第六 讲

免疫 荧光组 化技 术
主要内容
一、荧 光的特 征
二、荧 光素
三、荧 光素标 记抗 体的方 法
四、荧 光抗体 的质 量鉴定
五、免 疫荧光 组化 染色方 法
六、荧 光显微 镜
七、非 特异性 荧光 的消除 方法
八 、激 光扫 描共聚 焦显
微镜
思考题 ：

1. 什么叫 荧光？

2. 常用荧光素 有哪些特征 ？

3. 标记荧光抗 体有哪二种 主要的

制备方 法？
 4. 免疫荧 光组化直接 法、间接法 的

原理和主 要操作流程 ？

5. 观察荧光组 化片时应注 意哪些

问题？

6. 非特异性荧 光的消除方 法有哪

几种？
一、荧光的特征
分子都 含有电子， 电子在
不停地 运动着。根 据量子理 论，运动
着的电 子可以处于 一系列不 连续的能
量状态 中，电子遵 守一定的 规则，要
以从一 个能级向另 一能级跃 迁，并伴
随着与 能级差相对 应的特定 能量的吸
收或释 放。
激发 当电子 吸收能量跃 迁到较高能 级

这个过程 叫激发。

发射 以辐身 方式跃迁时 ，能量转化 成

应波长的 光，这个过 程叫发射。

荧光 跃迁到 激发态的电 子，大多

处于单 重激发态。 如果电子直接 从单重

激发态 以辐身方式 跃迁到基态， 由于单

重激发 态很不稳定 ，半衰期很短 ，发射

持续的 时间也很短 ，这种发射光 ，叫荧

光。
二、荧 光素

能够产生荧光并 能作为染 料的

化合物 称为荧光色 素，必须具备 ：吸收

激发光 的光能并发 射荧光。

1 、具备用于标记抗体的荧光素

条件

(1) 应具有 与蛋白质分 子形成共 价键

的化学 基团，结 合后不易离 解，而未

结合的 色素及其 降解产物易 排除。

(2) 荧光效 率高，与蛋 白质结合 后荧

素质量下降 不多。

(3) 标记后 对抗体的免 疫学性质 和生

性质无影响 。

(4) 结合方 法简便而快 速，并且 较稳

(5) 荧光素 容易溶解， 溶解后不 会

和其

他物质 发生化学反 应。

(6) 荧光颜 色与背景组 织的自发 荧

光颜

色对比 鲜明，能清 晰判断结 果

2. 荧光素的种类

(1) 异硫氰 酸荧光黄（ FITC ）：分

子量 390 D ，最大吸收 光谱为 49 0 ～

495n m ，最大发射 光谱为 52 0 ～

530n m 。呈现明亮 的黄绿色荧 光，分

子量 389 .4 。
(2) 四甲基 异硫氰酸罗 达明

（ TR ITC ）是罗达明的衍 生物，易

溶于水 ，最大吸 收光谱为 55 0nm ，

最大发 射光谱为 620 nm ，呈橙红色

荧光。
(3) 四乙基 罗达明 (R B200) 呈褐红
色粉末 状，溶于 乙醇和丙酮 ，性质稳
定，可 长期保存 。最大吸收 光谱
570n m ，最大发射 光谱 596 ～
600n m ，呈明亮橙 红色荧光， 分子量
580 ， RB 200 不能直接和蛋白 质结合
，要先 经五氯化 磷反应，转 化成硫酰
氯，再 与蛋白质 的氨基结合 。
(4 )1- 二甲基氨基 -5 - 硫酰氯

