situados a la derecha en la tabla peridica -C, O, F, Cl, ...). Estos tomos tienen muchos electrones en su nivel ms externo (electrones de valencia) y tienen tendencia a ganar electrones ms que a cederlos, para adquirir la estabilidad de la estructura electrnica de gas noble. Por tanto, los tomos no metlicos no pueden cederse electrones entre s para formar iones de signo opuesto. En este caso el enlace se forma al compartir un par de electrones entre los dos tomos, uno procedente de cada tomo. El par de electrones compartido es comn a los dos tomos y los mantiene unidos, de manera que ambos adquieren la estructura electrnica de gas noble. Se forman as habitualmente molculas: pequeos grupos de tomos unidos entre s por enlaces covalentes. Ejemplo: El gas cloro est formado por molculas, Cl2, en las que dos tomos de cloro se hallan unidos por un enlace covalente. En la siguiente simulacin interactiva estn representados 2 tomos de cloro con solo sus capas externas de electrones. Enlace metalico Para explicar las propiedades caractersticas de los metales (su alta conductividad elctrica y trmica, ductilidad y maleabilidad, ...) se ha elaborado un modelo de enlace metlico conocido como modelo de la nube o del mar de electrones: Los tomos de los metales tienen pocos electrones en su ltima capa, por lo general 1, 2 3. stos tomos pierden fcilmente esos electrones (electrones de valencia) y se convierten en iones positivos, por ejemplo Na+, Cu2+, Mg2+. Los iones positivos resultantes se ordenan en el espacio formando la red metlica. Los electrones de valencia desprendidos de los tomos forman una nube de electrones que puede desplazarse a travs de toda la red. De este modo todo el

conjunto de los iones positivos del metal queda unido mediante la nube de electrones con carga negativa que los envuelve.