LIBRO Fundamentos de La Espectroscopia UV-Vis

Fundamentos de la espectroscopa UV-visible moderna
Conceptos bsicos
Tony Owen
Copyright Agilent Technologies 2000 Todos los derechos reservados. Esta prohibida la reproduccin, adaptacin o traduccin, sin el permiso previo y por escrito, excepto aquello permitido por la ley de Derechos de Autor. Impreso en Alemania 06/00 Nmero de publicacin 5980-1397ES
Prlogo
Prlogo
En 1988 publicamos un libro titulado The Diode-Array Advantage in UV/Visible Spectroscopy. En ese momento, aunque los detectores de diodos estaban en el mercado desde 1979, sus caractersticas y sus ventajas comparados con los espectrmetros convencionales de barrido, no eran demasiado conocidas. Nosotros intentamos rectificar aquella situacin. El libro fue bien recibido y se distribuyeron varios miles de copias. Mucho ha cambiado desde aquel primer libro y pensamos que este es un momento adecuado para otra publicacin. Ha aumentado el uso de los ordenadores en la evaluacin de datos; las Buenas Prcticas de Laboratorio tienen ahora gran importancia; y la nueva generacin de espectrofotmetros de diodos se caracteriza por un mejor rendimiento. Con este libro, nuestro objetivo es revisar todos los aspectos de importancia de la espectroscopa UV-visible, para la obtencin de resultados. El control por microprocesador y/u ordenador hace que el proceso de datos sea menos penoso y mejora la productividad. Como fabricantes de instrumentos, nos gustara creer que los equipos son ahora ms fciles de manejar. A pesar de estas ventajas, el conocimiento de los fundamentos de la espectroscopa UV-visible, de las limitaciones instrumentales y de los peligros del tratamiento y la qumica de muestras, sigue siendo esencial para obtener buenos resultados. Adems, quisieramos demostrar que la idea de una medida a una sola longitud de onda es insuficiente para obtener resultados ptimos. Mltiples medidas a mltiples longitudes de onda o (preferiblemente) espectros completos, dan lugar a la mejor exactitud y precisin de resultados y proporciona la informacin necesaria para detectar errores. Me gustara aprovechar esta oportunidad para agradecer a mis colegas de Agilent Technologies, demasiados para nombrarlos a todos, todo lo que he aprendido de ellos sobre espectroscopa UV-visible, durante aos.
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Contenidos
captulo 1 Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible
Principios bsicos................................................................................................ 2 El espectro electromagntico.................................................................... 2 Longitud de onda y frecuencia .................................................................. 3 Origen de los espectros UV-visible ........................................................... 3 Transmitancia y absorbancia..................................................................... 6 Derivadas de espectros .............................................................................. 6 Obtener las derivadas de los espectros ........................................... 8 Aplicaciones ........................................................................................ 9 Seal/ruido .......................................................................................... 9 Consideraciones instrumentales .................................................... 10 Anlisis cualitativo ............................................................................................ 10 Identificacin: espectros y estructura .............................................................................. 10 Confirmacin de la identidad .................................................................. 11 Color ........................................................................................................... 13 Otra informacin cualitativa.................................................................... 14 Temperatura de fusin de las protenas y los cidos nuclicos . 14 Actividad enzimtica ........................................................................ 15 Consideraciones instrumentales ............................................................. 16 Anlisis cuantitativo.......................................................................................... 16 Ley de Beer ................................................................................................ 16 Requisitos de la muestra.................................................................. 20 Anlisis multicomponente ....................................................................... 21 Principio de aditividad ..................................................................... 21 Mtodo de ecuaciones simultneas simples ................................. 21 Mtodo de mnimos cuadrados....................................................... 24 Otros mtodos................................................................................... 26 Requisitos de la muestra.................................................................. 27 Requisitos instrumentales........................................................................ 27 Cuantificacin indirecta ................................................................................... 28 Derivatizacin qumica............................................................................. 28 Valoraciones espectrofotomtricas ........................................................ 28 Ensayos cinticos enzimticos................................................................ 28
captulo 2 Instrumentacin
Diseo instrumental .......................................................................................... 32 Componentes............................................................................................. 32 Fuentes .............................................................................................. 33
Contenidos
Dispositivos de dispersin .............................................................. 34 Detectores ......................................................................................... 35 Optica ................................................................................................. 38 El espectrofotmetro convencional ....................................................... 38 El espectrofotmetro de diodos.............................................................. 39 Configuracin ............................................................................................ 41 Diseo de haz simple ....................................................................... 41 Diseo de doble haz ......................................................................... 42 Diseo con divisin de haz.............................................................. 44 Diseo de doble longitud de onda ............................................................................... 45 Medida de un espectro ............................................................................. 45 Parmetros instrumentales clave .................................................................... 46 Resolucin espectral ............................................................................... 46 Exactitud y precisin de longitud de onda ............................................ 50 Exactitud y precisin fotomtrica .......................................................... 51 Luz dispersa....................................................................................... 51 Ruido .................................................................................................. 52 Rango dinmico lineal .............................................................................. 53 Deriva ......................................................................................................... 55
captulo 3 Tratamiento y medida de muestra

Muestras lquidas ............................................................................................... 58 Cubetas....................................................................................................... 58 Material .............................................................................................. 58 Tipos de cubeta................................................................................. 59 Fuentes de error ............................................................................... 60 Cuidado de las cubetas .................................................................... 61 Eleccin de disolvente ............................................................................. 61 Efecto del disolvente, concentracin, pH y temperatura .................... 62 Muestras slidas ................................................................................................ 64 Sin referencia............................................................................................. 64 Indice de refraccin.................................................................................. 65 Geometra de la muestra .......................................................................... 65 Absorbancia dbil.............................................................................................. 66 Cambiar la anchura de rendija.................................................................................................... 66 Promedio de tiempo ................................................................................. 67 Promedio de longitud de onda ................................................................ 67 Absorbancia fuerte ............................................................................................ 68 Interferencia....................................................................................................... 69 Tipos de interferencia............................................................................... 69 Otros compuestos absorbentes ...................................................... 70 Dispersin.......................................................................................... 70 Tcnicas de correccin ............................................................................ 71
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Contenidos
Isoabsorbancia.................................................................................. 72 Anlisis multicomponente............................................................... 72 Modelar el fondo............................................................................... 73 Referencia interna ............................................................................ 74 Correccin de tres puntos ............................................................... 74 Espectroscopa derivada ................................................................. 75 Problemas fotoqumicos ................................................................................... 79 Fluorescencia ............................................................................................ 79 Descomposicin de la muestra........................................................................ 80
captulo 4 Desarrollo y validacin del mtodo

Desarrollo del mtodo ...................................................................................... 82 Linealidad................................................................................................... 83 Exactitud.................................................................................................... 87 Precisin..................................................................................................... 88 Sensibilidad................................................................................................ 89 Rango.......................................................................................................... 91 Selectividad................................................................................................ 91 Robustez..................................................................................................... 93 Requisitos instrumentales........................................................................ 94 Validacin del mtodo....................................................................................... 94
captulo 5 Operacin de rutina

Verificacin del rendimiento del instrumento ............................................... 96 Parmetros de test .................................................................................... 96 Exactitud y precisin de longitud de onda.................................... 97 Exactitud y precisin fotomtrica.................................................. 98 Luz dispersa....................................................................................... 98 Resolucin......................................................................................... 99 Ruido .................................................................................................. 99 LLanura de la lnea de base ........................................................... 100 Estabilidad....................................................................................... 100 Linealidad ........................................................................................ 100 Patrones ................................................................................................... 101 Patrones de emisin ....................................................................... 101 Patrones slidos de absorcin...................................................... 101 Patrones lquidos de absorcin..................................................... 102 Requisitos de las normas........................................................................ 104 GLP/GMP ......................................................................................... 104 Farmacopea europea ..................................................................... 104 Farmacopea de Estados Unidos ............................................................................... 106 Mtodos americanos de test estndar ......................................... 107
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Contenidos
Recomendaciones ................................................................................... 109 Autotest del instrumento ................................................................................ 114 Idoneidad del sistema ..................................................................................... 115 Operacin apropiada....................................................................................... 115 Almacn electrnico............................................................................... 116 Procedimientos estndar de operacin................................................ 116 Datos colaterales ............................................................................................. 116 Longitudes de onda de confirmacin ................................................... 117 Espectros completos .............................................................................. 117 Estadsticas .............................................................................................. 119
apndice A Exactitud y precisin

Definicin de los trminos ............................................................................. 122
apndice B Caractersticas de los espectrofotmetros de diodos

Ventajas de la espectroscopa de diodos ...................................................... 124 Rpida adquisicin espectral................................................................. 124 Medida multilongitud de onda simultnea........................................... 125 Reseleccin de longitud de onda ..................................................................................................... 126 Sensibilidad.............................................................................................. 127 Estadsticas de las medidas ................................................................... 127 Robustez y fiabilidad................................................................................................... 127 Area abierta de muestra ......................................................................... 128 Desventajas de la espectroscopa de diodos................................................ 128 Resolucin ............................................................................................... 128 Luz dispersa ............................................................................................. 129 Descomposicin de la muestra................................................................................................. 129 Complejidad............................................................................................. 130 Errores en la medida de muestras fluorescentes................................ 130
apndice C Referencias indice
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captulo 1
captulo 1
Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible
Este captulo presenta la teora bsica y los principios de la espectroscopa UV-visible, proporcionando una valiosa visin de los usos y limitaciones de esta tcnica para el anlisis qumico. Tambin se revisan, brevemente, las aplicaciones principales de la espectroscopa UV-visible.
Principios bsicos
El espectro La radiacin ultravioleta (UV) y visible comprende slo una electromagntico pequea parte del espectro electromagntico, que incluye
otras formas de radiacin como radio, infrarrojo (IR), csmica y rayos X (Figura 1).
Frecuencia [Hz] Ultravioleta Rayos csmicos Visible Infrarrojo
Rayos gamma
Microondas
Ultravioleta visible
Televisin
Infrarrojo
Rayos X
Rdar
Longitud de onda [m] Figura 1 El espectro electromagntico
Radio
NMR
La energa asociada con la radiacin electromagntica se define por la siguiente ecuacin:
E = h
donde E es la energa (en julios), h es la constante de Planck (6.62 10-34 Js) y es la frecuencia (en segundos).
Longitud de onda y La radiacin electromagntica puede considerarse una frecuencia combinacin de campos elctricos y magnticos alternos
que viajan por el espacio con un movimiento de onda. Como la radiacin acta como una onda, puede clasificarse segn la longitud de sta o la frecuencia, relacionadas por:
= c
donde es la frecuencia (en segundos), c es la velocidad de la luz (3 108 ms-1) y es la longitud de onda (en metros). En espectroscopa UV-visible, la longitud de onda normalmente se expresa en nanometros (1 nm = 10-9 m). De las ecuaciones anteriores se deduce que radiacin con longitud de onda ms corta tiene mayor energa. En espectroscopa UV-visible, la luz UV de longitud de onda ms pequea tiene la energa ms alta. En algunos casos, esta energa es suficiente para causar reacciones fotoqumicas no deseadas al medir los espectros (recuerde, es el componente UV de la luz el que causa las quemaduras solares).
Origen de los espectros Cuando la radiacin interacciona con la materia, pueden UV-visible ocurrir varios procesos como reflexin, dispersin,
absorbancia , fluorescencia/fosforescencia (absorcin y reemisin) y una reaccin fotoqumica (absorbancia y rotura de enlaces). En general, cuando se miden espectros UV-visible, slo es deseable que ocurra absorbancia. Como la luz es una forma de energa, la absorcin de la luz por la materia causa que aumente el contenido de energa de las molculas (o tomos). La energa potencial total de
una molcula, generalmente se representa como la suma de sus energas electrnica, vibracional y rotacional:
E total = E electronica + E vibracional + E rotacional

La cantidad de energa que una molcula posee en cada forma no es un continuo, sino una serie de niveles o estados discretos. La diferencias de energa entre los diferentes estados siguen el orden:
E electronica > E vibracional > E rotacional

En algunas molculas y tomos, los fotones de luz UV y visible tienen suficiente energa para causar transiciones entre los diferentes niveles. La longitud de onda de la luz absorbida es aquella que tiene la energa requerida para mover un electrn desde un nivel de energa inferior a uno superior. La Figura 2 muestra un ejemplo de transiciones electrnicas en el formaldehdo y las longitudes de onda de la luz que las causan.
transicin transicin
Figura 2 Transiciones electrnicas en el formaldehdo
Estas transiciones deben resultar en bandas de absorbancia muy estrechas, a longitudes de onda caractersticas de la diferencia entre los niveles de energa de las especies absorbentes. Esto es cierto para los tomos, como se muestra en la Figura 3.
Figura 3 Transiciones electrnicas y espectros de los tomos
Sin embargo en las molculas, los niveles de energa vibracional y rotacional estn superpuestos sobre los niveles de energa electrnica. Como pueden ocurrir muchas transiciones con diferentes energas, las bandas se ensanchan (Figura 4). El ensanchamiento es incluso mayor en las disoluciones, debido a las interacciones disolvente-soluto.
niveles de energa electrnica niveles de energa vibracional niveles de energa rotacional transicin electrnica
Figura 4 Transiciones electrnicas y espectros UV-visible en molculas
Transmitancia y Cuando la luz atraviesa o se refleja en la muestra, la absorbancia cantidad de luz absorbida es la diferencia entre la radiacin
incidente (Io) y la transmitida (I). La cantidad de luz absorbida se expresa como transmitancia o absorbancia. La transmitancia normalmente se da en trminos de una fraccin de 1 o como porcentaje, y se define como se indica a continuacin:
T = I I o o % T = ( I I o ) 100
La absorbancia se define:
A = log T
Para la mayora de las aplicaciones se utilizan valores de absorbancia, ya que la relacin entre sta y tanto la concentracin como el paso ptico es, normalmente, lineal.
Derivadas de espectros Si un espectro se expresa en absorbancia (A) como una

funcin de longitud de onda (), las derivadas son:
Orden cero:
A = f( ) dA ------ = f ( ) d d A -------- = f ( ) 2 d
2
Primer orden:
Segundo orden:
La Figura 5 de la pgina siguiente muestra los efectos de la derivacin en una banda gaussiana simple. Las derivadas de los espectros son siempre ms complejos que el espectro de orden cero. La primera derivada es la velocidad de cambio de la absorbancia frente a la longitud de onda. Empieza y termina en cero, pasando por cero a la misma longitud de onda que la max de la banda de absorbancia. Esta derivada tiene una banda positiva y una negativa con un mximo y un mnimo a las mismas longitudes de onda que las de los puntos de inflexin de la banda de absorbancia. Este funcin bipolar es caracterstica de todas las derivadas de orden impar. La caracterstica ms significativa de la derivada de segundo orden es una banda negativa con un mnimo a la misma longitud de onda que la del mximo de la banda de orden cero. Esta derivada tambin muestra dos bandas satlite positivas, a cada lado de la banda principal. La cuarta derivada muestra una banda positiva con un mximo a la misma longitud de onda que el mximo de la banda de orden cero. Las derivadas de orden par muestran una banda negativa o positiva, con mnimos o mximos a la misma longitud de onda que la max de la banda de absorbancia.
Absorbancia
Absorbancia
1 derivada
2 derivada
3 derivada
4 derivada
Figura 5 Derivadas de los espectros de una banda gaussiana de absorbancia
Obtener las derivadas de los espectros
Pueden utilizarse mtodos pticos, electrnicos y matemticos, para generar las derivadas de los espectros. Aunque las tcnicas pticas y electrnicas fueron la base de la primitiva espectroscopa UV-visible, han sido muy superadas por los mtodos matemticos. Para calcular la derivada a una longitud de onda determinada (), se selecciona una ventana de n puntos y se ajusta un polinomio por el mtodo de mnimos
A = a 0 + a 1 + + a l
cuadrados. Los coeficientes a0 al a cada longitud de onda son los valores derivados, donde a1 es la primera derivada, a2 es la segunda, etc. Savitzky y Golay desarrollaron un mtodo muy eficaz para realizar los clculos, que son la base del algoritmo de derivacin en la mayora de los instrumentos comerciales. Este mtodo tambin suaviza los datos. Si el orden del polinomio (l) es menor que el nmero de datos (2n+1) en la ventana, generalmente el polinomio no pasa por todos los puntos. Por lo tanto, el ajuste por mnimos cuadrados da lugar a una aproximacin suavizada a los puntos originales de los datos. Aunque transformar un espectro UV-visible a su derivada de primer o mayor orden, normalmente, resulta en un perfil ms complejo que el espectro de orden cero (Figura 5), no aumenta la informacin intrnseca contenida. De hecho, disminuye debido a la prdida de datos, como los factores de desplazamiento (offset) constantes. Aplicaciones Las derivadas de los espectros pueden utilizarse para resaltar las diferencias entre espectros, resolver bandas solapadas para el anlisis cualitativo (vea Confirmacin de la identidad en la pgina 11) y, ms importante, reducir los efectos de interferencias debidas a dispersin, matriz u otros compuestos absorbentes para el anlisis cuantitativo (vea Espectroscopa derivada en la pgina 75). Un efecto no deseado de la derivacin es la disminucin de la relacin S/N en las derivadas de orden superior. Esta disminucin se debe a la discriminacin (Espectroscopa derivada en la pgina 75) y al hecho de que el ruido siempre muestra las seales ms agudas del espectro. Por tanto, si los datos espectrales utilizados en el clculo de derivadas tienen intervalos de 2 nm, el ruido tiene una anchura de banda de 2 nm. Si la banda del analito tiene una anchura de 20 nm, la S/N de la primera derivada ser 10 veces peor que en el espectro de orden cero. Puede utilizarse la tcnica polinmica de suavizado de Savitzky-Golay para mitigar la disminucin de S/N, pero
Seal/ruido
debe tenerse cuidado ya que un grado demasiado alto de suavizado distorsiona el espectro derivado. Consideraciones instrumentales Para que la resolucin de las derivadas aumente, es necesario un incremento de la reproducibilidad de longitud de onda del espectrofotmetro. Pequeos errores de pueden resultar en errores de seal mucho mayores en el modo derivada que en el modo de absorbancia. El efecto negativo de la derivacin sobre S/N tambin demanda un aumento de las caractersticas de bajo ruido del espectrofotmetro. Si ste puede barrer y promediar mltiples espectros, puede mejorarse la S/N antes de la derivacin.
Anlisis cualitativo
Identificacin: Generalmente, los espectros UV-visible muestran algunas espectros y estructura bandas anchas. Comparada con tcnicas como infrarrojo,
que produce muchas bandas estrechas, la espectroscopa UV-visible proporciona informacin cualitativa limitada. La mayor parte de la absorcin de los compuestos orgnicos resulta de la presencia de enlaces (es decir, insaturados). Un cromforo es un grupo molecular que, normalmente, contiene un enlace . Cuando se inserta en un hidrocarburo saturado (que no exhibe un espectro de absorbancia UV-visible), se forma un compuesto con una absorcin entre 185 y 1000 nm. La Tabla 1 lista algunos cromforos y las longitudes de onda de sus mximos de absorbancia.
Tabla 1
Cromforos seleccionados y sus mximos de absorbancia Cromforo Carbonilo (cetona) Frmula RRC=O Ejemplo Acetona Acetaldehdo max (nm) 271 293
Carbonilo (aldehdo) RHC=O
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Tabla 1
Cromforos seleccionados y sus mximos de absorbancia Carboxilo Amida Etileno Acetileno Nitrilo Nitro RCOOH RCONH2 RCH=CHR RC=CR RC=N RNO2 Acido actico Acetamida Etileno Acetileno Acetonitrilo Nitrometano 204 208 193 173 < 160 271
La presencia de una banda de absorbancia a una determinada longitud de onda es una buena indicacin de la presencia de un cromforo. Sin embargo, la posicin del mximo no es fija sino que depende, en parte, del entorno molecular del cromforo y del disolvente en el que pueda disolverse la muestra. Otros parmetros, como pH y temperatura, tambin pueden causar cambios tanto en la intensidad como en la longitud de onda de los mximos de absorbancia. Conjugando el doble enlace con otros dobles enlaces, aumenta tanto la intensidad como la longitud de onda de las bandas de absorcin. Para algunos sistemas moleculares, como hidrocarburos conjugados o carotenoides, la relacin entre intensidad y longitud de onda ha sido investigada sistemticamente. Los iones de los metales de trasicin tambin tienen niveles de energa electrnica que causan absorcin de 400700 nm en la regin visible.
Confirmacin de la Aunque los espectros UV-visible no permiten una identidad identificacin absoluta, se usan frecuentemente para
confirmar la identidad de una sustancia mediante la comparacin del espectro medido con uno de referencia. Cuando los espectros son muy similares, pueden utilizarse espectros derivados. Como se muestra en la Figura 6, el
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nmero de bandas aumenta con el orden de derivada. Este aumento de complejidad de los espectros derivados puede ser til en el anlisis cualitativo, para caracterizar materiales o para identificacin. Por ejemplo, el espectro del esteroide testosterona muestra una nica banda ancha, sin estructura, centrada alrededor de 330 nm, mientras que la segunda derivada muestra seis picos distintos. El efecto de mejora de resolucin puede utilizarse tambin en la identificacin. La Figura 6 muestra una simulacin por ordenador. Cuando dos bandas gaussianas con una anchura de banda espectral natural (NBW) de 40 nm, separadas por 30 nm, se suman en el modo de absorbancia, resulta una banda con un mximo entre los dos componentes, es decir, no estn resueltos. En la cuarta derivada, estas dos bandas son claramente visibles, con mximos centrados cerca de la max de las bandas de los componentes.
Absorbancia
4 derivada
Figura 6 Mejora de la resolucin
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Color El color es una propiedad importante de una sustancia. El