(5 )4- 乙酰胺 -4- 异硫氰酸 -2 - 硫酸芪

（ SI TS ）

(6 ) 得克萨 斯红（ Texas red ）

(7 ) 藻红蛋 白（ PE ）

(8 ) 花青（ Cya nine, Cy2,C y3,Cy 5 ）

三、荧 光素标记抗 体的方法
( 一 )FITC 标记抗体的方法
1.Mar sshal l 法
(1) 原理： 当 FITC 在碱性溶液 中与抗体
反应时 ，主要是抗 体分子上的 赖氨酸 ε
- 氨基与 FITC 上硫碳 胺键结合 ，一个
IgG 分子中 有 86 个赖 氨酸残基， 一般最
多能结 合 15 ～ 20 个。
荧光素 FITC-N ＝ C ＋ N- 蛋白
质→
‖
S H H
FITC- N – C – N - 蛋白质
‖
H S H
(2 ) 操作流 程
抗体 与荧光素比 例为 50 -100: 1
抗体的 准备： 20mg/ ml ，碳酸盐缓 冲液
为总
量的 1/10 。
荧光素 的准备：用 分析天平准确 称取
0.01m gFITC /1mg 抗
体。
结合： 边搅拌边将 称取的荧光素 加入抗
体
 透析
过柱 Seph ade×G50 或 G25
保存 4℃ - 40℃ 等量甘油分 装
保存。
2. Chadw ick 法
3. 改良法
4. 透析标 记法
（二） 四乙基罗达 明标记抗体方 法
（三） 藻红蛋白标 记抗体方法
四、荧 光抗体的 质量控制

主要进 行特异性 和敏感性两 个方面的

鉴定。

1. 特异 性染色效价 测定

2. 非特 异性染色测 定

3. 吸收 试验

4.F/ P 比值的测定 方法
五、免 疫荧光组织 化学染色 方法

1. 直接法 简便 、快速，用 已知特异

性标记 荧光的一抗 与组织细 胞内抗原

结合。

操作流 程： (1 ) 冰冻切片经 固定，凉

干 PB S 洗；石蜡 切片脱蜡 至水，消化

30mi n ， PBS 洗。
(2) 适当稀 释荧光抗体 滴加在组织切

片上， 湿盒内 37 ℃ 温育 1h ， PBS 洗

3×3mi n 。

(3)0 .01% 伊文氏 蓝衬染 1 ～ 3m in ，

PBS 洗 3×3m in ，蒸馏水洗 2 次，除

去 Na cl 结晶。

(4)p H9.0 缓冲甘 油封片。

(5) 镜检
2. 间接 法 是直接的重要改 进，先用

标记的 已知特异 性一抗与组 织细胞内抗

原结合 ，随后用 间接荧光标 记二抗与一

抗特异 性结合。
操作流 程

(1) 冰冻切 片经固定， 凉干后 PBS 洗

；石蜡 切片脱蜡至 水， PB S 洗，酶消

化， PB S 洗 3×3min 。

(2) 适当稀 释特异性一 抗， 37℃ 孵育

1h ，或室 温 4h ，或 4℃ 过夜， PB S

洗 3×3m in 。
(3 ) 荧光标 记二抗适当 稀释 37℃

30 min ， PBS 洗 3×3m in 。

(4 )0.01 % 伊文氏 蓝衬染 1 ～ 3min ，

PB S 洗 3×3m in 。

(5 ) 封片， 镜检。
六、荧 光显微镜检 查方法

1. 荧光显微镜 荧 光显微镜是免

疫荧光 组织化学的 基本工具 。它是由超

高压光 源，滤片系 统 ( 包括激发和 压制

滤板 ) ，光学系统和摄 影系统等主 要部

件组成 ，是利用一 定波长的 光激发标本

发射荧 光。
(1 ) 光源 光源的亮 度应根据 荧光素的
类型选 择。小功率 汞灯可满足激 励一般
荧光染 料的要求。 对于免疫荧光 染色需
用大功 率超高压汞 灯。其工作时 ，两个
电极间 放电，引起 球内水银蒸发 ，经过
5 ～ 15mi n ，球内气压 升至 50 ～ 70 标
准大气 压，此时达 到最高亮度， 成为稳
定工作 状态。
(2) 滤片系 统 是荧光显微镜 的重要组

