第二十二章

常用分子生物学技术的
原理及应用
The Popular Technology in
Molecular Biology:Principle
and Application
 第 一

分子杂交与印迹技术
Molecular Hybridization & Blotting
Technology
 一、分子杂交与印迹技术的原理

核酸分子杂交 (nucleic acid

hybridization )
在 DNA 复性过程中，如果把不同
DNA 单链分子放在同一溶液中，或把 DNA
与 RNA 放在一起，只要在 DNA 或 RNA 的
单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可
以在不同的分子之间形成杂化双链
(heteroduplex) 。
 复性

RNA DNA
 （一）印渍技术
Blotting
 首先由 Edwen Southern 在 1975 年提出。
 Blotting 即“印渍”，指将存在于凝胶中的生物
大分子转移（印渍）到固定化介质是病加以检
测分析的技术，目前广泛应用于
DNA 、 RNA 、和蛋白质的检测
 探针技术
probe
 将一小段已知序列的核酸片段用放射性
同位素、生物素或荧光染料对它的末端
或全链进行进行标记，称为“探针”然后
用于分子杂交，杂交后通过放射自显影
、荧光检测或显色技术，使杂交区带显
现出来
 二、印渍技术的类别及应用
 DNA 印迹技术 Southern blotting
 RNA 印迹技术 Northern blotting
 蛋白质印迹技术 Western blotting
 斑点印迹 Dot blotting
 原位杂交 in situ hybridization
 DNA 点 DNA array
 DNA 芯片技术 DNA chip
 （一） DNA 印迹技术
Southern blotting
 又称为 Southern 杂交，即 DNA-DNA
交分析。是研究 DNA 图谱的基本技
术，主要用于基因组 DNA 的分析，如
在基因组中特异基因的定位及检测等，
亦可用于分析重组质粒和噬菌体。 在
遗传诊断 DNA 图谱分析及 PCR 产物
分析等方面有重要价值。
 基本方法
 将 DNA 标本用限制性内切酶消化后，经琼脂
糖凝胶电泳分离各酶解片段；
 经碱变性， Tris 缓冲液中和，高盐下通过毛
吸作用将 DNA 从凝胶中转印至硝酸纤维素滤
膜上，烘干固定，凝胶中 DNA 片段的相对位
置在 DNA 片段转移到滤膜的过程中继续保持
着。
 附着在滤膜上的 DNA 与 32P 标记的探针杂交
，利用放射自显影术确定探针互补的每条
DNA 带的位置，确定在众多酶解产物中含某
一特定序列的 DNA 片段的位置和大小。
 Southern Blotting
无水乙醇
酚 / 氯仿 蛋白酶 K SDS
离心
tissue

Paper Towels
 （二） RNA 印渍技术
Northern blotting
 又称为 Northern 杂交，即 RNA-DNA 杂交分
析。是一种将 RNA 从琼脂糖凝胶中转印到硝
酸纤维素膜上的方法。
 主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异
mRNA 的表达水平以及比较不同组织和细胞的
同一基因的表达情况。
 （三）蛋白质印渍技术
Western blotting
 又称为 Western 杂交，或免疫印渍技
术，即利用抗原 - 抗体反应，检测转移
到硝酸纤维素膜上的特异性蛋白质。
 应用：用于检测样品中特异性蛋白质
的存在、细胞中特异蛋白质的半定量
分析以及蛋白质分子的相互作用研究
等。
三
种
印
迹
技
术
的
比
较
（一） DNA 印迹技术 (Southern
blotting)
用于基因组 DNA 、重组质粒和噬菌
体的分析。
（二） RNA 印迹技术 (Northern
blotting)
用于 RNA 的定性定量分析。
（三）蛋白 质 的印迹分析 (Western
blotting)
用于蛋白质定性定量及相互作用研
究。
 斑点印迹
Dot blotting
 斑点交法是不经过电泳，而将被检标
本直接点到膜上，烘烤固定，用于杂交。
这种方法耗时短，可做半定量分析，一
张膜上可同时检测多个样品。
 原位杂交
in situ hybridization
 即组织原位杂交，指组织切片或细胞
涂片直接用于杂交分析。先经适当处
理，使细胞通透性增加，让探针进入
细胞内与 DNA 或 RNA 杂交。因此原
位杂交可以确定探针的互补序列在胞
内的空间位置，这一点具有重要的生
物学和病理学意义。
 第二