color de la materia est relacionado con su absortividad o reflexividad. El ojo humano ve el color complementario al que se absorbe, como se observa en la Figura 7 y la Figura 8.
Figura 7 Transmisin y color
Long. de onda [nm]
Color absorbido rojo naranja
Color complementario verde azulado azul verdoso prpura rojo-prpura rojo naranja amarillo amarillo-verde
amarillo-verde verde verde azulado azul verdoso azul violeta
Figura 8 Absorbancia y colores complementarios
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En la prctica, tanto la generacin como la sensacin de color son muy complejas y dependen de muchos factores, como el espectro del iluminante y, en el caso de slidos, de la estructura de la superficie. Se han desarrollado sistemas especializados, como el CIE L*a*b, e instrumentacin para medida de color. Cuando estn equipados con el software apropiado, la mayora de los espectrofotmetros pueden utilizarse para medir el color. Una discusin a fondo sobre este tema est fuera del objetivo de este libro. Varias publicaciones2,3 discuten en detalle el color y su medida, muy correctamente.
Otra informacin La espectroscopa UV-visible puede utilizarse para determicualitativa nar muchas caractersticas fsico-qumicas de los compuestos y, por tanto, puede proporcionar informacin como la identidad. A continuacin se presentan dos ejemplos. Temperatura de fusin de las protenas y los cidos nuclicos Los espectros de absorbancia de las protenas resultan principalmente de la presencia de los aminocidos aromticos triptfano, tirosina y fenilalanina. Una protena a temperatura ambiente tiene una estructura o conformacin terciaria especfica que crea un entorno electrnico determinado para los aminocidos aromticos. Si se calienta la protena, a una cierta temperatura, se desdobla o funde y pierde su estructura. En este proceso, el entorno electrnico de los aminocidos aromticos cambia, lo que resulta en cambios o variaciones espectrales. Puede utilizarse anlisis multicomponente (vea Anlisis multicomponente en la pgina 21) para determinar la cantidad de cada aminocido aromtico que est presente en una protena intacta.4 El cido desoxirribonuclico (DNA) en su estado nativo, consta de dos cadenas de molculas de desoxirribosa enlazadas helicoidalmente. Las cadenas estn unidas por enlaces de hidrgeno entre las bases purina y pirimidina (la adenina se une a la timina (A-T) y la guanina a la citosina (G-C)). Estas bases son las principales responsables de la
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absorbancia UV del DNA, con un mximo a 260 nm. Como en un sistema multicomponente, la absorcin observada de una molcula de DNA debe ser igual a la suma de las absorbancias individuales:
A DNA = A adenina + A guanina + A cito sin a + Atimina

Sin embargo, la absorbancia observada es siempre significativamente menor que la esperada debido a que el enlace de hidrgeno entre las bases cambia su entorno electrnico. Cuando se calienta una molcula, el enlace de hidrgeno se rompe, la doble hlice se desenrosca y la absorbancia aumenta, de manera que se acerca a la esperada de la suma de todas las bases. Este proceso de desnaturalizacin tambin se conoce como fusin. En un experimento de fusin de DNA, se aumenta paso a paso la temperatura de una disolucin de DNA y se mide la absorbancia a 260 nm a cada temperatura, representndose como una curva de fusin. El punto medio del rango de temperatura sobre el que ocurre la fusin, es el valor Tm. El Tm de una muestra particular de DNA depende principalmente del porcentaje de parejas G-C de la muestra, cada una de las cuales contiene tres enlaces de hidrgeno (en contraste, cada pareja A-T contiene dos enlaces de hidrgeno). Cuanto mayor es el porcentaje de parejas G-C en la muestra, mayor es el Tm observado. Actividad enzimtica La actividad de una enzima es una medida de su eficacia como catalizador. La concentracin de enzima en una preparacin impura puede expresarse en trminos de unidades por mililitro y la actividad especfica de la preparacin, puede expresarse en unidades por miligramo de protena. Al purificarse la enzima, la actividad especfica aumenta hasta un lmite (el de la enzima pura). Como la velocidad de reaccin vara con factores tales como concentracin del sustrato, pH, fuerza inica y
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temperatura, las condiciones bajo las que se determina la actividad deben estar definidas con precisin. Estas condiciones son, normalmente, las ptimas de ensayo a una temperatura fija (25, 30 o 37 C), con todos los sustratos presentes en condiciones de saturacin. Para determinar la actividad, se prepara un sistema con concentraciones conocidas de sustrato y, si es necesario, coenzima. Se aade un peso conocido de la enzima y se determina la velocidad de reaccin. Las medidas de actividad se realizan principalmente en el campo de la investigacin donde se aislan y purifican enzimas, as como para la fabricacin de kits de ensayos enzimticos, en los que la actividad de la enzima debe ser igual en todos los lotes.
Consideraciones La exactitud de longitud de onda absoluta y la exactitud instrumentales fotomtrica absoluta son muy importantes para el anlisis
cualitativo, particularmente para la identificacin y confirmacin de compuestos desconocidos. A menudo, se comparan espectros adquiridos en diferentes instrumentos a diferentes tiempos. A este respecto, los espectros pueden haber sido medidos a una resolucin instrumental definida.
Anlisis cuantitativo
Ley de Beer Si 100 fotones de luz entran en una cubeta y slo 50 salen
por el otro lado, la transmitancia es 0.5, o del 50 %. Si estos 50 fotones atraviesan, entonces, una cubeta idntica, slo saldrn 25, etc. La Figura 9 muestra la representacin de la transmitancia frente a la concentracin.
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Paso ptico Figura 9 Transmitancia y concentracin: la ley de Bouguer-Lambert
Generalmente se piensa que Lambert (1760) formul la primera ecuacin matemtica sobre este efecto, aunque ahora parece que se le adelant Bouguer en 1729. La expresin matemtica es:
Transmisin
T = I Io = e
kb
donde Io es la intensidad incidente, I es la intensidad transmitida, e es la base de los logaritmos naturales, k es una constante y b es el paso ptico (normalmente en centmetros). La ley de Beer es idntica a la ley de Bouguer, excepto porque est expresada en trminos de la concentracin. La cantidad de luz absorbida es proporcional al nmero de molculas absorbentes por las que pasa la luz. La Figura 10 muestra una representacin de la transmitancia frente al paso ptico.
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Transmisin
Paso ptico Figura 10 Transmitancia y paso ptico: ley de Beer
Combinando las dos leyes se obtiene la ley Beer-Bouguer-Lambert:
T = I Io = e
kbc
donde c es la concentracin de las especies absorbentes (normalmente expresada en gramos por litro o miligramos por litro). Esta ecuacin puede transformarse en una expresin lineal tomando el logaritmo y, normalmente, se expresa en la forma decdica:
A = log T = log ( I I o ) = log ( I o I ) = bc

donde es la absorcin molar o coeficiente de extincin. Esta expresin se conoce como ley de Beer. La Figura 11 muestra una representacin de la absorbancia frente a la concentracin.
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Absorbancia [UA]
Concentracin Figura 11 La ley de BeerBouguer-Lambert
El coeficiente de extincin () es caracterstico de una sustancia en condiciones definidas de longitud de onda, disolvente y temperatura. En la prctica, el coeficiente de extincin medido tambin depende de las caractersticas del instrumento utilizado. Por esta razn, normalmente no se utilizan valores predeterminados del coeficiente de extincin para anlisis cuantitativo. En su lugar, se construye una curva de calibracin o curva de trabajo para la sustancia a analizar, utilizando una o dos disoluciones patrn con concentraciones conocidas del analito. Para transiciones electrnicas, la diferencia de energa entre los estados fundamental y excitados, es relativamente grande. Por tanto, a temperatura ambiente, es muy probable que todas las molculas estn en estado electrnico fundamental. La absorcin y vuelta al estado fundamental, son procesos rpidos y el equilibrio se alcanza muy rpidamente. Por consiguiente, la absorcin de luz UV-visible es cuantitativamente muy exacta. La simple relacin lineal entre la absorbancia y la concentracin y la relativa facilidad de medida de la luz UV-visible, ha hecho
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de la espectroscopa UV-visible la base de miles de mtodos analticos cuantitativos. Suponiendo que el espectro de orden cero obedece la ley de Beer, existe una relacin lineal similar entre la concentracin y la amplitud, para todos los rdenes de espectros derivados: Orden cero:
A = bc d dA ------ = ----- bc d d d d A -------- = ------- bc d d

n n
Primera derivada:
n derivada:
a , donde A es la absorbancia, es el coeficiente de extincin, b es el paso ptico y c la concentracin. Para cuantificar un solo componente, la seleccin de longitudes de onda es ms difcil con espectros derivados que con espectros de absorbancia, ya que hay presentes picos positivos y negativos. Las derivadas de orden par tienen un mximo o un mnimo a la misma max que el espectro de absorbancia, pero en las derivadas de orden impar esta longitud de onda es un punto de corte con el cero. Tomando la diferencia entre el mximo ms alto y el mnimo ms bajo se obtiene la mejor S/N pero puede resultar en una mayor sensibilidad para las interferencias de otros componentes. Requisitos de la muestra Para resultados exactos, la muestra a analizar debe contener slo el componente absorbente para el que se ha realizado la calibracin. Si la muestra es una disolucin, debe utilizarse como blanco el disolvente puro. Puede que sea posible corregir una interferencia con una segunda longitud de onda.
20
Anlisis Se han realizado casi tantos anlisis multicomponente con multicomponente espectros UV-visible como de un solo componente, pero
debido a que las tcnicas usadas en anlisis multicomponente a menudo producan resultados incorrectos (como se detalla a continuacin), no eran muy aplicados. Sin embargo, los instrumentos modernos producen datos ms precisos y las modernas tcnicas de ajuste de curvas dan lugar a resultados ms exactos y, quizs ms importante, indican cuando los resultados son incorrectos. Por estas razones, los anlisis multicomponente UV-visible se han hecho ms populares. Principio de aditividad Segn la ley de Beer (Ley de Beer en la pgina 16), la absorbancia es proporcional al nmero de molculas que absorben radiacin a la especificada. Este principio es cierto si hay presente ms de una especie absorbente. Todos los mtodos cuantitativos multicomponente estn basados en el principio de que la absorbancia de una mezcla a cualquier longitud de onda, es igual a la suma de la absorbancia de cada componente de la mezcla, a esa . El mtodo simple de anlisis multicomponente se basa en medidas a un nmero de longitudes de onda igual al nmero de componentes de la mezcla. Las longitudes de onda elegidas normalmente son aquellas del mximo de absorbancia de cada componente. Para la calibracin, se mide la absorbancia de patrones puros de concentracin conocida, para determinar el coeficiente de extincin de cada componente a cada longitud de onda seleccionada. La absorbancia de la mezcla a cada longitud de onda es la suma de la absorbancia de cada componente a esa longitud de onda, que al fin y al cabo depende del coeficiente de extincin y de la concentracin de cada componente. As, para dos componentes x e y, las ecuaciones son:
Mtodo de ecuaciones simultneas simples
A ( x + y ) = A x + A y = e x bc x + e y bc y
y
21
A ( x + y ) = A x + A y = e x bc x + e y bc y
donde A es la absorbancia a longitud de onda , A es la absorbancia a longitud de onda , e es la absortividad molar a longitud de onda , e es la absortividad molar a longitud de onda , c es concentracin y b es el paso ptico. Estas ecuaciones se resuelven fcilmente para determinar la concentracin de cada componente. Si las medidas siempre fueran perfectas, podran obtenerse resultados exactos incluso para mezclas de componentes con espectros muy similares. Sin embargo, siempre hay errores en las medidas que pueden afectar significativamente a la exactitud de los resultados si los espectros estn muy solapados. La Figura 12 muestra una mezcla simulada de dos componentes sin solapamiento de los espectros en los mximos.
Absorbancia [UA]
Longitud de onda [nm] Figura 12 Una mezcla de dos componentes con poco solapamiento espectral
En contraste, la Figura 13 muestra una mezcla simulada de dos componentes con un solapamiento significativo de los espectros, en los mximos de absorbancia.
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Absorbancia [UA]
Longitud de onda [nm] Figura 13 Mezcla de dos componentes con un solapamiento espectral significativo
Para una mezcla de x e y donde cx = cy = 1, las absorbancias medidas deberan ser:

Con poco solapamiento espectral A(x + y) = 1.1 + 0.0 = 1.1 A(x + y) = 0.0 + 0.9 = 0.9 Con solapamiento espectral A(x + y) = 0.6 + 0.5 = 1.1 A(x + y) = 0.4 + 0.5 = 0.9
Si ocurre un error del 10 % en la medida de A(x + y) y A(x + y), es decir, A(x + y) = 0.99 (- 10 %) y A(x + y) = 0.99
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(+ 10 %), el clculo cuantitativo da lugar a los resultados mostrados en la Tabla 2:
Tabla 2
Comparacin de los resultados de anlisis multicomponente para ejemplos con poco y sustancial solapamiento espectral Poco solapamiento
Concentracin Concentracin nominal calculada % error
Mucho solapamiento
Concentracin calculada % error
Componente
x y
1 1
0.9 1.1
- 10 % + 10 %
0 1.98
- 100 % + 98 %
Mtodo de mnimos cuadrados
Puede reducirse el efecto del ruido aleatorio mediante el uso de informacin espectral adicional, es decir puede utilizarse una serie de datos para cuantificacin, en lugar de slo dos. En este llamado sistema sobredeterminado, un ajuste por mnimos cuadrados de los espectros patrn al espectro de la muestra medida, da lugar a resultados cuantitativos.5,6 La Figura 14 muestra un espectro para la mezcla de dos componentes mostrada en la Figura 13, con un 10 % de error aleatorio en cada punto medido.
24
Real Absorbancia [UA]
Medido
Longitud de onda [nm] Figura 14 Espectro mezcla con un 10 % de error aleatorio a cada longitud de onda
Con 21 puntos (intervalos de 2 nm sobre 200240 nm), los resultados cuantitativos del mtodo de mnimos cuadrados tienen un error < 1 % comparados con un error de aproximadamente el 10 %, usual en las medidas a dos longitudes de onda, como se muestra en la Tabla 3.
Tabla 3
Comparacin de los resultados de anlisis multicomponente de los mtodos de ecuaciones simultneas simples y mnimos cuadrados Usando slo 210 y 230 nm
Concentracin Concentracin nominal calculada % error
Usando 200240 nm
Concentracin calculada % error
Componente
x y
1 1
0.0 1.98
- 10 % + 10 %
1.003 0.995
+ 0.3 % - 0.5 %
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Este mtodo permite el anlisis de las mezclas ms complejas y de mezclas simples de componentes con espectros similares. El residual del clculo de mnimos cuadrados es un buen indicador de lo bien que los espectros patrn ajustan en los espectros de muestra y, por lo tanto, es un buen indicador de la probable exactitud de los resultados. Un ejemplo de anlisis multicomponente es la cuantificacin de cinco hemoglobinas en sangre, con mnima preparacin de la muestra.7 La Figura 15 muestra los espectros de absorcin de los derivados de hemoglobina. Este anlisis se realizaba anteriormente utilizando varias tcnicas analticas, incluyendo espectroscopa y valoraciones.
Absorbancia [UA]
Sulfhemoglobina Oxihemoglobina Carboxihemoglobina Hemoglobina (pH 7.07.4) Desoxihemoglobina
Longitud de onda [nm] Figura 15 Espectros de absorcin de derivados de hemoglobina
Otros mtodos
Otros mtodos estadsticos de anlisis multicomponente incluyen mnimos cuadrados parcial (PLS), regresin del componente principal (PCR) y mnimos cuadrados mltiple (MLS). En teora, estos mtodos ofrecen algunas ventajas
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sobre los descritos anteriormente, pero en la prctica el proceso de calibracin es mucho ms complejo. Requisitos de la muestra Los mtodos de ecuaciones simultneas simples y mnimos cuadrados dan lugar a resultados exactos slo si se realiza calibracin utilizando patrones puros o mezclas de patrones, para cada componente de la muestra que contribuya al espectro UV. La muestra desconocida no debe tener ninguna capacidad adicional de absorcin.
Requisitos La cuantificacin de un componente normalmente se realiinstrumentales za midiendo con el mismo instrumento, uno o una serie de
patrones y a continuacin, el desconocido. Esta calibracin debera eliminar los efectos instrumentales, haciendo que la exactitud de longitud de onda y fotomtrica absolutas, fueran relativamente poco importantes. Por el contrario, la reproducibilidad fotomtrica es esencial para resultados precisos. Si se mide slo en el mximo de absorbancia, la reproducibilidad de es tambin de poca importancia debido a que la velocidad del cambio de absorbancia con es baja. Sin embargo, si se utiliza una longitud de onda del lateral de la banda, la reproducibilidad ser muy importante. Finalmente, el rango instrumental lineal es crtico, ya que la calibracin supone una relacin lineal. Un anlisis multicomponente exacto requiere una S/N excelente, especialmente si se utiliza el mtodo de ecuaciones simultneas simples. En mnimos cuadrados, los datos de los laterales de las bandas de absorbancia se incorporan al clculo, haciendo que la reproducibilidad de sea tambin esencial. Adems, como se necesitan ms datos, es necesario un barrido rpido para buena productividad.
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Cuantificacin indirecta
Derivatizacin qumica Debido a que muchos compuestos exhiben dbil o ninguna
absorbancia en las regiones UV o visible, se han desarrollado varios mtodos con derivatizacin qumica. Tales mtodos, normalmente implican el aadir un reactivo orgnico, que forma un complejo con fuerte absortividad. La etapa final de medida es prcticamente igual que la de los mtodos directos. Con esta tcnica, la eleccin apropiada del reactivo puede mejorar significativamente tanto la sensibilidad como la selectividad.
Valoraciones En anlisis volumtricos, el cambio de color que seala el espectrofotomtricas final de una valoracin normalmente se detecta
visualmente. Este proceso es inherentemente subjetivo y puede ser una fuente de error. El uso de un espectrofotmetro para detectar el final, introduce la objetividad y la automatizacin en el anlisis.
Ensayos cinticos El anlisis UV-visible directo de un componente en matrices enzimticos biolgicas, por ejemplo sangre o alimentos, es difcil. Las
interferencias de otros componentes a menudo imposibilitan la medida directa de una propiedad especfica, como la absorbancia. La separacin del compuesto de inters puede ser costosa y pesada y por tanto, impracticable en el anlisis de rutina. Pueden utilizarse ensayos enzimticos en el anlisis indirecto de un compuesto o un grupo de compuestos en una matriz compleja. Si se selecciona la enzima cuidadosamente, cualquier cambio en la muestra posterior a la adicin de la enzima, ser el resultado slo de la reaccin del compuesto o compuestos especficos. Esta selectividad es la base de los ensayos enzimticos.
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Los ensayos enzimticos pueden dividirse en dos tipos: ensayos de velocidad y ensayos de punto final. La velocidad de una enzima depende de muchos facyores, que incluyen temperatura, pH, actividad enzimtica, concentracin de la enzima y concentracin del sustrato. Sin embargo, si todos los parmetros estn controlados a un nivel constante, la velocidad de reaccin es directamente proporcional a la concentracin del sustrato. Con los ensayos de punto final, se seleccionan las condiciones de manera que la conversin del sustrato a producto se complete dentro de un periodo razonable de tiempo (520 min). La diferencia entre la absorbancia inicial y final es directamente proporcional a la cantidad de sustrato.
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30
captulo 2
captulo 2
Instrumentacin
31
Instrumentacin
Idealmente, los instrumentos analticos siempre dan lugar a medidas correctas de un parmetro qumico o fsico-qumico, pero en la prctica todos los equipos estn sujetos a error. En este captulo se revisan los componentes bsicos de un espectrofotmetro y las distintas configuraciones instrumentales posibles. Se discuten tambin los parmetros instrumentales clave y sus posibles efectos adversos sobre las medidas.
Diseo instrumental
Componentes Un espectrofotmetro es un instrumento para medir la
transmitancia o absorbancia de una muestra, en funcin de la longitud de onda de la radiacin electromagntica. Los componentes clave de un espectrofotmetro, son:8 una fuente que genera una banda ancha de radiacin electromagntica un dispositivo de dispersin que selecciona una longitud de onda particular (o ms correctamente, una banda de ondas) de la radiacin de la fuente un rea de muestra uno o ms detectores para medir la intensidad de la radiacin
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Instrumentacin
Otros componentes pticos, como lentes o espejos, transmiten la luz a travs del instrumento. Fuentes La fuente ideal de luz sera aquella que generara una intensidad constante a todas las longitudes de onda, con bajo ruido y gran estabilidad. Sin embargo, estas fuentes no existen. Dos son las fuentes utilizadas, comnmente, en los espectrofotmetros UV-visible. La primera fuente, la lmpara de arco de deuterio, produce un buen continuo de intensidad en la regin UV y ofrece una intensidad til en la regin visible (Figura 16). Aunque las modernas lmparas de arco de deuterio tienen bajo ruido, ste, a menudo, es un factor limitante en el ruido general del instrumento. Con el tiempo, la intensidad de luz de una lmpara de arco de deuterio disminuye de modo homogneo. Estas lmparas tienen una vida media (el tiempo requerido para que la intensidad caiga a la mitad de su valor inicial) de, aproximadamente, 1000 horas.
Irradiacin espectral
Longitud de onda [nm] Figura 16a Espectro intensidad de la lmpara de arco de deuterio
La segunda fuente, la lmpara halgena de wolframio (Figura 17), ofrece buena intensidad en parte del espectro UV y sobre el rango visible completo. Este tipo de lmpara tiene muy bajo ruido y poca deriva y tiene, tpicamente, una vida til de 10000 h. La mayora de los espectrofotmetros utilizados para medir el rango UV-visible contienen ambos tipos de lmparas. En estos instrumentos, se utiliza un selector de fuente para cambiar de lmpara segn corresponda, o se mezcla la luz procedente de las dos fuentes para dar lugar a una sola banda ancha.
Longitud de onda [nm] Figura 17 Espectro intensidad de la lmpara halgena de wolframio
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Instrumentacin
Una fuente alternativa de luz es la lmpara de xenon (Figura 18), que produce un buen continuo en las regiones completas UV y visible. Sin embargo, debido a que el ruido de las lmparas actuales de xenon es significativamente peor que el de las lmparas de deuterio o wolframio, las lmparas de xenon se utilizan slo para aplicaciones como medidas de reflectancia difusa, en las que el factor principal en una intensidad elevada.
Longitud de onda [nm] Figura 18 Espectro intensidad de la lmpara de xenon
Dispositivos de dispersin
(a) Prisma
Estos dispositivos causan que diferentes longitudes de onda de luz sean dispersadas con ngulos distintos. Cuando se combinan con una rendija adecuada de salida, pueden utilizarse para seleccionar una longitud de onda (o, ms exactamente, una estrecha banda de onda) de luz de una fuente continua. Comnmente, se utilizan dos dispositivos de dispersin, prismas y redes hologrficas de difraccin, en los espectrofotmetros UV-visible. Cuando la luz solar incide sobre un prisma, se genera un arcoiris. Este principio se utiliza en los espectrofotmetros. Los prismas son simples y baratos, pero la dispersin resultante es angularmente no lineal (Figura 19a). Adems, el ngulo de dispersin depende de la temperatura. Por esto, la mayora de los espectrofotmetros modernos contienen redes hologrficas en lugar de prismas. Estos dispositivos son de cristal, en los que se realizan hendiduras muy estrechas. Tradicionalmente esto se realizaba mecnicamente, pero actualmente se utiliza un proceso ptico hologrfico. Las dimensiones de las hendiduras son del mismo orden que las longitudes de onda de la luz que se va
(b)
Red de difraccin
1er orden
2 orden
Figura 19 Dispositivos de dispersin
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Instrumentacin
dispersar. Finalmente, se aplica un recubrimiento de aluminio para crear una superficie reflectante. La luz que incide sobre la red se refleja con diferentes ngulos, dependiendo de . Las redes hologrficas producen una dispersin angular lineal con la longitud de onda y son insensibles a la temperatura. Sin embargo, reflejan luz de diferentes rdenes, que se solapan (Figura 19b). Como resultado, deben utilizarse filtros para asegurar que slo la luz del orden deseado alcanza el detector. Una red cncava dispersa y enfoca la luz, simultneamente. Un monocromador consta de una rendija de entrada, un dispositivo de dispersin y una rendija de salida. Idealmente, lo que sale es luz monocromtica. En la prctica, sin embargo, es una banda, ptimamente, simtrica. La anchura de la banda a la mitad de su altura, es la anchura de banda instrumental (IBW). Detectores Un detector convierte una seal de luz en una seal elctrica. Idealmente, debe ofrecer una respuesta lineal en un amplio rango, con bajo ruido y alta sensibilidad. Normalmente, los espectrofotmetros contienen un tubo fotomultiplicador o un tubo fotodiodo, como detector. El tubo fotomultiplicador (Figura 20) combina la conversin de la seal con varias etapas de amplificacin, dentro del cuerpo del tubo. El material del ctodo determina la sensibilidad espectral. Un solo fotomultiplicador da lugar a una buena sensibilidad en el rango UV-visible completo. Este tipo de detector ofrece alta sensibilidad a bajos niveles de luz. Sin embargo, en aplicaciones analticas espectroscpicas, una alta sensibilidad est asociada con bajas concentraciones, lo que resulta en bajas absorbancias, lo que al final da lugar a altos niveles de intensidad. Para detectar con exactitud pequeas diferencias entre las medidas de blanco y de muestra, el detector debe tener bajo ruido a altos niveles de intensidad.
Ctodo
Anodo
Figura 20 Detector tubo fotomultiplicador
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Instrumentacin
Cada vez ms, los fotodiodos se utilizan como detectores en espectrofotmetros (Figura 21). Tienen un rango dinmico ms ancho y son ms robustos que los fotomultiplicadores. En un fotodiodo, la luz que incide sobre el material semiconductor permite que los electrones fluyan a su travs, reduciendo la carga en un condensador conectado a l. La carga necesaria para recargar el condensador, a intervalos regulares, es proporcional a la intensidad de la luz. Los primeros fotodiodos tenan baja sensibilidad en el rango UV, pero este problema se ha corregido en los detectores modernos. Los lmites de deteccin son, aproximadamente, 1701100 nm para detectores de silicio.
Contacto metlico
Fotn
capa p capa n Figura 21 El detector de fotodiodos
Regin intrnseca Bloque de oro
Algunos espectrofotmetros modernos contienen una matriz de fotodiodos. Esta consiste en una serie de fotodiodos colocados a los lados de un cristal de silicio. Cada diodo tiene un condensador dedicado y est conectado, por un interruptor, a una lnea comn de salida. Los interruptores se controlan por un registro de cambio (Figura 22). Inicialmente, los condensadores estn cargados. Cuando los fotones penetran el silicio, se generan portadores de
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Instrumentacin
carga elctrica libres que descargan los condensadores. Estos se recargan a intervalos regulares, que representan el periodo de medida para cada ciclo de barrido.
Luz
Fotodiodo Condensador Registro de cambio Interruptor transistor Lnea de vdeo Ciclo de lectura Figura 22 Diagrama esquemtico de una matriz de fotodiodos
La cantidad de carga necesaria para recargar los condensadores es proporcional al nmero de fotones detectados por cada diodo, lo que al final es proporcional a la intensidad de luz. El espectro de intensidad se obtiene midiendo la variacin de intensidad de luz sobre el rango completo de longitud de onda. La matriz, tpicamente, comprende entre 200 y 1000 elementos, dependiendo del instrumento y de la aplicacin. Por ejemplo, la matriz de diodos del espectrofotmetro Agilent 8453 consta de 1024 elementos y el rea fotosensible mide, aproximadamente 25 0.5 mm. El ciclo de lectura, que corresponde al tiempo de iluminacin, es 100 ms. La tecnologa de matriz de fotodiodos es similar a la del microprocesador. Las matrices son dispositivos complejos pero, debido a su estado slido, tienen mayor fiabilidad.
37
Instrumentacin
Optica
Para transmitir y enfocar la luz por el instrumento, se utilizan lentes o espejos cncavos. Las lentes son baratas pero sufren de aberracin cromtica, es decir, luz de diferentes longitudes de onda no se enfoca en exactamente el mismo punto del espacio. Sin embargo, con un diseo cuidadoso, la aberracin cromtica de las lentes individuales de un sistema ptico, puede utilizarse para cancelarse mutuamente, y puede construirse un sistema ptico eficaz con estos componentes simples y baratos. Las lentes acromticas combinan mltiples lentes de diferentes cristales con distintos ndices de refraccin, en una lente bastante libre de aberracin cromtica. Estas lentes se utilizan en las cmaras. Ofrecen un buen rendimiento, pero a un coste relativamente alto. Los espejos cncavos son menos costosos de fabricar que las lentes acromticas, completamente libres de aberracin. Sin embargo, la superficie de aluminio se corroe fcilmente, resultando en una prdida de eficacia. En cada superficie ptica, incluyendo las interfases entre los componentes de una lente acromtica, el 510 % de la luz se pierde por absorbancia o reflexin. Por lo tanto, idealmente, los espectrofotmetros deberan estar diseados con un mnimo nmero de superficies pticas.
El espectrofotmetro La Figura 23 muestra un esquema de un espectrofotmetro convencional convencional de haz simple. La luz policromtica de la
fuente se enfoca sobre la rendija de entrada de un monocromador, que transmite selectivamente una estrecha banda de luz. Esta luz, entonces, atraviesa el rea de muestra hasta el detector. La absorbancia de la muestra se determina midiendo la intensidad de luz que alcanza el detector cuando no hay muestra (el blanco) y comparndola con la intensidad de la luz que alcanza el detector despus de atravesar la muestra. Como se indica anteriormente, la mayora de los espectrofotmetros contienen dos lmparas, de deuterio y de wolframio y
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Instrumentacin
utilizan tubos fotomultiplicadores o, ms recientemente, fotodiodos, como detectores.
Muestra Monocromador Detector
Rendija de salida Dispositivo de dispersin
Fuente
Rendija de entrada
Figura 23 Esquema de un espectrofotmetro convencional
Este diseo es el adecuado para medir la absorbancia en un solo punto del espectro. Es menos apropiado, sin embargo, para medir diferentes compuestos a diferentes longitudes de onda o para obtener espectros de muestras. Para realizar estas tareas con un espectrofotmetro convencional, deben rotarse las partes del monocromador, lo que introduce el problema de irreproducibilidad mecnica en las medidas. Adems, la adquisicin de datos en serie es un proceso inherentemente lento.
El espectrofotmetro La Figura 24 muestra un diagrama esquemtico de un de diodos espectrofotmetro de diodos. La luz policromtica de una
fuente atraviesa el rea de muestra y es enfocada en la rendija de entrada del policromador. Este dispersa la luz sobre una matriz de diodos, en la que cada diodo mide una banda estrecha del espectro. La anchura de banda de la luz detectada por un diodo est relacionada con el tamao de la
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Instrumentacin
rendija de entrada del policromador y con el tamao del diodo. Cada diodo, en efecto, realiza la misma funcin que la rendija de salida de un monocromador.
Matriz de diodos
Policromador
Muestra
Dispositivo de dispersin Rendija de entrada
Fuente
Figura 24 Esquema de un espectrofotmetro de diodos
El policromador (rendija de entrada ms dispositivo de dispersin) y la matriz de diodos estn contenidos en una unidad conocida como espectrgrafo. Como las posiciones relativas de la muestra y el elemento dispersivo estn invertidas respecto a un instrumento convencional, esta configuracin, a menudo, se denomina ptica inversa. Para minimizar posibles reacciones fotoqumicas, se utiliza un obturador para bloquear la luz de la fuente hasta que pueda realizarse una medida. Cuando la medida se inicia, el obturador se abre automticamente y la luz pasa a travs de la muestra hasta la matriz de diodos. Se mide la diferencia entre las intensidades de luz que alcanzan el detector con y sin muestra, segn se describe en El espectrofotmetro convencional en la pgina 38. Un espectrofotmetro de diodos es, inherentemente, muy rpido debido a su capacidad de adquisicin paralela de datos y de barrido
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Instrumentacin
electrnico, tiene excelente reproducibilidad de longitud de onda y es de elevada fiabilidad.
Configuracin Comercialmente, existen varias configuraciones de

espectrofotmetros. Cada una de ellas tiene ventajas y desventajas. Diseo de haz simple Tanto los espectrofotmetros convencionales como los de diodos son de haz simple. Los instrumentos de haz simple son de bajo coste y el sencillo sistema ptico ofrece alto rendimiento y, por consiguiente, alta sensibilidad. Los espectrofotmetros de referencia utilizados por instituciones como el National Institute of Standards and Technology (NIST) de los Estados Unidos y el National Physical Laboratory (NPL) en el Reino Unido, son de haz simple. Los espectrofotmetros de matriz de diodos son particularmente adecuados para la configuracin de haz simple, ya que se adquieren espectros muy rpidamente y porque el intervalo de tiempo entra las medidas de blanco y muestra es mnimo. Adems, pueden utilizarse referencias internas para reducir an ms los efectos de deriva de la lmpara (consulte Referencia interna en la pgina 74). La Figura 25 muestra el sistema ptico de un moderno espectrofotmetro de diodos, el Agilent 8453. Esta configuracin de haz simple tiene un nmero mnimo de componentes pticos, obtenindose la eficacia ms elevada, y contiene una matriz de 1024 diodos que permite medir en el rango de 190 a 1100 nm con buena resolucin.
41
Instrumentacin
Obturador Lente Muestra Lente Rendija Red Matriz de 1024 diodos Lmpara de wolframio Lmpara de deuterio
Figura 25 Diagrama ptico del espectrofotmetro de diodos Agilent 8453
Diseo de doble haz
En un espectrofotmetro convencional de haz simple, el blanco y la muestra se miden consecutivamente, con un intervalo de varios segundos para una medida a una longitud de onda y hasta de varios minutos en una medida de un espectro completo. Las variaciones de la lmpara pueden dar lugar a errores significativos en intervalos largos de tiempo. El espectrofotmetro de doble haz fue desarrollado para compensar los cambios de intensidad de la lmpara entre las medidas de blanco y muestra. En esta configuracin, se coloca un chpper en el paso ptico, cercano a la fuente. El chpper hace que al detector llegue intermitentemente la luz de referencia y la luz que atraviesa la muestra. Gira a una velocidad tal que las medidas alternas de blanco y muestra ocurren varias veces por segundo, corrigiendo, por lo tanto, los cambios a medio y largo plazo de la intensidad de la lmpara (deriva). La Figura 26 muestra un esquema de un espectrofotmetro de doble haz. Comparado con los diseos de haz simple, los
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Instrumentacin
instrumentos de doble haz contienen ms componentes pticos, lo que reduce el rendimiento y la sensibilidad. Para obtener alta sensibilidad, pueden requerirse largos tiempos de medida. Adems, el diseo mecnico ms complejo del espectrofotmetro de doble haz, puede resultar en una menor fiabilidad.
Monocromador Rendija de salida Dispositivo de dispersin Fuente Rendija de entrada Chpper Detector
Referencia
Muestra
Figura 26 Sistema ptico de un espectrofotmetro de doble haz
Tradicionalmente, la mayor estabilidad de los instrumentos de doble haz, ha sido fundamental en el diseo de los espectrofotmetros de alto rendimiento. Sin embargo, recientes avances en el diseo de lmparas y de la electrnica han mejorado la estabilidad de los espectrofotmetros de haz simple y han llevado a un resurgimiento de esta configuracin. Los instrumentos de haz simple ofrecen mayor sensibilidad y ms facilidad de uso, con derivas slo un factor de dos, peores que las de los instrumentos de doble haz. El primer espectrofotmetro de diodos comercial, el HP 8450A, era un diseo multihaz (Figura 27). El director de haz se usaba para alternar el paso de luz por la posicin de referencia y hasta por cuatro posiciones de muestra (en la figura slo se muestra una de ellas).
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Instrumentacin
Lmpara visible Lmpara UV Elipse de la fuente Celda de referencia
Espejos de esquina de la cubeta
Espejo de la fuente
UV
Elipse del espectrgrafo
Espejo superior director del haz Celda de muestra
Visible Red hologrfica Rendija del espectrgrafo y matrices del detector Espejos esquina de cubeta
Espejo inferior director del haz
Figura 27 Sistema ptico del espectrofotmetro de diodos HP 8450A
Diseo con divisin de haz
El espectrofotmetro con divisin de haz (Figura 28) simula el espectrofotmetro de doble haz pero utiliza un divisor en lugar de un chpper para dirigir la luz por los pasos de blanco y muestra, simultneamente, hasta dos detectores idnticos pero separados. Esta configuracin permite medir el blanco y la muestra al mismo tiempo. Aunque el diseo de divisin de haz es mecnicamente ms simple que el instrumento real de doble haz y requiere menos elementos pticos, el uso de dos detectores independientes introduce otra posible fuente de deriva.
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Instrumentacin
Monocromador Rendija de salida Dispositivo de dispersin Fuente Rendija de entrada Referencia Detector
Muestra
Detector
Figura 28 Sistema ptico de un espectrofotmetro con divisin de haz
Este diseo proporciona alta estabilidad, aunque no tan elevada como el instrumento de doble haz ya que dos detectores pueden variar independientemente y, bajo ruido, aunque no tan bueno como el del instrumento de haz simple, ya que la luz se divide de manera que menos del 100 % atraviesa la muestra. Diseo de doble longitud de onda Con un espectrofotmetro de doble longitud de onda, puede medirse simultneamente a dos en aplicaciones especiales, como el estudio de dos reacciones concurrentes en una muestra. El monocromador contiene dos dispositivos de dispersin (transformndolo en un duocromador), con la salida combinada en un haz simple. Estos instrumentos complejos, normalmente, son significativamente ms costosos que los convencionales y han sido sustituidos por espectrofotmetros de diodos, que son instrumentos multilongitud de onda.
Medida de un espectro El grado de interaccin de la muestra con la radiacin