成部分 ，是获得特 定波长光， 清晰的荧

光影像 和发挥显微 镜最佳性能 之关键。

了解滤 片性能，正 确地选择滤 片是观察

荧光效 应的前提和 必要条件。

滤片系 统包括激发 滤片，阻断 滤片、隔

热滤片 ，分光镜和 其他一些中 性滤片。

 荧光显微 镜的 滤片系 统
激励 分光 激发滤光 截止滤 光 用途
法
U 镜
DM400 片
BP330-385 片
BA420 自动荧 光观察法， DAPI( 联脒 基吲哚 ) ：
BP360-370 DNA Hoechest 33358,33342 染色体
V DM455 BP400-410 BA455 儿茶酚 胺观察
BV DM455 BP400-440 BA475 芥子喹 吖因；染色 体
BP420-440 硫磺素 S ：淋 巴细胞
吖淀黄 素：核酸
B DM500 BP450-480 BA515 异硫氰 酸荧光素： 荧光抗体观 察
BP470-490 吖啶橙 ： DNA ， RNA
BP420-480 金胺结 核杆菌
IB DM505 PB460-490 BA515IF
BP470-490
G DM570 BP510-550 BA590 罗丹明
BP530-550 四甲基 罗丹明异硫 氰酸盐：荧 光抗体观察
BP480-550 碘化丙 啶： DNA
IG DM565 BP520-550 BA580IF
DM600 BP545-580 BA610IF 德克萨 斯红：荧光 抗体观察
2. 标本制 作要求

(1) 载玻片 厚度应在 0. 6 ～ 1.2mm 之间

(2) 盖玻片 应光洁，厚 度在 0.17mm 左

(3) 标本不 能太厚，如 太厚激发光大 部

分消耗 在标本下部 ，而物镜直 接观察到

的上部 不能充分激 分。
(4) 封片剂 常用 甘油，必须 无自发

荧光， 无色透明， 荧光的亮度 在

pH8 .5 ～ 9.5 时较亮，不易很 快褪去。

甘油和 0.5m ol/L pH9.0 ～ 9.5 的碳

酸盐缓 冲液等量混 合作封片剂 。

荧光信 号增强封 片剂

mo wiol 40-88 4 .8g

甘油 12ml

蒸馏水 12 ml

0.2mo l/L T ris(p H8.5) 24ml

 上述混合（ 加热溶解） ， 5000 g

离心， 15mi n ，最后加入 1.4-

di azobi cydo- [2,2, 2]-

oc tane( DABco s) ，终浓度 2. 5%( 约

1. 25g) ，溶解后，分装 存于 -20℃ 中。

(5 ) 镜油
3. 使用 荧光显微镜 注意事项
(1) 严格按 说明书操作 ，不要随 意改变
程序。
(2) 应在暗 室中进行检 查。
(3) 防止紫 外线对眼睛 的损害。 在调整
光源时 应戴上防 护眼镜。
(4) 检查时 间每次以 1 ～ 2h 为宜， 超过
90mi n ，超高压汞 灯强度逐渐 下降，荧
光减弱 。
(5) 荧光显 微镜光源寿 命有限，标本

应集中 检查，以节 省时间， 保护光源。

光源关 闭后必须在 30mi n 后才能再启

动光源 ，一天中应 避免数次 点燃光源

。
(6) 标本染 色后应立即 观察。

(7) 荧光高 度的判断标 准，分四级“

－”为 阴性，“ ＋” 为仅能见明 确可

见的荧 光；“ ＋＋” 为可见有明 亮的

荧光； “ ＋＋＋”为 可见耀眼的 荧光

。
七、非 特异性染色 的消除方法
根据产 生的原因采 取适当的方法 ，常用
方法：
1. 动物脏器粉末 吸收法
2. 透析法
3.Se phade x G-5 0 柱层析 法
4.DE AE 纤维素柱 层析法
5. 荧光抗体稀释 法
6. 纯化抗原方法
7. 纯化抗体方法
8. 伊文氏蓝衬染 方法： 0. 01% 伊
文氏蓝
八、激 光扫描共 聚焦显微镜