聚合酶链反应
Polymerase Chain Reaction
 PCR 技术
polymerase chain
reaction
 PCR 即聚合酶链反应技术，是指利用耐
热 DNA 聚合酶的反复作用，通过变性 -
延伸 - 复性的循环操作，在体外迅速将
DNA 模板扩增数百万倍的一种操作技术
。
 理论上可在 2 小时内将一个 DNA 分子扩
增到 106-109 倍，从而大大提高对其进行
分析研究的速度。
 一、基本工作原理
Template DNA
5′ Primer 1
5′
5′ 5′ Primer 2

Cycle 1

5′
5′
5′
5′

Cycle 2

5′ 5′
5′ 5′
5′ 5′
5′ 5′
 Cycle 3

5′ 5′
5′ 5′
5′ 5′
5′ 5′

5′ 5′
5′ 5′
5′ 5′
5′ 5′

25 ～ 30 次循环后，模板 DNA 的
含量可以扩大 100 万倍以上。
二、 PCR 体系基本组成成分

模板 DNA


 特异性引物
耐热 DNA 聚合酶


 dNTPs
 Mg2+
三、 PCR 的基本反应步骤

变性
95˚C

延伸 退火
72˚C Tm-5˚C
 四、 PCR 的主要用途
 （一）目的基因的克隆
PCR 技术是迅速获得一定量的目的基因以用
于基因克隆的有效方法之一。主要采用的方法
有：
 与反 转 录反 应 相 结 合，直接从 组织 和 细 胞的
mRNA 获得已知目的基因片段；
 利用特异性引物以 cDNA 或基因组 DNA 为模
板，获得已知的目的基因；
 利用简并引物从 cDNA 文库或基因组文库中
获得具有同源性的 DNA 片段；
 利用随机引物从 cDNA 文库或基因组文库中
随机获得目的基因。
 （二）基因的体外突变
采用随意设计的引物，在体外对基
因进行嵌合、缺失、点突变等改造。
 （三） DNA 和 RNA 的微量分析
由于 PCR 技术具有高度敏感性，故
可用于微量 DNA 和 RNA 的分析检测。
 （四） DNA 序列测定
 （五）基因突变分析
三、几种重要的 PCR 衍生技术

（一）反转录 PCR 技术

（二）原位 PCR 技术

（三）实时 PCR 技术
实时 PC R 技术原
理
 第 三

核酸序列分析
Nucleic Acid Sequence Analysis
核酸序列分析的基本原理

化学裂解法 (Maxam-Gillbert
法)

DNA 链的末端合成终止法 (sanger

法)
一、化学裂解法 (Maxam-Gilbert
法)
基本原理
基于某些化学试剂可以使 DNA 链在 1 个
或 2 个 碱 基 处发 生专一性断裂的特性，精确
地控制反应强度，使一个断裂点仅存在于少
数分子中，不同分子在不同位点断裂，从而
获得一系列大小不同的 DNA 片段，将这些片
段经电泳分离。
分析前，用同位素标记 DNA 的 5´ 末端
，经放射自显影即可在 X 胶片上读出 DNA 链
图

化
学
裂
解
法
的
示
意
二、 DNA 链末端合成终止法
目 录
三、 DNA 自动测序

采用 荧 光替代放射性核素 标记 是实 现
DNA 序列分析自动化的基础。用不同荧光分
子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行
Sanger 测序反应，反应产物经电泳（平板
电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光
激发不同大小 DNA 片段上的荧光分子使之
发 射出四 种 不同波 长荧 光， 检测 器采集 荧 光
信号，并依此确定 DNA 碱基的排列顺序。
DNA 自动测序结果举例

目 录
第 四 节

基 因 文 库
Gene Library
基因文库 (gene
library)
是指一个包含了某一生物体全部 DNA
序列的克隆群体。

•基因组 DNA 文库 (genomic DNA

library)

•cDNA 文库 (cDNA library)