(transmitancia o absorbancia) se determina midiendo la intensidad de la radiacin incidente (sin la muestra) y la
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Instrumentacin
intensidad transmitida (con la muestra). Estas intensidades se denominan Io y I, respectivamente, en las ecuaciones de Transmitancia y absorbancia en la pgina 6. Como la mayora de las muestras medidas en espectroscopa UV-visible estn en disolucin, debe medirse el blanco en una cubeta que contenga el disolvente puro utilizado para preparar la muestra. Este proceso elimina de la medida de la muestra, cualquier absorbancia debida al disolvente. Con un instrumento de haz simple, la cubeta con el disolvente se coloca en el espectrofotmetro y se mide el blanco. Entonces, se mide la disolucin de muestra en la misma cubeta. Todos los instrumentos modernos almacenan automticamente los valores de referencia Io, que se usan para calcular los valores de absorbancia de la muestra. Con un instrumento de doble o haz dividido, se necesitan dos cubetas. Ambas se llenan incialmente con disolvente puro y se realiza la denominada medida de balance. Esta medida refleja la diferencia de absorbancia entre los dos pasos pticos utilizados. Entonces, se llena una cubeta con disolucin de muestra y se miden Io e I, de modo prcticamente simultneo. El espectro resultante se corrige restando el espectro de balance.
Parmetros instrumentales clave
En esta seccin se discuten algunos parmetros instrumentales que pueden afectar a la exactitud y la precisin de los valores de absorbancia (vea en el Apndice A la definicin de los trminos exactitud y precisin). En el captulo 3 Tratamiento y medida de muestra se describen fuentes de error relacionadas con el tratamiento de muestra.
Resolucin espectral La resolucin espectral es una medida de la capacidad de

un instrumento para diferenciar entre dos longitudes de onda adyacentes. Dos se consideran resueltas, normalmente, si el mnimo entre los dos picos de la seal de salida del detector es menor que el 80 % del mximo. Esto se
46
Instrumentacin
conoce como el criterio Rayleigh. La Figura 29 muestra esquemticamente un caso para dos lneas de emisin adyacentes (la entrada al instrumento) y la seal actual que es la salida del detector.
Seal de salida del detector
Intensidad
Longitud de onda Figura 29 Definicin de resolucin
Longitud de onda
Absorbancia I
La resolucin est muy relacionada con la anchura de banda espectral instrumental (SBW). La SBW se define como la anchura, a la mitad de su intensidad mxima, de la banda de luz que sale del monocromador (ver la Figura 30).
0.5 I
Longitud de onda Figura 30 Anchura de banda espectral instrumental SBW
47
Instrumentacin
Absorbancia
La exactitud de cualquier absorbancia medida depende de la relacin de la SBW a la anchura de banda natural (NBW) de la sustancia absorbente. La NBW es la anchura de la banda de absorcin de la muestra a la mitad de su mximo de absorcin (Figura 31).
NBW
Longitud de onda
Figura 31 Anchura de banda espectral natural
Una relacin SBW/NBW de 0.1 o menos, dar lugar a una medida de absorbancia con una exactitud del 99.5 % o mejor.8,9 A una relacin SBW/NBW mayor de 0.1, el espectro medido se distorsiona progresivamente, como se muestra en la Figura 32. Las bandas no pueden resolverse correctamente y ocurrirn errores significativos en los valores de absorbancia, a la mayora de las longitudes de onda. SBW es principalmente una funcin de las anchuras de las rendijas de entrada y salida del monocromador y de la dispersin generada por la red de difraccin. No son inusuales resoluciones de 0.5, 0.2 y 0.1 nm, pero mayores resoluciones pueden causar un considerable deterioro de la relacin S/N.10
Longitud de onda Figura 32 Efecto de variar la SBW sobre la forma de la banda medida
Absorbancia
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Instrumentacin
Espectro original
Proceso de muestreo Absorbancia Espectro digitalizado
En los espectrofotmetros modernos, el intervalo de muestreo utilizado para digitalizar el espectro para su evaluacin y almacenamiento, tambin afecta a la resolucin (en un espectrofotmetro de diodos, la digitalizacin ocurre en la propia matriz). La Figura 33 muestra este efecto. Si el intervalo de muestreo es grande relativamente a la SBW, la resolucin del instrumento se degradar. Un intervalo de muestreo ms pequeo mejora la resolucin pero resulta en ficheros espectrales mucho ms grandes, que pueden ser difciles de manejar. En la prctica, es mejor fijar el intervalo de muestreo a un valor igual o ms pequeo que la SBW. Cuando se consideran requisitos instrumentales, es importante determinar cul es la resolucin necesaria. Como se trat en el captulo 1 Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible, las bandas de absorcin en la regin UV-visible son ms bien anchas, particularmente para muestras en disolucin. Para aproximadamente el 99 % de las medidas de rutina, una SBW de 2 nm es ms que adecuada para obtener medidas exactas de absorbancia, de bandas con una NBW de 20 nm o mayor. Si un instrumento con una SBW de 2 nm se utiliza para medir muestras con una NBW ms estrecha de 20 nm (por ejemplo, benceno), resultar en un error en las medidas de absorbancia absoluta. Este error aumenta al disminuir la NBW (ver Figura 32). Para medidas absolutas de absorbancia, es necesario un instrumento con una SBW ms estrecha. Sin embargo, la mayora de las medidas UV-visible se utilizan para cuantificacin, lo que normalmente requiere slo medidas relativas (por ejemplo, la absorbancia de una concentracin desconocida relativa a la absorbancia de un patrn). Una calibracin realizada utilizando patrones, que encierran la concentracin de la muestra desconocida, dar lugar a resultados cuantitativos exactos incluso para bandas muy estrechas.
Absorbancia
Longitud de onda Figura 33 Efecto del muestreo digital
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Instrumentacin
Exactitud y precisin de La diferencia entre exactitud y precisin de longitud de longitud de onda onda, normalmente, no se entiende demasiado bien (vea en
el Apndice A una explicacin de la diferencia entre ellas). La exactitud de longitud de onda es importante para comparar medidas realizadas en diferentes instrumentos. Sin embargo, en la mayora de los anlisis UV-visible las medidas se realizan en el mismo instrumento relativamente a un patrn y, la precisn de longitud de onda (es decir, la repetitividad) es ms importante. La Figura 34 muestra el efecto de una pobre repetitividad de longitud de onda. Si se selecciona una en el mximo de absorcin para medidas cuantitativas, los pequeos errores que ocurran al reprogramar el espectrofotmetro a esa longitud de onda, tendrn un mnimo efecto sobre la absorbancia medida. Este mtodo da lugar a los resultados cuantitativos ms reproducibles. Por otro lado, elegir una longitud de onda en un lateral de la banda de absorcin, con el mismo error al reprogramar , resultar en errores significativos en la absorbancia medida. En este caso, no sern fiables los resultados cuantitativos.
Error = 0.0 UA Absorbancia [UA]
Error = 0.1 UA (10 %)
Longitud de onda [nm] Figura 34 Efecto de una pobre repetitividad de la longitud de onda
50
Instrumentacin
Todos los textos estndar sobre espectroscopa UV-visible sealan que, para una cuantificacin exacta, la longitud de onda analtica debe estar en el mximo de absorcin, incluso aunque otras longitudes de onda puedan dar lugar a una mejor selectividad. Sin embargo, estos textos estn basados en tcnicas de barrido mecnico convencional y no se aplican a los instrumentos de diodos, que tienen una repetitividad de longitud de onda prcticamente absoluta.
Exactitud y precisin Suponiendo un buen diseo ptico y electrnico, slo dos fotomtrica factores influyen en la exactitud y precisin fotomtrica: la
luz dispersa y el ruido. Luz dispersa La luz dispersa se define como aquella luz detectada de cualquier longitud de onda, que cae fuera de la anchura de banda de la longitud de onda seleccionada. La ecuacin utilizada para calcular la transmitancia y, por lo tanto, la absorbancia, es:
T = ( I + Is ) ( Io + Is )
donde T es la transmitancia, Io es la intensidad de la luz incidente, I es la intensidad de la luz transmitida e Is es la intensidad de la luz dispersa. La intensidad de la luz dispersa, normalmente, no depende de la luz transmitida. Si Is es prcticamente constante, se convierte en el trmino dominante a bajos niveles de I. A elevada absorcin, la luz dispersa causa un hbito negativo en la respuesta del instrumento y, eventualmente, es el factor limitante para la absorbancia y, por lo tanto, para la concentracin que pueda ser medida. Por lo tanto, se ve comprometida la exactitud fotomtrica del instrumento. La Figura 35 muestra el efecto de varios niveles de luz dispersa sobre la absorbancia medida, comparada con la absorbancia actual.
51
Instrumentacin
Absorbancia medida [UA]
0.00 % Luz dispersa 0.01 % Luz dispersa 0.10 % Luz dispersa 1.00 % Luz dispersa
Absorbancia real [UA] Figura 35 Efecto de la luz dispersa sobre la absorbancia medida de la muestra
Ruido
Un espectrofotmetro, tpicamente, tiene dos factores de ruido. El primero (ruido fotnico o Schott) resulta de la distribucin estadstica de los fotones emitidos por una fuente de luz. Es proporcional a la raiz cuadrada de la intensidad de luz. Cuando se miden muestras de baja concentracin con bajas absorbancias, este factor puede evitar una medida exacta de la pequea diferencia entre dos niveles de luz. El segundo factor es inherente a la electrnica del instrumento (amplificador del detector, convertidor analgico-digital, etc.) y es independiente de la intensidad medida. Este factor se convierte en significativo a altos niveles de absorbancia, donde la seal de muestra es muy pequea. Puede minimizarse mediante un buen diseo. El ruido afecta negativamente a la precisin de las medidas y, para una medida sola, puede introducir tambin errores en la exactitud. Sin embargo, el ruido puede reducirse aumentando el tiempo de medida (vea Promedio de tiempo en la pgina 67).
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Instrumentacin
Rango dinmico lineal Una especificacin citada con frecuencia y, a menudo, mal
entendida, es el rango del instrumento. En la mayora de los casos, ste es simplemente el rango numrico que un instrumento puede mostrar. Una especificacin ms til es el rango dinmico lineal que especifica para una desviacin aceptable de la linealidad (en porcentaje de absorbancia), los valores mnimo y mximo de absorbancia. Pueden calcularse los errores potenciales a diferentes absorbancias, a partir de la luz dispersa y el ruido. Por tanto, el error debido a la luz dispersa (%) es igual a
( A t Am )100 At
donde At es la absorbancia real y Am es la absorbancia medida.
At = log ( I I o ) Am = log [ ( I + I s ) ( I o + I s ) ]
donde Io es la intensidad de luz incidente, I es la intensidad de luz transmitida y Is es la intensidad de luz dispersa. La Figura 35 muestra el error debido slo a la luz dispersa. Adems, la absorbancia medida puede ser errnea debido al ruido del instrumento. Por consiguiente, el error debido al ruido (%) es igual a
( A t A m ) ( A t 100 )
donde y o
A t = log ( l l o )
A m = A t + T 100 A pn + A en Am = T 100 A pn A en
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Instrumentacin
donde Apn es el ruido fotnico en UA, Aen es el ruido electrnico en UA y T es la transmitancia como porcentaje. El error total a cualquier absorbancia es la suma de los errores debidos a la luz dispersa y el ruido. La Figura 36 representa el error total para un ejemplo con ruido fotnico de 0.0004 UA y ruido electrnico de 0.0001 UA. El grfico muestra que las medidas de absorbancia hechas desde, aproximadamente, 0.3 a 1.0 UA tienen la exactitud y precisin ms elevadas. El rango dinmico instrumental puede determinarse a partir del error de medida aceptable.
% Error
Curva de error de luz dispersa Curva de error de luz dispersa + ruido Curva de error de luz dispersa - ruido
Absorbancia [UA] Figura 36 Error de absorbancia terica frente a absorbancia
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Instrumentacin
Deriva Otra causa potencial de error fotomtrico es la deriva. Esta

normalmente resulta de variaciones de la intensidad de la lmpara entre las medidas de Io y la de I. Los cambios en la electrnica del instrumento tambin pueden causar deriva. Un buen diseo instrumental puede minimizar la deriva, pero este efecto puede reducir la exactitud de los resultados, especialmente en un periodo prolongado de tiempo (Figura 37). Con datos a mltiple longitud de onda, el problema de la deriva puede minimizarse utilizando tcnicas como la de referencia interna (vea Referencia interna en la pgina 74).
Error Absorbancia [UA]
Longitud de onda [nm] Figura 37 Efecto de la deriva sobre los valores de absorbancia medida
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Instrumentacin
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captulo 3
captulo 3
Tratamiento y medida de muestra
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Conocidas las limitaciones instrumentales y si el espectrofotmetro opera correctamente, las mayores fuentes de error en espectroscopa UV-visible estn relacionadas con el tratamiento y la qumica de la muestra. En este captulo se discuten las potenciales fuentes de error y los pasos para evitarlas.
Muestras lquidas
Cubetas La espectroscopa UV-visible se utiliza principalmente, para
medir lquidos o disoluciones. Esto es ms simple y permite un anlisis cuantitativo ms exacto que realizar medidas de reflectancia en slidos. En esta tcnica, una cubeta debe contener el lquido o disolucin en el rea de muestra. Material Idealmente, las cubetas deberan ser completamente transparentes a todas las longitudes de onda, ya que la absorbancia de la propia cubeta reduce el rango dinmico lineal efectivo para la muestra. Por ejemplo, si el lmite superior del rango dinmico lineal es 2.5 UA pero la cubeta absorbe 1 UA, el rango restante utilizable para la muestra estar entre 1 y 2.5 UA, que es slo 1.5 UA. Las cubetas ms baratas son de plstico, normalmente acrlico. Estas cubetas no son resistentes a todos los disolventes y absorben fuertemente por debajo de 300 nm, hacindolas inadecuadas para medir en esta regin. La
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consistencia (absorbancia y paso ptico) puede variar entre cubetas, dependiendo del fabricante. Las cubetas de vidrio son ligeramente ms caras que las de plstico pero son ms duraderas y, con el cuidado apropiado, pueden durar aos. El vidrio absorbe por debajo de 320 nm y por tanto, no es adecuado para medir en este rea. Las cubetas de cuarzo fundido son razonablemente transparentes por debajo de 210 nm. Las mejores cubetas son de slice fundida sinttica de alta pureza, siendo razonablemente transparentes por debajo de 190 nm. La Figura 38 muestra la absorcin de los diferentes materiales. Observe que todos exhiben al menos el 10 % de prdida por transmisin a todas las longitudes de onda.
Slice fundida Transmitancia [%] Cuarzo fundido
Plstico acrlico Vidrio ptico
Vidrio
Longitud de onda [nm] Figura 38 Caractersticas de transmisin ptica de los materiales de cubetas
Tipos de cubeta
Existe una amplia gama de cubetas pero aqu slo se describen las ms importantes. La cubeta ms utilizada es la rectangular abierta (Figura 39a). Estas cubetas pueden tener pasos pticos de 1 a 100 mm, pero el ms popular es 10 mm. Casi todas las cubetas rectangulares tienen una
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anchura exterior de 12.5 mm. Cuando el volumen de muestra es limitado, a menudo se utilizan cubetas con apertura (Figura 39b). Si el volumen de muestra es muy limitado, pueden utilizarse microcubetas que reducen la apertura del rea de muestra a una seccin muy pequea (2 2.5 mm), Figura 40a. Slo se requieren aproximadamente 60 l de muestra para medir. Con ultramicrocubetas especiales, pueden medirse volmenes por debajo de 5 l. Para aplicaciones automatizadas, se utilizan cubetas de flujo (Figura 40b). Las cubetas modernas se conectan a un tubo de transferencia de muestra. Puede disponerse de cubetas de flujo de varios tamaos de apertura y geometras, con amplio rango de paso ptico.
Figura 39 Cubetas estndar (a) y con apertura (b)
En las cubetas con apertura y microcubetas, se bloquea parte del haz de luz, se reduce el rendimiento y se compromete de algn modo, la sensibilidad. La prdida de sensibilidad depende del grado de apertura y de la geometra ptica.
Fuentes de error Si las cubetas estn apropiadamente diseadas y utilizadas, su contribucin a los errores de absorbancia debe ser mnima. Sin embargo, el analista debe estar al tanto de varias fuentes potenciales de error. Como la absorbancia medida depende del paso ptico, la precisin de ste es importante en las medidas absolutas. La tolerancia de paso ptico para cubetas de alta calidad es 0.01 mm para pasos entre 0.5 y 100 nm.11 Para una exactitud cuantitativa mxima, debe utilizarse la misma cubeta para las medidas de patrn y muestra.
Figura 40 Cubetas micro (a) y de flujo (b)
Cuando se coloca en el haz, una cubeta se transforma en un componente ptico activo. Superficies pticas no planas o no paralelas pueden desviar el haz y causar errores de absorbancia (vea Geometra de la muestra en la pgina
60
65). Las mejores cubetas tienen superficies pticas muy planas y paralelas que minimizan su influencia como componente ptico. La cubeta siempre debe colocarse en la misma direccin en el soporte para asegurar que los efectos pticos son idnticos en las medidas de blanco y muestra. En cubetas con apertura, las partes que no contienen la muestra deben estar apropiadamente cubiertas (como en las figuras) para evitar transmisiones y reflexiones no deseadas a travs de las paredes. Si se utilizan cubetas sin cubrir, las medidas sern errneas. El grado de error depende de la geometra ptica del rea de muestra. Si el haz ptico se enfoca de manera que gran proporcin de luz atraviesa una apertura muy pequea de la cubeta, los resultados con cubetas sin cubrir sern razonablemente exactos, ya que la ptica har el efecto de auto-cubierta. En cambio, si el haz ptico es ancho y colimado (paralelo), pasar mucha luz a travs de las paredes de la cubeta en lugar de atravesar la muestra y las medidas sern inexactas. Cuidado de las cubetas Las cubetas deben manejarse cuidadosamente para evitar araarlas. Debe evitarse tocar las superficies pticas con los dedos, ya que la grasa de las huellas dactilares puede absorber significativamente. Si las superficies pticas de la cubeta estn ligeramente sucias, pueden limpiarse con un pauelo de papel fotogrfico. Si la cubeta est muy contaminada, puede limpiarse con un detergente sulfnico suave o con un lquido especial de limpieza. En casos extremos, puede utilizarse un tratamiento con cido clorhdrico o ntrico.
Eleccin de disolvente El disolvente ideal para la preparacin de muestras sera

aquel que disolviera todos los tipos de compuestos, sera no inflamable y no txico, adems de completamente transparente a todas las longitudes de onda. El agua destilada se acerca al ideal pero no es adecuado para muchos compuestos orgnicos no polares. La Tabla 1 lista algunos de los disolventes ms utilizados. Con la excepcin del agua, todos ellos exhiben una longitud de onda de corte
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en el rango UV, por debajo del cual absorben demasiado para realizar medidas de muestra.
Tabla 4
Propiedades de algunos disolventes comunes Longitud de onda Disolvente Agua destilada Hexano Etanol (absoluto) Metanol Ciclohexano Cloroformo Dimetilsulfxido Acetona
*
Polaridad* 78.5 1.9 24.3 32.6 2.0 4.8 ninguna 20.7
de corte (nm)** < 195 199 207 210 211 246 270 331
Riesgos*** ninguno F F F F F/T H F
Constante dielctrica a temperatura ambiente Longitud de onda a la que la transmitancia a paso ptico de 10 mm es < 25 % *** F = inflamable; T = txico; H = riesgo para la salud
**
Con disolventes orgnicos voltiles, como acetona o cloruro de metileno, es aconsejable utilizar una cubeta cerrada para eliminar la evaporacin, que podra dar lugar a cambios rpidos de concentracin.
Efecto del disolvente, Varios factores, que incluyen el disolvente utilizado, junto concentracin, pH y con la concentracin, pH y temperatura de la muestra, temperatura pueden afectar a la posicin e intensidad de las bandas de
absorcin de las molculas. Estos parmetros deben controlarse para asegurar mxima precisin y para poder comparar espectros medidos bajo diferentes condiciones. La polaridad de un disolvente puede modificar el entorno electrnico de un cromforo absorbente. En general, la magnitud de la variacin puede correlacionarse con la
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polaridad del disolvente. Por tanto, por ejemplo, el mximo de absorcin de la acetona puede variar de 259 a 279 nm, dependiendo del disolvente. Para anlisis comparativo, debe utilizarse un solo disolvente para todas las medidas. La concentracin, normalmente, slo afecta a la intensidad de las bandas. A concentraciones ms altas, sin embargo, las interacciones moleculares (por ejemplo, dimerizacin) pueden causar cambios en la forma y posicin de la banda de absorbancia. En ltimo trmino, estos cambios afectan a la linealidad de la concentracin frente a la relacin de absorbancia y puede llevar a resultados cuantitativos inexactos. Los efectos del pH sobre los espectros de absorbancia pueden ser muy grandes y resultar, principalmente, de las variaciones del equilibrio entre dos formas diferentes. Por ejemplo, los indicadores de pH cambian de color a diferentes valores. Si el espectro de la muestra se afecta por el pH, debe utilizarse un regulador para controlar este parmetro. Observe, sin embargo, que la mayora de los reguladores exhiben una absorbancia significativa, lo que puede afectar al rango de longitud de onda sobre el que pueden realizarse las medidas. La temperatura tambin puede afectar a las medidas UV-visible. Una simple expansin, especialmente en algunos disolventes orgnicos, puede ser suficiente para cambiar la absorbancia aparente y, por lo tanto, la exactitud de los resultados cuantitativos. Adems, la temperatura puede afectar a los equilibrios, qumicos o fsicos. Un buen ejemplo de equilibrio fsico es la desnaturalizacin de los cidos nuclicos al aumentar la temperatura, lo que cambia la absortividad. Finalmente, sobre todo en disolventes orgnicos, pueden ser significativos los cambios del ndice de refraccin con la temperatura. Si las corrientes de conveccin causan que haya diferencias de temperatura en distintas partes de la cubeta, el efecto Schlieren resultante puede cambiar la absorbancia aparente. Si se observa que la temperatura tiene efecto considerable sobre las medidas,
63
debe controlarse este parmetro utilizando un soporte termostatizado. Este puede ser un simple soporte envuelto por agua, utilizado junto a un bao de agua circulante, o un controlador Peltier de temperatura, ms sofisticado. Con disolventes orgnicos, es aconsejable utilizar una cubeta cerrada para minimizar el efecto Schlieren.
Muestras slidas
Varios factores pueden interferir con la medida exacta y precisa de muestras slidas transparentes, como vidrios o cristales.
Sin referencia A menudo se miden muestras slidas para determinar el