激光扫描共聚 焦显微镜 (l aser

scan ning confo cal

micr oscop e,LSC M) 是 80 年代发展

起来的 一项具有 划时代意义 的高科技

新产品 。
 实现了对细 胞内部非侵 入式光学

断层扫 描成像， 从而对被检 物体样品从

停留到 表面单层 ，静态平面 的观察进行

到立体 ，断层扫 描、动态全 面的观察，

在生命 科学研究 中得到迅速 应用。

1. 仪器构 成

(1 ) 计算机 系统：控制 着机械，光学

、声学 系统及各种 外围设备。

(2 ) 激光照 射系统：氩 离子激光器和

声光调 节器。
(3) 显微镜 系统，它主 要由倒置 显微镜
和共聚 焦系统组成 。

(4) 检测系 统，由检测 器，检测 放大器

等元件 组成。

(5)X － Y 平台 (6)Z- 轴步进马达

2. 共聚焦成像原理

激光器 发出的激光 束经过

光的扩 束和整形 ，变成一束 直径较
大的平 行光束， 长通分色光 镜使光
束偏转 90 度，经 过物镜会聚 在物镜
的焦点 上，样品 中的荧光物 质在激
光的激 发下发出 沿各个方向 的荧光
，
一部分 荧光经过 物镜，长通 分色反

射镜， 聚焦透镜 ，会聚在聚 焦透镜

的焦点 外，经过 焦点处的针 孔，由

检测器 接收并转 变成电信号 。

3. 光信号 接收和成像 方式

(1 ) 光信号 接收 生物样品发 出的荧光

通常有 二种接收方 式：①由光电 倍增管

（ PM T ）把光信号 转变成电信 号；②利

用电荷 耦合器（ CC D ）把光信号 转变成

电信号 。
(2) 成像方 式 ①载物台运 动成像：以 直

径很小 的激光束照 射样品，照 射点发出

的荧光 信号经 PM T 变成电信号 ，然后载

物台移 动到下一点 ，记录该点 的荧光强

度。该 方法无轴向 像差，成像 时间长；

② 反射扫 描成像方式 ，通过转动反 射

镜使激 光连续照射 样品，由 CCD 摄像

机记录 下照射点所 发射的荧光 ，成像

速度快 。
4. 参数 的选择

基本参数：

Conf ocal, pinho le,de tecto r,

PMT ,Step size, X po ints, Y

Poin ts,

scan str,s peed, Laser Pwr,A uto z oom,

Disp lay, BR su bval, Sampl es/pt 等

5. 性能特 点： 分辨率 高，灵敏 度高，

扫描速 度快，扫描 范围大，图 像存取

方便， 可进行光切 片的观察， 可进行

定量荧 光分析。
6. 应用

(1) 组织光学切片 可对 活的或固定

的细胞 及组织进行 无损伤的 系列“ 光

学切片 ”，得到其 各层面的 信息 -“

显微 CT ” 。

(2) 三维图像重建
(3) 细胞物 理和生物化 学测定

(4) 荧光的 定量、定位 分析

(5)C a 2+ 、 pH 及其他细胞内离 子的实

时定

量测定

(6) 粘附细 胞的分选

(7) 激光细 胞显微外科 及光陷阱 技术

(8) 荧光光 漂白恢复（ FRAP ）技术

(9) 胞间通 讯的研究

(10) 细胞膜流动 性测定

(11) 光活化技术
实习 1 免疫荧光组化 ---- 间接法
1. 4 µ m 石蜡切， 58℃ 烤， 18h 。
2. 常规脱蜡至水（二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ
各 10m in ，无水乙醇， 95 ％乙醇，
85 ％乙醇， 75 ％乙醇各 2min ）。
3. PBS 洗（磷酸盐缓冲液 0. 01mol /L
pH 7.4 ） 3×3min 。
4. 0.1% 胰蛋白酶（ 100ml 蒸馏水中加

入 100m g 胰蛋白 酶， 10 0mg 氯化钙，用

0. 1N Na oH 调 pH 至 7. 6 ）， 37℃ ，消

化 30mi n 。

5. 0.01m ol/L pH7.4 PBS 洗

3×3m in 。

6. 兔抗人 AF P1:50 （用专用抗体稀 释

液稀释 ） 37℃ ， 1h 或室温 4h ，或 4℃

7. PBS 洗 3×3m in 。
8. 羊抗兔 Ig G-F ， 1:2 0 稀释，
37 ℃ ， 1h ，室温 2h 。
9. PBS 洗 3×3m in 。
10 . 蒸馏水洗 3min 。
11 .pH9. 0 缓冲甘油封片。
12 . 镜检，阳性呈明亮绿色荧光。