 基因组
cDNA 文
DNA 文库
库
 基因组 文库筛选结 果举例

第一轮筛选 第二轮筛选 第三轮筛选

 第 五 节

疾病相关基因的克隆与鉴定
Cloning and Identification of Disease
Relative Genes
 克隆疾病相关基因的策略

（一）功能性克隆 (functional cloning)

（二）定位克隆 (positional cloning)

（三）非定位候 选 基因克隆策略 (position-
independent candidate gene
approaches)
（四）定位候 选 基因克隆策略 (positional
candidate gene approaches )
（一）功能性克隆

定义
从对一种致病基因的功能的了解出
发 ，克隆 该 致病基因。

应用
生化机制已明确、基因表达产物较
易得到部分纯化的遗传性疾病。
克隆方式
① 利用特异性抗体筛选表达型 cDNA 文库
；
② 根据已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸
作探 针 ， 筛选 cDNA 文库。
功能互补试验 (functional
complementation assay)
利用酵母系统从功能学角度鉴定致病基因。
（二）定位克隆
定义
从一种致病基因的染色体定位出发逐步
缩小范围，最后克隆该基因。

系统的定位克隆工作
① 遗传学分析 ( 确定致病基因染色体定位
)
交换分析、连锁不平衡分析
② 分子生物学分析
染色体异常 ( 缺失、易位等 ) 分析
、基因文 库 的 筛选 与基因克隆
（三）非定位候选基因克隆策略

由于基因组作图的完成和分子病理学的
发展，人们可以不依靠染色体定位，直接根据
病理学变化和对各种基因产物功能的了解，预
测出候选致病基因。
（四）定位候 选 基因克隆策略

当致病基因的染色体定位确认后，人们
可以利用因特网上的基因网站所提供基因序
列数据，鉴定出候选致病基因。
 第六

遗传修饰动物模型的建立
及应用
The Establishment and
Application of Heredity-Modified
Animal Model
 一、转基因技术

转基因技术
采用基因 转 移技术使目的基因整合入受
精卵 细 胞或胚胎干 细 胞，然后将 细 胞导入动
物子宫，使之发育成个体。

转基因——被导入的目的基因
转基因动物 (transgenic animal)
—— 目的基因的受体动物
 二、核 转 移技术

核转移技术
即动物整体克隆技术，将动物体细
胞核全部导入另一个体的去胞核的受精
卵内，使之 发 育成个体，即克隆
(clone) 。
 三、基因剔除技术

基因剔除技术
也称基因靶向 (gene targeting)
灭活，有目的去除动物体内某种基因的
技术。
四、基因转移和基因剔除技术在医
学中的应用

建立动物模型
① 单基因决定疾病模型
基因剔除
获得性突变 (gain-of-function
mutation)
② 多基因决定疾病模型
 第 七 节    
     
生 物 芯 片 技 术
Biological Chip
Technology
 一、基因芯片

基因芯片 (gene chip)

•DNA 芯片 (DNA chip)

•cDNA 芯片 (cDNA chip)

是指将许多特定的 DNA 片段或

cDNA 片段作为探针，有规律地紧密排

列固定于单位面积的支持物上 。
DNA
微阵
列
 二、蛋白 质 芯片

蛋白 质 芯片 (protein chip)
是将高度密集排列的蛋白分子作为探
针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋
白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，
再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分
析的一种技术。
 第 八 节

蛋白质相互作用研究技术
Research Technology of
Interaction of Protein
蛋白 质 之 间 相互作用研究的重要性

蛋白质之间相互作用以及通过相互作用
而形成的蛋白复合物是 细 胞各 种 基本功能的
主要完成者。几乎所有的重要生命活动，包
括 DNA 的复制与 转 录、蛋白 质 的合成与分泌
、信号 转 导和代 谢 等等，都离不开蛋白 质 之
间的相互作用。
常用蛋白质相互作用的研究技术

酵母双杂交

各种亲和分析（亲和色谱、免疫共沉淀等

荧 光共振能量 转换 效 应 分析

噬菌体显示系统筛选等等
一、酵母双杂交技术的基本原理
   二、酵母双 杂 交系 统 的 应 用

（一）分析已知蛋白之 间 的相互作用
（二）对蛋白 质 功能域的分析
（三）分析未知蛋白相互作用
（四） 绘 制蛋白 质 相互作用系 统 图 谱
（五）在 药 物 设计 中的 应 用