espectro o cuantificar un componente de la matriz. Sin embargo, una muestra de la matriz que no contenga el analito, no siempre puede conseguirse. En este caso, puede realizarse la medida del blanco con aire, ya que no es posible obtener un blanco real (matriz sin analito). Este proceso, en el mejor de los casos, resultar en un desplazamiento constante a todas las longitudes de onda y, en el peor, en un espectro medido que ser una mezcla del analito y la matriz. Es posible el anlisis cuantitativo exacto si se dispone de dos o ms patrones y si se utiliza una curva de calibracin que no est forzada a pasar por cero. La interseccin con el eje Y representa, entonces, la absorbancia debida a la matriz. Si no se dispone de mltiples patrones, la referencia interna utilizando una longitud de onda de referencia a la que no haya absorbancia del analito, es a menudo, una alternativa viable.
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Indice de refraccin
Haz colimado
Muestra Haz enfocado
Detector
Luz no detectada Figura 41 Efecto del ndice de refraccin
La carencia de una muestra de referencia tambin causa un cambio significativo del ndice de refraccin entre el blanco (aire) y la muestra slida. Si el haz ptico se colima perpendicularmente a la muestra, este efecto no es importante. Sin embargo, si el haz se enfoca, la muestra slida se convierte en un componente activo ptico y altera la longitud del paso. Este cambio del paso ptico puede, en ltimo caso, causar una modificacin significativa del grado de iluminacin del detector entre el blanco y la muestra (Figura 41), resultando en un error de la absorbancia aparente. Este problema es muy difcil de detectar y, si el instrumento es de diseo de enfoque de haz, no tiene fcil solucin. Sin embargo, este efecto puede minimizarse colocando la muestra tan cerca del detector como sea posible.
Geometra de la A menudo las muestras slidas pueden ser de vidrio, filtros muestra de plstico moldeados o lentes (por ejemplo, lentes de
cristales solares). Estas muestras son componentes pticos activos del sistema y desvan o cambian la longitud focal del haz de luz. Como resultado, el detector falla al detectar parte de la luz (Figura 42), que se mide, entonces, como absorbancia aparente. Este efecto puede probarse rotando o invirtiendo la muestra en su soporte y puede minimizarse colocando la muestra tan cerca del detector como sea posible.
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Area fotosensible Detector Detector
Muestra plana
Muestra con bordes
Figura 42 Efecto de una geometra no plana de la muestra
Absorbancia dbil
Un problema en qumica analtica es la baja sensibilidad, que puede ser debida a una baja concentracin de la muestra o a una absortividad muy dbil del analito. A bajas absorbancias, el ruido en las medidas resulta en una prdida de precisin de manera que cualquier medida simple puede ser inexacta. Reducir directamente el nivel de ruido mejora la precisin de los resultados. La especificacin de ruido debe ser un parmetro clave en la seleccin del espectrofotmetro, pero observe que variar los parmetros de medida reducir el nivel de ruido.
Cambiar la anchura Si el espectrofotmetro tiene una anchura variable de de rendija rendija, el nivel de ruido puede reducirse aumentando esta
anchura para que ms luz atraviese los componentes pticos. Este aumento de la rendija da lugar a una mejor relacin S/N pero reduce la resolucin del instrumento.
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Promedio de tiempo
Tomar la media de los datos reduce el ruido por la raiz cuadrada del nmero de puntos promediados. La Figura 43 muestra la mejora de la relacin S/N con el aumento del tiempo de integracin, para un colorante a muy baja concentracin. Las medidas se realizaron utilizando un espectrofotmetro de diodos con tiempos de integracin de 0.1 y 1.6 s. La mejora actual es cercana al valor terico esperado de cuatro. Observe que ampliar el tiempo de integracin mejorar la sensibilidad slo hasta que otros efectos, como la deriva, sean dominantes.
Absorbancia [UA]
S/N = 5.5
0.1 seg
Absorbancia [UA]
S/N = 18
1.6 seg
Longitud de onda [nm] Figura 43 Efecto del t de integracin en S/N
Promedio de longitud Otra tcnica es promediar la longitud de onda. La Figura 44 de onda muestra una banda ancha de absorcin. Las medidas
cuantitativas convencionales se realizan en el mximo de absorcin. Si se dispone de los datos a todas las longitudes de onda, pueden incluirse en la media valores adicionales a ambos lados del mximo. La reduccin del ruido es equivalente a la raiz cuadrada del nmero de puntos. Sin embargo, cuantos ms datos se aaden, la absorbancia media se reduce, lo que tiene un efecto negativo sobre la seal. Para una particular anchura de banda de absorcin, un nmero determinado de puntos dar lugar a la S/N ptima (Figura 44).
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Absorbancia
Longitud de onda NBW Rango ptimo
Absorbancia
S/N Seal Ruido
# de puntos
Figura 44 Efecto del promedio de longitud de onda sobre S/N
La deriva tambin afecta a la exactitud de las medidas de absorbancia. Puede utilizarse una referencia interna (Referencia interna en la pgina 74) para mejorar la precisin y la exactitud a bajos niveles de absorbancia.
Absorbancia fuerte
Cuando las muestras absorben fuertemente, puede excederse el rango dinmico lineal del instrumento, siendo la relacin entre absorbancia y concentracin, no lineal (Rango dinmico lineal en la pgina 53). La solucin ms fcil a este problema es diluir la muestra a un nivel de absorbancia dentro del rango dinmico lineal. Con muestras slidas esto no es posible. Adems, cualquier etapa de tratamiento de muestra, incluso la dilucin, introduce errores y debe, por lo tanto, ser evitada. Una alternativa es seleccionar una o ms longitudes de onda en el lateral de la banda de absorbancia, donde la absortividad es menor (Figura 45). Cuando se utiliza para calibracin la longitud de onda del mximo (241 nm), puede medirse una concentracin mxima de aproximadamente 0.26 mg/ml, con una exactitud razonable. Sin embargo, utilizar la
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absorbancia en el lateral de la banda (266 nm) permite medir concentraciones de hasta 5 mg/ml con igual exactitud. Un prerrequisito para esta tcnica es una excelente reproducibilidad de longitud de onda (Exactitud y precisin de longitud de onda en la pgina 50).
0.1428 mg/ml espironoloactona
Absorbancia [UA]
Longitud de onda [nm]
Absorbancia medida [UA]
Concentracin [mg/ml]
Figura 45 Cambio de longitud de onda para aumentar el rango dinmico
Interferencia
Tipos de interferencia Idealmente, la absorbancia que ocurre durante las medidas
UV-visible tiene que deberse slo al analito de inters. Sin embargo, en la prctica, a menudo aparecen absorbancias que interfieren con las medidas, por razones qumicas o fsicas.
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Otros compuestos absorbentes
La presencia de cualquier compuesto que absorba en la misma regin que el de inters, resultar en un error en la medida de absorbancia. A veces, slo est presente un nico compuesto absorbente conocido, por ejemplo un subproducto de la sntesis de un compuesto farmacutico. En otros casos, mltiples especies absorbentes, muchas de ellas conocidas (por ejemplo, muestras biolgicas como sangre), pueden causar una ancha absorcin matriz. Un problema de los anlisis farmacuticos y biolgicos es la dispersin, scattering, causada por las partculas suspendidas en disolucin. En anlisis farmacuticos, estas partculas suelen ser los excipientes o rellenos utilizados en las formulaciones de las tabletas o cpsulas. La dispersin de radiacin resulta en una absorbancia aparente de fondo que interfiere con las medidas de absorbancia. Filtrar las muestras antes de las medidas elimina la dispersin pero no siempre es practicable y, a menudo, el analista trabaja con espectros que incluyen este problema. La dispersin causa una absorbancia aparente debida a que la luz, en lugar de pasar a travs de la disolucin hasta el detector, se dispersa con cierto ngulo. Por lo tanto, incluso si no hay absorcin, menos luz alcanza el detector, como se muestra en la Figura 46. En la parte UV-visible del espectro, pueden observarse dos tipos de dispersin. La dispersin Rayleigh ocurre cuando las partculas son pequeas relativamente a la longitud de onda de la luz y es inversamente proporcional a la cuarta potencia de . La dispersin Tyndall ocurre cuando las partculas son grandes relativamente a la longitud de onda de la luz y es inversamente proporcional al cuadrado de . En sistemas qumicos, el exponente de la longitud de onda puede variar de - 4 a - 2, dependiendo de la distribucin de tamaos de las partculas:
Dispersin
Detector
Muestra transparente
Detector
Muestra con dispersin Figura 46 Dispersin (Scattering)
A scatter 1
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donde A es la absorbancia debida a la dispersin, es la longitud de onda y n es el orden de dispersin, scattering. Esta relacin causa que el error debido a la dispersin aumente al disminuir la longitud de onda, Figura 47.
Absorbancia [UA]
dispersin Tyndall dispersin Rayleigh
Longitud de onda [nm] Figura 47 Espectros de dispersin
La magnitud del efecto de dispersin puede reducirse colocando la muestra lo ms cerca posible del detector. Sin embargo, con una dispersin significativa, se pierde luz y la sensibilidad y la exactitud del anlisis cuantitativo se ven seriamente comprometidas.
Tcnicas de correccin Pueden utilizarse varias tcnicas para eliminar o reducir los
errores de interferencia. En general, si el origen del error es conocido y reproducible entre muestras, puede eliminarse. Por el contrario, si el origen es desconocido y vara de muestra a muestra, el error puede reducirse pero no eliminarse. Las tcnicas de correccin siempre requieren datos de al menos dos longitudes de onda. Las tcnicas ms sofisticadas requieren datos multilongitud de onda o espectrales.
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Isoabsorbancia
Cuando est presente un componente interferente de espectro conocido, puede eliminarse el error introducido por este compuesto a la longitud de onda analtica, seleccionando una longitud de onda de referencia a la que la interferencia exhiba la misma absorbancia que a la longitud de onda analtica. La absorbancia a esta longitud de onda de referencia se resta de la abosrbancia a la longitud de onda analtica, Figura 48. La absorbancia residual es la absorbancia real del analito.
Absorbancia [UA]
Espectro del analito Espectro interferente Espectro medido
Longitud de onda [nm] Figura 48 Correccin de isoabsorbancia
Esta tcnica es menos fiable cuando los espectros del analito y de la interferencia son muy similares. Adems, permite corregir slo una interferencia. Anlisis multicomponente Una extensin de la isoabsorbancia es el anlisis multicomponente, descrito en Anlisis multicomponente en la pgina 21. Aqu, deben medirse como patrones los espectros de las interferencias. Esta tcnica puede aplicarse con xito cuando los espectros se solapan de manera considerable y cuando hay presente ms de un compuesto interferente.
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Modelar el fondo
Modelar el fondo es apropiado cuando la interferencia se debe a un proceso fsico (frecuentemente, dispersin) en la que la interferencia a la longitud de onda analtica puede estimarse por extrapolacin a partir del modelo en otro rango de . Se selecciona una parte del espectro donde la absorbancia aparente se debe slo a la interferencia. Entonces, se ajusta un polinomio a esta parte del espectro utilizando un ajuste por mnimos cuadrados al logaritmo de la absorbancia:
A = a
log ( A ) = log ( a ) + n log ( )

donde A es absorbancia, es longitud de onda, n es el orden de la relacin entre absorbancia y longitud de onda y a es una constante. La absorbancia de fondo al resto de las longitudes de onda puede estimarse utilizando los coeficientes determinados por el ajuste. Estos valores se restan de los valores medidos, para obtener las absorbancias debidas al analito, Figura 49.
Espectro medido Absorbancia [UA] Espectro extrapolado de dispersin
Longitud de onda [nm] Figura 49 Modelo de fondo
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Referencia interna
Una de las tcnicas ms simples de correccin es la referencia interna, que utiliza una sola longitud de onda de referencia. Este mtodo se suele utilizar cuando aparece deriva de la lnea de base entre medidas En general, es mejor elegir una longitud de onda de referencia lo ms cerca posible de la longitud de onda analtica, pero sin absorbancia significativa del analito. La absorbancia a la longitud de onda de referencia se resta de la de la longitud de onda analtica. Se corrige cualquier interferencia constante a todas las longitudes de onda, Figura 50. Aunque en la prctica las interferencias no suelen ser constantes a todas las longitudes de onda, esta simple tcnica a menudo da lugar a sorprendentes mejoras en la exactitud.
Espectro a Espectro b Absorbancia [UA]
Longitud de onda [nm] Figura 50 Referencia interna
Correccin de tres puntos
La correccin de tres puntos, o Morton-Stubbs, utiliza dos longitudes de onda de referencia, normalmente aquellas a los lados de la longitud de onda analtica. Se estima entonces la absorbancia interferente de fondo a la longitud de onda analtica, usando interpolacin lineal (Figura 51). Este mtodo representa una mejora sobre la tcnica de referencia a una , porque corrije cualquier absorbancia de
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fondo que exhiba una relacin lineal con la longitud de onda. En muchos casos, si el rango de longitud de onda es estrecho, ser una correccin razonable para absorbancias de fondo no lineales, como la resultante de la dispersin o de una matriz comleja.
Espectro medido Absorbancia [UA]
Longitud de onda [nm] Figura 51 Correccin de tres puntos (Morton-Stubbs)
Espectroscopa derivada
Debido a dos de sus propiedades, la espectroscopa derivada puede utilizarse para reducir o eliminar la interferencia de fondo de varios orgenes. Primero, cualquier interferencia con una relacin directamente proporcional a diferentes rdenes de , de forma general
A = a0 + a1 + + an
se elimina por el uso de derivadas de orden cada vez mayor. As, un desplazamiento constante de la lnea de base (a0) se elimina por la primera derivada, una absorbancia de fondo que aumenta linealmente con , se elimina por la segunda derivada, etc. Desafortunadamente, slo el desplazamiento constante de la lnea de base es comn en espectroscopa UV-visible.
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Segundo, y quizs ms importante que la primera propiedad, las derivadas discriminan bandas anchas de absorbancia relativamente a bandas estrechas de absorbancia. Esta discriminacin resulta del hecho de que la amplitud (Dn) de una banda gaussiana en la ensima derivada, es inversamente proporcional a la anchura de banda original (W) elevada al grado n:
1n D ------ . n W
Por lo tanto, para dos bandas coincidentes de igual intensidad pero diferente anchura en el orden cero, la amplitud de la derivada n de la banda ms aguda (X) es mayor que la de la banda ms ancha (Y), en un factor que depende de la anchura de banda relativa y del orden de la derivada:
WY DX -------- = --------n n DY DX
La Figura 52 muestra el efecto de tomar las derivadas de dos bandas con NBW de 160 y 40 nm, respectivamente. En modo absorbancia, estas bandas tienen igual amplitud. En la primera derivada, la banda ms estrecha tiene 4 veces mayor amplitud y, en la segunda derivada tiene 16 veces mayor amplitud. Esta propiedad mejora la exactitud de la cuantificacion de cualquier componente de banda ancha. Este ltimo puede ser un componente intereferente, como se muestra en la Figura 52.
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Absorbancia
Primera derivada
Segunda derivada
Longitud de onda [nm] Figura 52 Discriminacin de bandas anchas en espectroscopa derivada
El espectro resultante de dispersin es tambin de banda ancha y el uso de derivadas puede reducir tambin su contribucin. Por ejemplo, la Figura 53 muestra una banda de absorbancia con una NBW de 40 nm y la misma banda en la presencia de fondo de dispersin. Sin ninguna correccin, la amplitud a 500 nm es 1.0920 A en lugar de 1.0 A, debido a la contribucin de la dispersin. La cuantificacin a esta longitud de onda resulta en un error del + 9.2 %. Tomar la primera derivada reduce la contribucin del componente de dispersin, de manera que utilizando del mximo al mnimo del pico, la seal en la presencia de dispersin es 0.02992 A en lugar de 0.03024 (un error de cuantificacin de slo - 1.1 %).
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Absorbancia Espectro medido Espectro actual
Primera derivada
Longitud de onda [nm] Figura 53 Correccin de la dispersin por espectroscopa derivada
Normalmente, sin embargo, el problema analtico no puede definirse de modo tan simple como dispersin, variacin de lnea de base o componentes de absorcin ancha no deseados. Lo normal es que una combinacin de dos o ms de estos efectos resulte en una matriz de fondo de absorcin ancha. La espectroscopa derivada es una herramienta excelente para reducir o eliminar estas fuentes de error difciles de caracterizar.
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Problemas fotoqumicos
Fluorescencia Algunas muestras fluorescen, es decir, emiten luz de un
rango de longitud de onda cuando se irradian con luz de una longitud de onda ms corta (de ms energa). Esta luz emitida resulta en un error en la medida de absorbancia. La magnitud y posicin del error depende de si el instrumento tiene una ptica convencional o una ptica inversa. En un instrumento de ptica convencional, la muestra se ilumina con luz de longitud de onda, variable con el tiempo. Al barrer el rango de longitud de onda de excitacin, ocurre absorcin y se inicia el proceso de fluorescencia que emite luz a longitudes de onda ms largas. Como el detector no puede diferenciar entre las longitudes de onda individuales, la absorbancia medida a la longitud de onda de excitacin es muy baja (Figura 54). Al barrer el rango de longitud de onda de emisin, no aparece fluorescencia y las medidas de absorcin son, por lo tanto, exactas.
Longitud de onda de excitacin Absorbancia [UA]
Espectro medido con ptica convencional Espectro medido con ptica inversa
Longitud de onda de emisin
Longitud de onda [nm] Figura 54 Efecto de la fluorescencia sobre el espectro medido de absorbancia
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En un instrumento de ptica inversa, la muestra se ilumina con todas las longitudes de onda simultneamente, incluyendo luz de la longitud de onda de excitacin. Por tanto, la muestra fluoresce y emite luz pero, como la seleccin de longitud de onda ocurre despus de que la luz haya pasado a travs de la muestra, la luz emitida es dirigida a la longitud de onda correcta. La absorbancia medida a la longitud de onda de emisin es, por lo tanto, muy baja (Figura 54), pero la absorbancia medida a la longitud de onda de excitacin es correcta. Un factor adicional que afecta a la magnitud del error es el denominado ngulo de aceptacin del detector, Figura 55. La luz fluorescente se emite en todas direcciones. Si el ngulo de aceptacin es ancho, una parte significativa de la luz fluorescente alcanzar al detector. Por el contrario, si el ngulo de aceptacin del detector es estrecho, slo una pequea cantidad de luz fluorescente alcanzar el detector y el error de absorbancia ser tambin pequeo. Los instrumentos de ptica inversa tienen un ngulo estrecho de aceptacin del detector y por lo tanto son menos susceptibles al error de fluorescencia. Colocando un filtro en el haz de luz, puede eliminarse el error debido a la fluorescencia. En un instrumento convencional, el filtro se sita entre la muestra y el detector para filtrar las longitudes de onda de emisin, mientras que en un instrumento de ptica inversa, el filtro de coloca entre la fuente y la muestra para eliminar las longitudes de onda de excitacin.
Optica convencional Detector
Optica inversa Rendija detector
Figura 55 Angulos de aceptacin y magnitud del error de fluorescencia
Descomposicin de la muestra
Algunas muestras son sensibles a la reaccin fotoqumica, especialmente cuando se exponen a luz UV de baja longitud de onda. En casos extremos, puede ser necesario un filtro para eliminar esta luz.
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captulo 4
captulo 4
Desarrollo y validacin del mtodo
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Conocer los errores que pueden deberse al instrumento, al tratamiento de muestra y a la propia muestra, permite desarrollar mtodos analticos que minimicen sus efectos sobre los resultados. En este captulo se revisan los criterios para definir un buen mtodo y las estrategias para localizar los parmetros ptimos.
Desarrollo del mtodo
Debido a que la mayora de las aplicaciones UV-visible son la cuantificacin de un solo componente, este captulo est dirigido a la optimizacin de tales mtodos. El desarrollo del mtodo implica la seleccin de una o varias longitudes de onda que den lugar a los mejores resultados para un determinado anlisis o instrumento. En ste, deben definirse parmetros como exactitud, precisin, sensibilidad, linealidad, rango, selectividad y robustez. Como estos parmetros no pueden ser optimizados al mismo tiempo, debe determinarse antes del anlisis aquellos que se desea optimizar, as como los requisitos. Hasta hace poco, la instrumentacin limitaba la eleccin de longitud de onda (debido principalmente a problemas de reproducibilidad de ) y/o no se dispona de las herramientas adecuadas para comparar las opciones. Estas limitaciones ya no existen en los instrumentos modernos. NOTA: El desarrollo del mtodo implica el uso de varias herramientas estadsticas. Los detalles de estas herramientas y sus ventajas, estn fuera del objetivo de este libro, pero existen varias publicaciones excelentes.1215
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Linealidad Linealidad es la capacidad del mtodo para producir

resultados proporcionales, directamente o mediante una transformacin matemtica, a la concentracin del analito en las muestras, dentro de un determinado rango.16 En las medidas UV-visible, la relacin lineal ms usual es la ley de Beer, que indica que la absorbancia de un soluto es directamente proporcional a su concentracin (vea Ley de Beer en la pgina 16). Una curva de calibracin lineal que relacione la absorbancia con la concentracin, debe tener la forma:
A = kc
donde A es la absorbancia, c es la concentracin y k es el factor de calibracin (la pendiente de la curva de calibracin). Por lo tanto, al comprobar la linealidad se prueba cmo las medidas actuales se ajustan al modelo terico (ley de Beer). Tericamente slo se requiere la medida de absorbancia de un patrn de concentracin conocida, como calibrado para la cuantificacin. El valor medido de absorbancia dividido por la concentracin, es la pendiente. Varios parmetros instrumentales y de la muestra (vea el captulo 2 Instrumentacin y el captulo 3 Tratamiento y medida de muestra) pueden causar desviaciones de la ley de Beer y pueden resultar errores cuantitativos significativos si la curva de calibracin no est caracterizada con exactitud (Figura 56). Sin embargo, como estas desviaciones dependen de la longitud de onda, la seleccin del valor apropiado de sta puede minimizar su influencia sobre los resultados.
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Absorbancia [UA]
Absorbancia medida del patrn
rv Cu
e ad
ibr cal
n aci
ric t e
Posibles curvas de calibracin reales Absorbancia medida de la muestra

d rva Cu ec
t in rac alib
ic er
Concentracin conocida del patrn Concentracin
Posibles resultados de cuantificacin
Concentracin Figura 56 Errores potenciales resultantes de una calibracin inadecuada
Concentracin
Absorbancia [UA]
Para construir una curva de calibracin, deben medirse los espectros de un grupo de, al menos, tres disoluciones patrn del analito. Las concentraciones de los patrones deben encerrar el rango de concentracin esperado de las muestras de anlisis. Idealmente, todos los valores patrn medidos deben estar sobre una lnea recta, pero en la prctica, los valores siempre presentan cierta dispersin (Figura 57). Debe aplicarse un mtodo estadstico para encontrar el mejor ajuste de los datos a la curva de calibracin y, en una segunda etapa, para determinar qu tipo de curva de calibracin da lugar al mejor ajuste. El mtodo estadstico ms frecuente es la regresin lineal, que tambin se conoce como el mtodo de mnimos cuadrados. Para comparar dos curvas de calibracin, se requiere medir la bondad del ajuste de los patrones. Varios valores estadsticos, como el coeficiente de correlacin, el error estndar de regresin y la incertidumbre, pueden usarse para esta medida. De estos, el coeficiente de correlacin es el ms popular. Este valor siempre est entre + 1 y - 1. Un valor + 1 indica una relacin lineal perfecta entre absorbancia y concentracin, siendo A creciente. Un valor - 1 tambin
Absorbancia [UA]
Concentracin Figura 57 Grupos de datos de calibracin
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indica una relacin lineal perfecta, con A decreciente (lo que puede ocurrir si se usan derivadas). El valor 0 indica que no hay correlacin entre absorbancia y concentracin. Para determinar el mejor valor o combinacin de longitudes de onda, se miden los espectros de un grupo de patrones puros con un amplio rango de concentraciones. Se aplica una curva de calibracin lineal a cada longitud de onda y se calculan las estadsticas elegidas para valorar la linealidad. Para una evaluacin ms rpida, es til una representacin grfica de las estadsticas frente a la longitud de onda. La Figura 58 muestra los espectros de cuatro patrones de colorantes amarillos y el correspondiente coeficiente de correlacin para una curva de calibracin lineal simple. La mejor calibracin en trminos de la linealidad se realiza en el punto en el que el coeficiente de correlacin se aproxima a la unidad. En este ejemplo, la longitud de onda del mximo (414 nm) no es idntica a aquella (402 nm) que d lugar a la mejor linealidad. Tpicamente, pueden esperarse valores del coeficiente de correlacin mejores de 0.999.
Coeficiente correlacin
Absorbancia [UA]
Rango ptimo
Longitud de onda [nm] Figura 58 Seleccin de las longitudes de onda para la mejor linealidad
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Si una longitud de onda individual no proporciona el grado requerido de linealidad, puede utilizarse una combinacin de . Por ejemplo, el uso de una longitud de onda de referencia interna para eliminar los errores de variacin de lnea de base en las medidas, mejorar los resultados. Si no puede obtenerse el grado de linealidad deseado con una curva de calibracin lineal simple, puede aplicarse un tipo diferente de curva para minimizar la influencia de la no idealidad de los resultados. Tpicamente se utilizan ecuaciones de la forma:
A = a + kc A = kc + kc
y
2
A = a + kc + kc
De nuevo, debe utilizarse el coeficiente de correlacin u otra herramienta estadstica para valorar la calidad relativa de las curvas de calibracin. Observe que cuando se utilizan tipos de curva de calibracin con mayor grado de libertad, se requieren ms patrones para caracterizar adecuadamente la curva. Para anlisis multicomponente, tambin se supone que se cumple la ley de Beer. Sin embargo, en este caso, el modelo de clculo incluye la ley de aditividad para explicar la absorbancia total a cada longitud de onda. No puede usarse el test simple de linealidad descrito anteriormente. En su lugar, puede utilizarse la desviacin estndar del residual para probar el ajuste de los patrones al espectro medido. Este valor es la suma de los cuadrados de las diferencias a cada longitud de onda, entre el espectro medido y el calculado. Puede suponerse que si el residual es cero, es decir si los patrones pueden ajustarse perfectamente al espectro medido, la ley de Beer y la ley de aditividad se
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cumplen en el sistema en estudio. Si la desviacin estndar del residual no es cero, el modelo terico no refleja el sistema en estudio ya que una de las leyes no se obedece o porque est presente un componente para el que no hay patrn de calibracin. En la prctica, sin embargo, el residual nunca es cero y debe determinarse empricamente el valor aceptable para un anlisis, utilizando resultados analticos que cumplan los requisitos de exactitud y precisin.
Exactitud La exactitud de un mtodo es el grado de acuerdo entre el

resultado de un test individual generado por el mtodo y el valor verdadero.16 (Vea en el Apndice A una explicacin de la diferencia entre exactitud y precisin). Para determinar qu valor o valores de longitud de onda dan lugar a la mejor exactitud, se miden los espectros de un grupo de patrones y se construyen curvas de calibracin a todas las longitudes de onda, como se describi anteriormente. Se requiere, entonces, una muestra de concentracin conocida. Esta muestra es, idealmente, una en la que se haya determinado la concentracin del analito utilizando una tcnica diferente. Sin embargo, si no se dispone de esta muestra, puede prepararse una sinttica que contenga un peso conocido. Se mide el espectro de la muestra, se realiza la cuantificacin y se compara con el valor conocido. Una representacin grfica de los resultados cuantitativos frente a la longitud de onda, permite una rpida evaluacin. La Figura 59 muestra los resultados de un colorante amarillo. Aunque tendra que haberse fijado la longitud de onda analtica a 414 nm utilizando mtodos tradicionales, aquellos valores que dan lugar a la mejor exactitud estn en la regin de los 400 nm.
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Concentracin
Absorbancia [UA]
Concentracin medida Concentracin real
Rango ptimo
Longitud de onda [nm] Figura 59 Seleccin de las longitudes de onda para la mejor exactitud
Como el ruido puede influir en la exactitud de una medida, es preferible realizar una serie de medidas sobre la muestra y calcular la media. Este mtodo reduce la contribucin del ruido a errores en la exactitud. Sin embargo, en anlisis multicomponente con rangos espectrales, no puede deducirse el rango ptimo de longitud de onda utilizando una tcnica tan simple. En su lugar, debe determinarse el mejor rango a travs de un proceso de tanteo del rango de longitud de onda y comparando los resultados calculados con los valores actuales.
Precisin La precisin de un mtodo es el grado de acuerdo entre los

resultados de los tests individuales cuando el procedimiento se aplica repetidamente a mltiples muestreos.16 (Vea en el Apndice A una explicacin de la diferencia entre exactitud y precisin). Para determinar la precisin se requiere un valor estadstico. La desviacin estndar, el porcentaje de desviacin
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estndar relativa (obtenido dividiendo la desviacin estndar por la media y multiplicando por 100) y el intervalo de confianza, son las funciones ms populares para valorar la precisin o repetitividad de un grupo de medidas. Para determinar la precisin de un mtodo, se preparan un grupo de unas 1020 muestras con la misma concentracin. Entonces, se miden estas muestras y se calcula la cantidad de analito. La desviacin estndar de los resultados es una medida de la precisin. La Figura 60 muestra un ejemplo de la dispersin de los resultados y de la desviacin estndar que pueden esperarse de un buen anlisis.
Valor [mg/l]
Media = 31.41 mg/l Desviacin estndar = 0.022 mg/l
Nmero de medidas Figura 60 Determinacin de la precisin de un anlisis
Si no se obtiene el nivel deseado de precisin, deben utilizarse tcnicas de reduccin de ruido como promedio de longitud de onda, promedio de tiempo y referencia interna, para mejorar los valores. Pueden aplicarse las mismas tcnicas en anlisis multicomponente.
Sensibilidad Sensibilidad se refiere a la respuesta obtenida para una

determinada cantidad de analito y, a menudo, se indica mediante dos factores analticos: el lmite de deteccin (LOD) y el lmite de cuantificacin (LOQ).16
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El LOD es la concentracin ms baja del analito que puede ser detectada pero no necesariamente cuantificada, en matrices de muestra. En general, el LOD es el punto al que la seal del analito es igual a tres veces el ruido de la medida. Los resultados de las medidas de algunos espectrofotmetros listan las desviaciones estndar basadas en el ruido de la medida. El LOD es, aproximadamente, tres veces la desviacin estndar. El LOQ es la concentracin ms baja del analito que puede determinarse con una precisin y exactitud aceptables, en matrices de muestra. Para calcular el LOQ, deben definirse los lmites aceptables de precisin y exactitud (que dependen de los objetivos del anlisis). Entonces, pueden utilizarse las herramientas descritas anteriormente, para determinar los lmites aceptables. A menudo se supone que la longitud de onda con la mxima absorbancia da lugar a la mejor sensibilidad. Sin embargo, como el ruido instrumental puede variar significativamente con la longitud de onda, esto no siempre es necesariamente cierto. Un mtodo mejor de determinar el valor o valores de longitud de onda de sensibilidad ptima, es medir el espectro de una muestra de baja concentracin, varias veces. Se calculan, entonces, la media y el porcentaje de desviacin estndar relativa de los valores medidos a cada longitud de onda. El valor de con el porcentaje de desviacin estndar relativa ms bajo, probablemente dar lugar a la mejor sensibilidad. La Figura 61 ilustra esta tcnica para un colorante amarillo. Aunque las longitudes de onda entre 400 y 450 nm ofrecen una sensibilidad excelente, la mejor se obtiene a 220 nm.
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Absorbancia [UA]
% RSD
Rango ptimo
Longitud de onda [nm] Figura 61 Seleccin de las longitudes de onda de mejor sensibilidad
En anlisis multicomponente, puede utilizarse esta tcnica para identificar los valores ptimos de longitud de onda para cada componente. Estas pueden aplicarse directamente en el mtodo de ecuaciones simultneas simples o como una gua del rango ptimo de longitud de onda, en el mtodo de mnimos cuadrados.
Rango Rango es el intervalo entre (e incluidos) los niveles

superior e inferior del analito, que han sido calculados con la precisin, exactitud y linealidad requeridos.16 El rango se determina analizando primero, muestras que contengan distintas concentraciones del analito y, a continuacin, utilizando las herramientas descritas anteriormente para calcular la linealidad, precisin y exactitud de los resultados.
Selectividad Selectividad es la capacidad de un mtodo para

cuantificar con exactitud y especificamente al analito o analitos, en presencia de otros compuestos.16
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La presencia de cualquier otro compuesto que absorba a la longitud de onda utilizada para cuantificar el analito, resultar en un error cuantitativo. Estos otros compuestos pueden ser precursores de la sntesis, impurezas conocidas, excipientes o productos de degradacin de la matriz. Si el tipo de interferencia es conocido, la persona que desarrolla el mtodo puede examinar los espectros del analito y de la interferencia, para seleccionar una longitud de onda a la que el analito tenga una absorbancia significativa pero a la que sea pequea la de la interferencia. Si la eleccin de no evita lo suficiente el efecto de la interferencia, puede aplicarse una tcnica de correccin apropiada, como el uso de una longitud de onda de isoabsorbancia (vea Isoabsorbancia en la pgina 72). Si la identidad y/o los espectros de las posibles interferencias son desconocidos, puede utilizarse un mtodo emprico casi idntico al descrito anteriormente, para determinar qu longitud o longitudes de onda darn lugar a la mejor exactitud. En este caso, las muestras de test deben contener la interferencia. Si se conoce la concentracin del analito en la muestra, la longitud de onda que d el resultado ms cercano al valor conocido, ser la correspondiente a la mejor selectividad (las impurezas siempre aaden absorbancia, causando resultados errneamente elevados). En el ejemplo de la Figura 62, la muestra de colorante amarillo ha sido contaminada con un colorante rojo. La representacin de la concentracin frente a la longitud de onda muestra que las entre 390 y 420 nm dan lugar a la mejor selectividad. Observe que, debido al contaminante, el rango del error de exactitud es mucho ms amplio que para el colorante amarillo puro (Figura 59).
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Concentracin [mg/l]
Absorbancia [UA]
Concentracin medida Concentracin real
Rango ptimo
Longitud de onda [nm] Figura 62 Seleccin de la longitud de onda para la mejor selectividad
Robustez Robustez es el grado de reproducibilidad de los resultados

de test, obtenidos analizando las mismas muestras bajo varias condiciones normales de test.16 El mtodo no debe afectarse por cambios de tiempo o lugar. La reproducibilidad del mtodo debe establecerse en varias condiciones, por ejemplo con diferentes lotes de reactivos, a diferentes temperaturas y con diferentes tiempos de prueba. La robustez de un mtodo analtico se determina analizando submuestras de una muestra homognea, en diferentes laboratorios y con equipos distintos. Estos tests deben realizarlos diferentes analistas bajo condiciones operacionales y medioambientales que pueden variar, pero que estarn dentro de los parmetros especificados para el mtodo. El grado de reproducibilidad de los resultados se calcula, entonces, como una funcin de las variables del ensayo. Este valor puede compararse con la precisin del mtodo en condiciones normales para obtener una medida de su robustez.
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Requisitos En el desarrollo de un mtodo analtico, son valiosos los instrumentales datos espectrales completos, aunque no esenciales, para la
evaluacin de todas las opciones posibles. La reproducibilidad de longitud de onda del instrumento tambin debe ser excelente para no restringir la eleccin de la longitud o longitudes de onda. Un espectrofotmetro que mide automticamente espectros mltiples y calcula los valores medio y de desviacin estndar para cada absorbancia, puede mejorar la productividad en gran medida. Finalmente, el software instrumental debe ser capaz de procesar una gran cantidad de datos y utilizar las herramientas estadsticas apropiadas. Los clculos manuales o la transferencia de los datos desde el espectrofotmetro a otras aplicaciones para su evaluacin, limitan seriamente la productividad.
Validacin del mtodo
Cualquier mtodo analtico diseado para ser utilizado en un entorno que cumpla las normativas, como un laboratorio de control de calidad farmacutico, debe ser validado. La validacin del mtodo es el proceso para determinar si las caractersticas de rendimiento son adecuadas para el propsito que se pretende. La Farmacopea de Estados Unidos (USP) contiene guas para la validacin del mtodo.17 Esta validacin es similar al desarrollo del mtodo que incluye estudios sobre especificidad, linealidad, exactitud o recuperacin, sensibilidad y precisin o reproducibilidad. Sin embargo, la validacin debe realizarse separadamente del desarrollo y la validacin del mtodo.16 Mientras que el desarrollo del mtodo implica la seleccin de parmetros y condiciones especficos, la validacin se utiliza para confirmar que las caractersticas de rendimiento del mtodo estn de acuerdo con la aplicacin pretendida de los estudios del laboratorio.
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captulo 5
captulo 5
Operacin de rutina
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Operacin de rutina
La espectroscopa UV-visible se considera una tcnica de rutina y ampliamente utilizada en QA/QC y laboratorios similares. Sin embargo, ni las consideraciones tratadas en los captulos previos ni el mejor desarrollo de mtodo, garantiza buenos resultados. Este captulo revisa las etapas para asegurar resultados exactos y precisos regularmente y, quizs ms importante, para detectar resultados errneos.
Verificacin del rendimiento del instrumento
En los ltimos aos, las normas de calidad indicadas por la ISO 9000 (BS 5750), las Buenas Prcticas de Laboratorio (GLP), las Buenas Practicas de Fabricacin (GMP) y el United Kingdom National Measurement Accreditation Service (NAMAS) han cobrado una gran importancia. Como consecuencia, en la industria farmacutica, las recomendaciones contenidas en las farmacopeas tambin han alcanzado mayor influencia. La verificacin del rendimiento continuo y apropiado de los espectrofotmetros UV-visible, es un elemento clave de estos requisitos de calidad.
Parmetros de test Aunque no hay una definicin clara sobre qu parmetros

deben probarse para verificar el rendimiento del instrumento, los fabricantes y usuarios, generalmente, estn de acuerdo en que deben incluirse los criterios descritos a continuacin.
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Operacin de rutina
Exactitud y precisin de longitud de onda
La exactitud de longitud de onda es el criterio de rendimiento ms importante para diferenciar espectros, cuando se miden en instrumentos distintos. Tambin es importante en el anlisis cuantitativo cuando se utilizan coeficientes de extincin o factores. Debido a que estos factores dependen de la longitud de onda, las medidas deben realizarse a exactamente la misma a la que los factores se determinaron originalmente. Cuando se comparan espectros o valores de absorbancia medidos en el mismo instrumento (como en la mayora de los anlisis cuantitativos en los que se mide un patrn), sin embargo, la precisin de longitud de onda es el parmetro crtico (vea Exactitud y precisin de longitud de onda en la pgina 50). Para medir la exactitud y precisin de longitud de onda, se requiere un patrn de referencia. Idealmente, este patrn debera tener picos bien definidos y muy estrechos, a una serie de longitudes de onda a lo largo de los rangos UV y visible, como se muestra en la Figura 63. Este patrn ideal no existe, aunque algunos se aproximan. Para los patrones actuales de exactitud de longitud de onda, como los picos no son idealmente simtricos, los cambios en la anchura de la rendija del instrumento afectarn ligeramente a la posicin medida de los picos.
Patrn de absorbancia Absorbancia [UA] Patrn de longitud de onda
Longitud de onda [nm] Figura 63 Espectros ideales de patrones de absorbancia y longitud de onda
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Operacin de rutina
Exactitud y precisin fotomtrica
La exactitud fotomtrica es el criterio ms importante para el anlisis cuantitativo cuando se utilizan coeficientes de extincin o factores. Sin embargo, para medidas comparativas (como las anteriores), la precisin fotomtrica es el parmetro crtico (vea Exactitud y precisin fotomtrica en la pgina 51). Es necesario un patrn de referencia para medir la exactitud y la precisin fotomtrica. Idealmente, este patrn tendra absorbancia constante a todas las longitudes de onda a lo largo de los rangos UV y visible (Figura 63), de manera que un error de exactitud de longitud de onda no afecta a los resultados. En la prctica, no existe tal patrn, aunque los cristales de densidad neutra se aproximan al ideal en el rango de longitud de onda visible. Los patrones utilizados, tpicamente, tienen picos anchos y valles.
Luz dispersa
La luz dispersa es el factor que ms afecta a la relacin lineal entre la absorbancia y la concentracin a absorbancias elevadas. Introduce una predisposicin sistemtica a menores absorbancias en concentraciones crecientes. La luz dispersa es tambin la influencia principal en el lmite superior del rango dinmico lineal para un anlisis (vea Luz dispersa en la pgina 51). Para medir la luz dispersa, es necesario un filtro. Idealmente, este filtro absorbera toda la luz de la longitud de onda a la que que se va a realizar la medida y transmitira las longitudes de onda superiores o inferiores (los orgenes de la luz dispersa, como se muestra en la Figura 64). En la prctica, sin embargo, este filtro no existe. En su lugar se utilizan filtros de corte que transmiten toda la luz por encima o por debajo de una determinada longitud de onda y que bloquean toda la luz en un rango particular de .
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Operacin de rutina
Transmitancia [%]
Longitud de onda [nm] Figura 64 Espectro ideal de un filtro de luz dispersa
Resolucin
La resolucin es un factor crtico en la determinacin de la forma de los picos. En general, la resolucin instrumental debe ser aproximadamente 10 veces mejor que la anchura de banda del pico medido. Si la resolucin instrumental no es suficiente, la absorbancia medida en el mximo de longitud de onda ser demasiado baja. Por consiguiente, la exactitud fotomtrica tiene una predisposicin sistemtica. Esta predisposicin juega un papel clave si es esencial la exactitud absoluta pero, como se trata en Resolucin espectral en la pgina 46, es menos importante para medidas relativas como las de cuantificacin. Medir la resolucin es difcil y, a menudo, se utilizan mtodos empricos como la medida de alturas relativas de picos y valles, para una muestra con una banda estrecha (vea Resolucin en la pgina 110).
Ruido
El ruido es el factor principal que afecta a la precisin de las medidas de absorbancia. Es especialmente significativo a bajas absorbancias, a las que suele determinarse el lmite de deteccin (vea Ruido en la pgina 52). El ruido se mide, normalmente, a absorbancia cero, es decir, sin muestra en el paso de luz.
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Operacin de rutina
LLanura de la lnea de base
Medir el ruido a todas las longitudes de onda, normalmente, no es practicable. Sin embargo, la llanura de la lnea de base indica el ruido relativo a todas las longitudes de onda y revela aquellas con problemas instrumentales resultantes del cambio de filtro o fuente, por ejemplo. La llanura de lnea de base se mide, normalmente, a absorbancia cero.
Estabilidad
La estabilidad afecta a la exactitud de las medidas de absorbancia en funcin del tiempo. La deriva de las medidas de absorbancia introduce errores sistemticos en la exactitud fotomtrica (vea Deriva en la pgina 55). La estabilidad se mide, normalmente, a absorbancia cero.
Linealidad
La linealidad a menudo se considera importante para verificar el rendimiento. Pero debido a que depende mucho de la muestra, creemos que se mide mejor durante un test de idoneidad del sistema, como se describe posteriormente. El problema principal en la verificacin del rendimiento es que todos los parmetros listados anteriormente dependen de la longitud de onda y, en el caso de la luz dispersa, de la muestra. Como no es prctico realizar todos los tests a todas las , deben seleccionarse algunas representativas para el propsito pretendido. Los resultados de estos tests deben compararse con las especificaciones absolutas de rendimiento para los mtodos en uso. La verificacin demostrar, entonces, eficazmente, si las caractersticas de rendimiento han cambiado de manera que pudiera afectar a la bondad de los resultados analticos. Cumplir los criterios anteriores (determinados utilizando patrones de referencia) no garantiza, sin embargo, que un deteminado anlisis pueda realizarse con la exactitud y linealidad requeridas. Debido a que muchos parmetros dependen de la muestra, la exactitud y linealidad deseadas slo pueden lograrse con un test apropiado de idoneidad del sistema, realizado sobre la propia muestra.
100
Operacin de rutina
Patrones Una discusin detallada sobre todos los patrones y sus

ventajas y desventajas relativas, est fuera del objetivo de este libro. Existen varias publicaciones excelentes que cubren estos temas en profundidad.18,19 A continuacin encontrar algunos comentarios generales sobre los mritos relativos de los tres tipos principales de patrones. Patrones de emisin Ciertas fuentes de emisin, como las lmparas de mercurio y deuterio, exhiben lneas agudas a longitudes de onda especficas que son ideales para los test de exactitud y precisin de longitud de onda. De hecho, en muchos espectrofotmetros modernos, se utilizan las lneas de deuterio a 486.0 y 656.1 nm de la fuente incorporada, para comprobar y recalibrar la exactitud de longitud de onda. Sin embargo, las fuentes de emisin requieren alimentacin elctrica y, si el instrumento ha sido auto-calibrado utilizando su lmpara de deuterio, debe utilizarse otro patrn para verificacin. Adems, debido a que las fuentes de emisin no son muestras tpicas, no prueban el sistema completo. Los patrones slidos no requieren ninguna preparacin, son fciles de usar y mantener, son relativamente insensibles a la temperatura y tienen una buena estabilidad con el tiempo. Sin embargo, con patrones slidos no puede asegurarse la homogeneidad de un patrn a otro o entre lotes. Por lo tanto, debe calibrarse cada patrn individualmente en un espectrofotmetro de referencia. Debido a que este proceso implica cierto tiempo, los patrones slidos tienden a ser caros. Adems, como los patrones slidos no son absolutamente estables, deben devolverse para ser recalibrados, con regularidad. Por ltimo, estas muestras deben mantenerse escrupulosamente limpias y no pueden utilizarse para probar sistemas de flujo.
Patrones slidos de absorcin
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La Tabla 5 resume algunos de los patrones slidos ms conocidos, sus usos, sus ventajas y desventajas.
Tabla 5 Patrn Cristal de xido de holmio Cristal de xido de didimio Granate de neodimio ytrio aluminio Cristal de densidad neutra Metal sobre cuarzo Uso Patrn de longitud de onda Patrn de longitud de onda Patrn de longitud de onda Patrn fotomtrico
Algunos patrones slidos Ventajas Picos a muchas longitudes de onda de 280 a 2000 nm Picos a muchas longitudes de onda de 400 a 1920 nm Picos a muchas longitudes de onda de 350 a 1000 nm Perfil de absorbancia muy llano en el rango visible de longitud de onda Perfil de absorbancia muy llano en los rangos UV y visible de longitud de onda Desventajas La posicin de los picos vara de lote a lote La posicin de los picos vara de lote a lote No hay picos por debajo de 400 nm No hay picos por debajo de 350 nm No es adecuado para el rango UV No es absolutamente estable; debe recalibrarse regularmente Problemas frecuentes por error de interreflexin Sensible a la temperatura No es muy estable; debe recalibrarse regularmente
Patrn fotomtrico
Patrones lquidos de absorcin
Estos normalmente son patrones fsicos absolutos. En otras palabras, si se preparan patrones lquidos utilizando materiales puros apropiadamente, poseern de modo inherente las propiedades de absortividad, mximos de picos, etc. requeridos para comprobar la exactitud. Debido a que la calibracin de las disoluciones no es necesaria, los patrones lquidos pueden ser relativamente baratos. Estos patrones pueden utilizarse tambin para comprobar sistemas de flujo. Adems, el proceso de utilizar una disolucin como patrn, es muy similar al de una muestra normal. La desventaja principal de los patrones lquidos es que, en general, deben haberse preparado recientemente. Esto implica tiempo y requiere una razonable habilidad del operador. Algunos proveedores han intentado solventar este problema suministrando patrones sellados en cubetas. Sin embargo, debido a que la propia cubeta contribuye con
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algo de absorbancia, estos patrones deben calibrarse y recalibrarse individualmente, lo que incrementa los costes. Ms an, como los patrones lquidos son menos estables que los slidos, deben recalibrarse ms a menudo. Ahora puede disponerse de disoluciones preparadas selladas en ampollas, para utilizar en cubetas normales, fciles de utilizar y de coste adecuado.20 La Tabla 6 resume algunos de los patrones lquidos ms conocidos, sus usos, sus ventajas y sus desventajas.
Tabla 6 Patrn Oxido de holmio en cido perclrico Oxido de samario en cido perclrico Benceno (vapor) Dicromato potsico en cido perclrico o sulfrico Mezcla de sales de cobalto y nquel Uso
Algunos patrones lquidos Ventajas Picos a muchas longitudes de onda de 240 a 650 nm Picos a muchas longitudes de onda de 300 a 500 nm Desventajas No hay picos utilizables por encima de 650 nm No hay picos utilizables por encima de 500 nm
Patrn de longitud de onda Patrn de longitud de onda Patrn de longitud de onda Patrn fotomtrico
Picos muy estrechos de 230 a 260 nm Rango muy limitado de longitud de onda Picos anchos a 257 y 350 nm y valles No absorbancia en el rango visible anchos a 235 y 313 nm Muy sensible al pH y, como agente oxidante potente, puede ser inestable Picos a 302, 395, 512 y 678 nm que cubren las regiones UV y visible Cortes a 390 nm Usado para medir luz dispersa a 340 nm o inferior Cortes a 260 nm Usado para medir luz dispersa a 200 nm o inferior Bandas ms bien estrechas, la exactitud de puede afectar a los resultados Ninguna
Patrn fotomtrico
Disolucin de nitrito sdico (50 g/l) Luz dispersa
Disolucin de ioduro potsico o sdico (10 g/l)
Luz dispersa
Tendencia a descomponerse
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Tabla 6 Patrn Disolucin de cloruro potsico (12 g/l) Uso Luz dispersa
Algunos patrones lquidos Ventajas Cortes a 200 nm Usado para medir luz dispersa a 220 nm o inferior Fcil mtodo emprico usando pico (269 nm) y valle (266 nm) del espectro del tolueno Desventajas Como la medida se realiza en el lateral de la pendiente de corte, los errores de exactitud de pueden afectar a la medida de luz dispersa Slo puede usarse para determinar la resolucin en un punto del espectro. Puede variar con
Tolueno en hexano
Resolucin
Requisitos de las En la seccin siguiente se revisan algunos de los requisitos normas ms importantes de las normativas que regulan el uso de los
espectrofotmetros UV-visible. GLP/GMP Los requisitos de las GLP y GMP para la validacin de instrumentos, puede resumirse como sigue: Verificacin documentada de que el sistema o subsistema funciona como se pretende en rangos operativos representativos o anticipados.21 Para espectroscopa, se indica la siguente recomendacin: Donde sea apropiado, deben llevarse a cabo controles peridicos del rendimiento (por ejemplo, ... la resolucin, alineamiento y exactitud de longitud de onda de los espectrofotmetros, etc.).22 Farmacopea europea Los requisitos que regulan los espectrofotmetros UV-visible utilizados para anlisis farmacutico en Europa, estn contenidos en la Farmacopea Europea (EP).23 Estos requisitos se basan y prcticamente son idnticos a aquellos listados en las farmacopeas nacionales como la Britnica (BP) y la Alemana (DAB): Control de longitudes de ondaVerificar la escala de utilizando los mximos de absorcin de una disolucin de perclorato de holmio, la lnea de una lmpara de descarga
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de hidrgeno o deuterio o las de arco de vapor de mercurio, mostradas a continuacin. La tolerancia permitida es 1 nm para el ultravioleta y 3 nm para el visible. 241.15 nm (Ho) 253.70 nm (Hg) 287.15 nm (Ho) 302.25 nm (Hg) 313.16 nm (Hg) 334.15 nm (Hg) 361.50 nm (Ho) 365.48 nm (Hg) 404.66 nm (Hg) 435.83 nm (Hg) 486.00 nm (D) 486.10 nm (H) 536.30 nm (Ho) 546.07 nm (Hg) 576.96 nm (Hg) 579.07 nm (Hg)
Control de absorbanciaComprobar la absorbancia utilizando disolucin de dicromato potsico R a las longitudes de onda indicadas en la siguiente tabla, que muestra para cada longitud de onda el valor exacto de A (1 por ciento, 1 cm) y los lmites permitidos.
Longitud de onda (nm) 235 257 313 350
A (1 por ciento, 1 cm) Tolerancia mxima 124.5 144.0 48.6 106.6 122.9 a 126.2 142.4 a 145.7 47.0 a 50.3 104.9 a 108.2
Lmite de luz dispersaLa luz dispersa puede detectarse a una longitud de onda dada, con filtros o disoluciones adecuados: por ejemplo la absorbancia de una disolucin de cloruro potsico R del 1.2 por ciento m/V en una cubeta de 1 cm, debe ser mayor de 2 a 200 nm al compararla con agua como lquido de compensacin. Poder de resolucinCuando se indique en una monografa, mida la resolucin del aparato como sigue:
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registrar el espectro de una disolucin de tolueno R al 0.02 % V/V en hexano R. La relacin mnima de la absorbancia en el mximo a 269 nm, a aquella en el mnimo a 266 nm, se indica en la monografa. NOTA: La BP indica que la relacin debe ... no ser inferior a 1.5 a no ser que se indique lo contrario en la monografa. Farmacopea de Estados Unidos En los Estados Unidos, los requisitos para los espectrofotmetros UV-visible no estn tan claramente definidos como en Europa. La Farmacopea24 de Estados Unidos (USP) XII, Seccin 831 (Espectrofotometra y dispersin de luz) dice: Comprobar la exactitud de la calibracin del instrumento. ... La escala de longitud de onda puede calibrarse tambin por medio de filtros adecuados de cristal, con bandas de absorcin tiles en las regiones visible y ultravioleta. Han sido ampliamente utilizados cristales patrn con didimio (una mezcla de praseodimio y neodimio). El cristal con contenido de holmio se considera superior. Para comprobar una escala fotomtrica, puede disponerse de varios filtros patrn de cristal inorgnico, as como disoluciones patrn de transmitancia conocida, como cromato o dicromato potsico. Este ltimo contiene una referencia cruzada: Para ms detalles relativos a los controles de las escalas de longitud de onda y fotomtricas de un espectrofotmetro, pueden consultarse las siguientes publicaciones del National Institute of Standards and Technology ... El National Institute of Standards and Technology (NIST) indica varios patrones slidos y lquidos para determinar la
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exactitud de longitud de onda, exactitud fotomtrica y luz dispersa.25 La Tabla 7 resume los ms importantes.
Tabla 7 SRM # 930 931 Tipo Filtros de cristal de densidad neutra
Patrones NIST
Descripcin NIST Este SRM es para la verificacin y calibracin de las escalas de transmitancia y absorbancia de espectrofotmetros de absorcin visible.
Disolucin de cobalto y nquel en Este SRM es para la verificacin y calibracin de las escalas de absorbancia de espectrofotmetros de absorcin ultravioleta y visible con pasos de banda estrechos. mezcla de cido ntrico y perclrico Dicromato potsico slido para preparar la disolucin de test Metal sobre cuarzo Este SRM es para la verificacin y calibracin de las escalas de absorbancia de espectrofotmetros de absorcin ultravioleta. Este SRM es para la verificacin y calibracin de las escalas de transmitancia y absorbancia de espectrofotmetros de absorcin ultravioleta y visible.
935 2031 2034
Disolucin de xido de holmio en Este SRM es para utilizar en la verificacin y calibracin de la escala de longitud de onda de cido perclrico espectrofotmetros de absorcin ultravioleta y visible con anchuras de banda espectral nominal que no exceden 3 nm. Ioduro potsico slido para preparar la disolucin de test Este SRM se utiliza en la valoracin de la energa radiante dispersa heterocrmica (luz dispersa) en espectrofotmetros de absorcin ultravioleta.
2032
Mtodos americanos de test estndar
La American Standard Testing Methods (ASTM)26 publica mtodos de test para medir las caractersticas clave del rendimiento, de los espectrofotmetros UV-visible: Exactitud y precisin de longitud de onda: determinada utilizando una lmpara de descarga de vapor de mercurio (regin UV), una lmpara de arco de deuterio o hidrgeno (regin visible), vapor de benceno (regin UV), o cristal de xido de holmio o disolucin de perclorato de holmio (regiones UV y visible). La ASTM recomienda que las longitudes de onda de calibracin utilizadas, encierren a la longitud de onda analtica. Linealidad: determinada preparando una curva de trabajo analtica con el analito de inters (vea Idoneidad del sistema en la pgina 115).
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Exactitud fotomtrica: determinada utilizando patrones NIST 930, 2031 o 935. Precisin fotomtrica: determinada utilizando una pantalla metlica o un filtro adecuado de cristal. La importancia de la anchura de la rendija y la resolucin se menciona en la documentacin ASTM, pero no se indica ningn mtodo prctico para medir estos parmetros. Una publicacin ASTM adicional27 describe los patrones y procedimientos para medir la luz dispersa. La Tabla 8 resume los requisitos y recomendaciones de varios estamentos reguladores.
Tabla 8
Parmetros de test y patrones usados por las principales agencias reguladoras NIST USP SRM X X X X 2034 935 930 931 2031 2032
Tipo de test
Patrn
EP ASTM S S S S S S X X X X X X X X X X X X
Exactitud de Solucin de perclorato de holmio longitud de onda Cristal de xido de holmio Lmpara de arco de deuterio Lmpara de arco de mercurio Vapor de benceno Exactitud fotomtrica y linealidad Disolucin de dicromato potsico Cristal de densidad neutra Solucin sales de cobalto y nquel Metal sobre cuarzo Luz dispersa Disolucin de cloruro potsico Disolucin de ioduro potsico Disolucin de ioduro sdico Disolucin de nitrito sdico Resolucin Tolueno en disolucin de hexano
USP: Slo mtodo de test
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NIST SRM: Material patrn y mtodo de test EP: Mtodo de test y especificacin de rendimiento mnimo ASTM: Slo mtodo de test
La eleccin de patrones depende de los anlisis a realizar en el instrumento. Est condicin est sealada en los requisitos GLP, de manera que la verificacin debe realizarse para los rangos de operacin pretendido y anticipado; en las recomendaciones ASTM, de manera que las longitudes de onda utilizadas para calibracin encierren la longitud de onda analtica; y en las normas NIST. As por ejemplo, si el propsito es medir la absorbancia en la regin UV (como en la mayora de los anlisis farmacuticos), la exactitud fotomtrica debe verificarse no en el rango visible sino en el UV, preferiblemente a varias longitudes de onda. De modo similar, no es apropiado verificar la exactitud de longitud de onda slo en la lnea del deuterio 656.1 nm, ya que ste no es un indicador fiable de la exactitud de longitud de onda en la regin UV.
Recomendaciones Aunque no hay un grupo definitivo de patrones para

verificar el rendimiento de un espectrofotmetro, se recomiendan los siguientes tests para aquellos usuarios que analizan, principalmente, muestras lquidas y que necesitan cumplir con los requisitos generales de las normas. Exactitud de longitud de onda: disolucin de perclorato de holmio (40 g/l xido de holmio en cido perclrico al 10 % v/v). La Figura 65 muestra el espectro de esta disolucin, medido en un espectrofotmetro Agilent 8453.
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Absorbancia [UA]
Longitud de onda [nm] Figura 65 Espectro de disolucin de perclorato de holmio
La Tabla 9 muestra los valores especificados por el NIST para los picos de referencia utilizables para tres anchuras de banda espectral instrumental (SBWs) diferentes. Estos valores son preferibles a los EP ya que stos no especifican
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la SBW ni la temperatura utilizada y porque los valores EP y NIST exhiben una discrepancia significativa.
Tabla 9
Valores NIST para picos de disolucin de perclorato de holmio28 SBW 0.5 nm 241.01 249.79 278.13 287.01 333.43 345.52 361.33 385.50 416.09 467.80 485.27 536.54 640.49 1.0 nm 241.08 249.87 278.10 287.18 333.44 345.47 361.31 385.66 416.28 451.30 467.83 485.29 536.64 640.52 2.0 nm 240.90 249.98 278.03 287.47 333.40 345.49 361.16 385.86 416.62 451.30 467.94 485.33 536.97 640.48
Exactitud fotomtrica: disolucin de dicromato potsico (aproximadamente 60 mg/l en cido sulfrico 0.01N). La Figura 66 muestra el espectro del dicromato potsico. Los valores EP para este patrn, se presentan en la pgina 104.
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Absorbancia [UA]
Longitud de onda [nm] Figura 66 Espectro del dicromato potsico
Si las medidas van a realizarse en la regin visible, se aconseja realizar test adicionales con filtros de cristal de densidad neutra, como el NIST SRM 930. Luz dispersa: disoluciones de nitrito sdico (50 g/l), ioduro sdico (10 g/l) y cloruro potsico (12 g/l) en agua. Estas tres disoluciones permiten la medida de luz dispersa a tres longitudes de onda diferentes. La Figura 67 muestra los espectros de estas disoluciones. En general, se recomiendan nitrito sdico e ioduro sdico o potsico, pero para aquellos usuarios que necesiten cumplir con los requisitos de la EP, tambin puede ser necesario cloruro potsico.
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Transmitancia [%]
Longitud de onda [nm] Figura 67 Espectros de disoluciones patrn de luz dispersa
Resolucin: disolucin de tolueno en hexano (0.02 % v/v), segn se especifica en la EP. La Figura 68 representa el espectro de esta disolucin.
Absorbancia [UA]
Longitud de onda [nm] Figura 68 Espectro de tolueno en hexano
La resolucin se estima tomando la relacin de la absorbancia en el mximo cercano a 269 nm, a aquella en el mnimo prximo a 266 nm. Esta relacin est empri-
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camente relacionada con la SBW, como se muestra en la Tabla 10.29
Tabla 10
SBW y relacin 269/266 nm (tolueno) Relacin de la absorbancia a 269 nm a la absorbancia a 266 nm 2.30 2.20 2.00 1.40 1.10 1.00
SBW (nm) 0.25 0.50 1.00 2.00 3.00 4.00
Tambin deben medirse con el rea de muestra limpia, el ruido, llanura de la lnea base y deriva. No se requieren patrones.
Autotest del instrumento
La verificacin completa del rendimiento de un espectrofotmetro, necesita tiempo y por consiguiente, normalmente slo se realiza a intervalos peridicos. Estos intervalos se determinan de acuerdo con la estabilidad del instrumento. Para asegurar que se detecta cualquier desviacin del rendimiento que ocurra entre verificaciones regulares, el instrumento debe estar equipado con rutinas auto-test que puedan ejecutarse diariamente. Estas rutinas deben incluir un control de la operacin electrnica y ptica del espectrofotmetro, as como controles de exactitud de longitud de onda con una o ambas lneas de la lmpara de deuterio.
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Operacin de rutina
Idoneidad del sistema
La idoneidad del sistema est diseada para evaluar los componentes del sistema analtico, para verificar que el rendimiento del sistema cumple los estndares requeridos por el mtodo. La idoneidad del sistema no debe confundirse con la validacin del mtodo. Mientras la validacin se realiza una vez al finalizar el desarrollo del mtodo, los tests de idoneidad del sistema se ejecutan peridicamente para determinar si todo es adecuado y/o su eficacia. Los requisitos de idoneidad del sistema estn bien definidos para los sistemas cromatogrficos pero no para los sistemas de espectroscopa UV-visible. En la prctica, los analistas han desarrollado sus propias estrategias para realizar los test de idoneidad del sistema en instrumentos UV-visible. Dos ejemplos son: A. Medir y calibrar utilizando un patrn de concentracin igual al 100 % de la concentracin del componente esperado. Entonces, medir y cuantificar el patrn diluido por un factor de dos. Los resultados de ambas muestras deben caer dentro de un porcentaje especificado de la concentracin conocida. Volver a medir el patrn confirma la exactitud de la medida inicial. B. Primero medir el patrn y a continuacin, una serie de diluciones del mismo y calcular el coeficiente de extincin (absorbancia dividida por concentracin) para cada concentracin. Los valores de los coeficientes de extincin no deben variar ms de un porcentaje especificado.
Operacin apropiada
Sin embargo, buenas medidas del control de calidad, como test de verificacin del rendimiento del instrumento y validacin del mtodo, as como resultados exactos y precisos, dependen en gran medida del factor humano. Aunque este factor no puede eliminarse nunca, pueden tomarse ciertas medidas para reducir el error humano.
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Almacn electrnico Los espectrofotmetros modernos estn casi todos

controlados por microprocesador u ordenador y ofrecen un almacenaje electrnico de los parmetros de mtodos. Idealmente, todos los parmetros importantes deben almacenarse en un solo fichero de mtodo, con un nombre nico. Cuando el operador introduce el nombre del mtodo, todos los parmetros deben fijarse automticamente, eliminando errores potenciales. En particular los entornos regulados, se beneficiarn de un sistema que evita que los operadores cambien parmetros de los mtodos o que mantienen un seguimiento e informan de cualquier cambio.
Procedimientos Aunque los espectrofotmetros pueden almacenar y, autoestndar de operacin mticamente, fijar parmetros, algunos procesos (como
vaciar, enjuagar y llenar cubetas) debe realizarlas el operador, pudiendo introducir errores. Los operadores deben estar entrenados en estos procesos y todos los pasos deben estar documentados con las instrucciones de trabajo. En un entorno regulado, estos pasos se conocen como procedimientos estndar de operacin (SOP).
Datos colaterales
Pueden obtenerse errores o resultados incorrectos, a pesar de usar la mejor instrumentacin, del desarrollo y validacin del mtodo y del entrenamiento del operador. Por ejemplo, la muestra puede estar contaminada. Mientras un resultado incorrecto no es necesariamente problemtico, puede tener serias consecuencias el no darse cuenta. La mayora de los resultados analticos obtenidos por UV-visible se basan en una medida a una longitud de onda. Con un punto, prcticamente no hay modo de detectar si un resultado es sospechoso, a menos que sea un resultado tpico y que el actual se desve significativamente del valor conocido. Datos colaterales y medidas mltiples a una o (preferiblemente) a mltiples, puede ayudar a asegurar que un resultado es correcto. Los datos tambin pueden utilizarse para investigar la razn del error.
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Operacin de rutina
Longitudes de onda de Un modo sencillo de verificar resultados analticos confirmacin cuantitativos es a travs del anlisis de confirmacin. En
este, se mide la absorbancia a una o ms longitudes de onda, adems de a la analtica, tanto de patrones como de muestras. Se realiza la cuantificacin a todas las longitudes de onda analticas. Si la muestra es pura, los resultados a la analtica y a la longitud o longitudes de onda de confirmacin, ser idntica. Si la muestra est contaminada, es muy probable que el contaminante contribuya de modo diferente a la absorbancia a las longitudes de onda analtica y de confirmacin, difiriendo los resultados. En la Figura 69 se muestra un ejemplo. El anlisis de confirmacin tambin puede utilizarse para detectar si se ha medido la muestra correcta y si las medidas estn fuera del rango dinmico lineal del instrumento.
Cafena
Absorbancia [UA]
Acido saliclico
Longitud de onda [nm] Figura 69 Anlisis de confirmacin
Espectros completos Para resultados ptimos, deben adquirirse los espectros

completos de la muestra. Estos espectros pueden superponerse con los del patrn para comprobar las
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Operacin de rutina
diferencias, o pueden utilizarse mtodos matemticos para obtener un factor de coincidencia, que indicar la similitud entre muestras y patrones. El factor de coincidencia se obtiene representando los valores de absorbancia a cada longitud de onda de la muestra, frente a los del patrn. Si los espectros son idnticos, los puntos representados estarn sobre una lnea recta. La pendiente de esta lnea es la relacin de la concentracin de la muestra a la del patrn. Si los espectros no son idnticos, los puntos no estarn en una lnea recta, sino que mostrarn cierta dispersin. La Figura 70 muestra grficos de ambos casos. En los dos, puede utilizarse regresin lineal para ajustar la mejor lnea y puede calcularse el coeficiente de correlacin. Este coeficiente es una medida de la similitud de los espectros de muestra y patrn. Si son exactamente iguales, el coeficiente de correlacin ser 1, mientras que si son completamente distintos, ser prximo a 0.
Correlacin = 0.999 Normalizado
Patrn
Desconocido Longitud de onda [nm] Desconocido Normalizado Correlacin = 0.056 Patrn Desconocido [mUA]
Longitud de onda [nm]
Desconocido [UA]
Figura 70 Grficos comparativos de espectros similares y distintos
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Operacin de rutina
Si se utilizan espectros completos, se dispondr de toda la informacin analtica para reevaluar los resultados y para determinar por qu un resultado es incorrecto.
Estadsticas Una sola medida no tiene un alto grado de validez. Todas las
medidas incluyen cierta predisposicin y variacin aleatoria debidas al ruido. Aunque esta predisposicin puede detectarse utilizando tcnicas como las descritas anteriormente, el ruido tambin puede dar lugar a errores significativos. Siempre debe estimarse la precisin de los resultados realizando mltiples medidas y calculando la media y la desviacin estndar de sta. La desviacin estndar es un indicador de la validez de una medida. Controlar los cambios de la desviacin estndar con el tiempo, puede ser til para diagnosticar muchos problemas de medida.
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apndice A
apndice A
Exactitud y precisin
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Exactitud y precisin
Definicin de los trminos
Los trminos exactitud y precisin se utilizan a lo largo de esta publicacin, pero no pueden ser intercambiados. Por lo tanto, es importante comprender perfectamente la diferencia entre ellos. Como analoga, la Figura 71 muestra el resultado de varios disparos de un rifle sobre una diana.
Figura 71 Ejemplo de precisin y exactitud
En (a), los disparos no son ni exactos ni precisos. En (b), son precisos pero inexactos; el tirador dispara bien, pero es evidente una desviacin constante. En (c), los disparos son exactos pero imprecisos: la media de los disparos estara justo en el centro de la diana, pero cada uno de los tiros se desva significativamente. En (d), los disparos son exactos y precisos.
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apndice B
apndice B
Caractersticas de los espectrofotmetros de diodos
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Ventajas de la espectroscopa de diodos
Como fabricante lder de espectrofotmetros de diodos, sabemos que esta tecnologa ofrece considerables ventajas sobre los instrumentos convencionales de barrido. En las secciones siguientes se revisan las ventajas de la tecnologa de diodos y se comentan algunas de las desventajas.
Rpida adquisicin La rpida adquisicin espectral hace de los espectrofotmeespectral tros de diodos la mejor opcin para la medida de sistemas
dinmicos, como detectores en el anlisis por inyeccin en flujo, en control de procesos y medidas cinticas. Por ejemplo, la Figura 72 muestra los espectros medidos a intervalos de 1 s durante una hidrlisis de sultona. Con estos datos, puede monitorizarse simultneamente la desaparicin de reactivo y la aparicin de producto.
Absorbancia [UA]
Longitud de onda [nm] Figura 72 Espectros de la hidrlisis de sultona
Para la mayora de los usuarios de espectrofotmetros UV-visible que no trabajan con sistemas dinmicos, la rpida adquisicin espectral ofrece tambin ventajas. Debido a su rapidez, este mtodo permite la adquisicin de espectros completos incluso cuando el anlisis requiere slo una longitud de onda. Los datos espectrales completos
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pueden utilizarse para corregir errores (Modelar el fondo, pgina 73 y Espectroscopa derivada, pgina 75) y como informacin colateral para confirmar la calidad de los datos (Espectros completos, pgina 117). Finalmente, pueden obtenerse espectros completos con alta productividad para el desarrollo de mtodos (vea Desarrollo del mtodo, pgina 82) y para anlisis multicomponente (vea Anlisis multicomponente, pgina 21).
Medida multilongitud La mayora de los equipos convencionales pueden realizar de onda simultnea medidas multilongitud de onda, pero deben moverse fsicamente de un punto a otro del espectro, lo que necesita tiempo. Con un espectrofotmetro de diodos, todos los puntos del espectro pueden medirse simultneamente. Por consiguiente, las medidas multilongitud de onda se realizan en el tiempo que un instrumento convencional requiere para medir a una nica . Esto facilita el uso de varias tcnicas para eliminar errores (vea Isoabsorbancia, pgina 72, Referencia interna, pgina 74 y Correccin de tres puntos, pgina 74). Adems, proporciona informacin colateral para confirmar la calidad de datos (Longitudes de onda de confirmacin, pgina 117) y mejorar la productividad del mtodo de ecuaciones simultneas simples (Anlisis multicomponente, pgina 21). En medidas multilongitud de onda, es necesario almacenar menos datos que en medidas espectrales completas. Sin embargo, las tcnicas de eliminacin de errores son algo menos eficaces que las que pueden utilizarse con espectros completos. Utilizando longitudes de onda alternativas para rangos de concentracin alta y baja, puede maximizarse el rango dinmico con espectrofotmetros de diodos. Los mximos de absorcin pueden utilizarse para medidas de alta sensibilidad y una longitud de onda con menor absorcin, en el lateral de la banda de absorcin, previene de los errores debidos a la luz dispersa. Finalmente, un espectrofotmetro de diodos puede utilizarse en muchas aplicaciones en las que antes se
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requeran los costosos equipos de doble (Diseo de doble longitud de onda, pgina 45).
Reseleccin de longitud Los equipos convencionales de barrido mecnico tienen un de onda error inherente de reseleccin de (Exactitud y precisin
de longitud de onda, pgina 50) que aumenta con el tiempo segn se desgastan las uniones. Tambin son susceptibles de deriva de longitud de onda en largos periodos de tiempo. Como en los instrumentos de diodos no se mueve ninguna pieza en el cambio de o en el barrido, no ocurren errores mecnicos significativos, con el tiempo. Datos de todas las zonas del espectro, no afectados por errores de reseleccin de , son una ventaja para el analista. Permiten seleccionar la longitud de onda ptima para el mejor rango dinmico, sensibilidad y selectividad en el desarrollo del mtodo (Desarrollo del mtodo, pgina 82). Adems, es esencial en tcnicas de mejora de sensibilidad que utilizan promedio de (Promedio de longitud de onda, pgina 67), para disminuir la sensibilidad de compuestos muy absorbentes (Absorbancia fuerte, pgina 68) y para verificar la calidad de datos con de confirmacin (Longitudes de onda de confirmacin, pgina 117). Otras tcnicas que utilizan datos espectrales completos son anlisis multicomponente (Anlisis multicomponente, pgina 72), desarrollo de mtodos (Desarrollo del mtodo, pgina 82), confirmacin de calidad de datos (Longitudes de onda de confirmacin, pgina 117) y espectroscopa derivada (Derivadas de espectros, pgina 6 y Espectroscopa derivada, pgina 75). Una excelente reseleccin de longitud de onda tambin asegura que las diferencias entre medidas se deben a la muestra y no a errores del instrumento. Por tanto, es posible la identificacin incluso cuando los espectros son prcticamente idnticos pero exhiben una pequea variacin de . Adems, pueden medirse espectros de patrones, almacenarlos en disco y recuperarlos das, semanas o incluso
126
meses ms tarde, para usarlos en anlisis cuantitativo sin tener que volver a medirlos. Esto mejora la productividad, especialmente es el caso de compuestos caros, difciles de obtener o inestables, que no pueden usarse rutinariamente.
Sensibilidad El rango dinmico de un espectrofotmetro de diodos

puede ampliarse a bajos niveles de absorcin. Estos instrumentos son menos complejos y tienen menos superficies pticas que los convencionales. Por ello, la salida de luz es mayor y los niveles de ruido son inferiores. La capacidad de adquirir espectros completos rpidamente tambin ayuda a mejorar la sensibilidad espectral utilizando tcnicas de promedio de tiempo (Promedio de tiempo, pgina 67) y promedio de (ver Promedio de longitud de onda, pgina 67).
Estadsticas de las Los espectrofotmetros de diodos barren tan rpidamente medidas que normalmente se realizan mltiples medidas y se
promedian a la vez. Se calcula la media y la desviacin estndar para cada dato. La desviacin estndar es una medida de la fiabilidad de los datos y se obtiene para cada valor de absorbancia del espectro. Se suele decir que una sola medida no tiene significado estadstico.12 Sin embargo, con espectrofotmetros convencionales, obtener mltiples medidas requiere mucho tiempo. Los datos estadsticos son una valiosa herramienta para evaluar la calidad de los resultados analticos (Estadsticas, pgina 119) y pueden tambin utilizarse en el desarrollo de mtodos (el software de los espectrofotmetros Agilent Technologies utiliza automticamente estos datos).
Robustez y Los espectrofotmetros de diodos son mecnicamente fiabilidad simples y no tienen, prcticamente, partes mviles. Como
se desgastan o rompen pocas piezas, estos instrumentos son muy fiables. El usuario se beneficia del mnimo tiempo sin utilizar. Adems, el coste de mantenimiento es menor
127
que en los instrumentos convencionales, ya que los espectrofotmetros de diodos no requieren mantenimiento ni recalibracin regular. Se estima que los instrumentos modernos tienen slo un fallo cada 10 aos (excluyendo cambios de lmpara).
Area abierta de muestra Debido al diseo de ptica inversa (El espectrofotmetro

de diodos, pgina 39) el rea de muestra de un espectrofotmetro de diodos no necesita estar cubierta, ya que el instrumento no es susceptible de interferencias de la luz ambiental. Adems, este diseo aumenta la productividad facilitando el cambio de muestra y permite medir un amplio rango de tipos de muestra, ya que son menores las restricciones de tamao. Tambin es ms fcil cambiar o aadir accesorios especiales de muestreo.
Desventajas de la espectroscopa de diodos
Como los espectrofotmetros de diodos difieren de los convencionales de barrido, han surgido muchas objeciones relativas a su rendimiento. En esta seccin, se comentan.
Resolucin En un espectrofotmetro convencional, la resolucin puede

cambiarse fcilmente variando la anchura de rendija. Sin embargo, en un espectrofotmetro de diodos, depende de un factor adicional: el intervalo de muestreo de la matriz de diodos. De hecho, este intervalo depende del nmero de diodos en la matriz y del rango de longitud de onda medido. Hasta hace poco, los equipos de diodos tenan algunas limitaciones al compararlos con instrumentos de 2 nm de resolucin. Este problema se ha corregido en las matrices modernas, como la del Agilent 8453 (Diseo de doble haz, pgina 42), que contiene ms elementos. Aunque los instrumentos de diodos no pueden alcanzar resoluciones de 0.5 nm o menos, como los convencionales, en muchos anlisis puede no ser necesaria tanta resolucin (Resolucin espectral, pgina 46). Adems, con una
128
resolucin tan elevada, menos luz alcanza al detector y la sensibilidad es menor. Por ejemplo, si un espectro se barre con una resolucin de 0.1 nm, puede llevar mucho ms de una hora obtener un espectro con buen S/N.
Luz dispersa En un instrumento de barrido secuencial, se reduce la luz

dispersa colocando filtros en el paso de luz, delante del monocromador (vea Luz dispersa, pgina 51). Estos filtros deben cambiarse segn la longitud de onda incidente. En un espectrofotmetro de diodos, utilizar filtros de esta manera, normalmente, lmita el rango de longitudes de onda que pueden medirse simultneamente. Por ello, los filtros se colocan sobre la propia matriz para reducir la luz dispersa. Sin embargo, como todas las de luz estn siempre en el rea del detector, la luz dispersa es ms problemtica que en los equipos convencionales. Hasta hace poco, los espectrofotmetros de diodos exhiban niveles ms altos de luz dispersa que los convencionales. Sin embargo, el Agilent 8453 est basado en un proceso patentado que usa la capacidad de barrido rpido completo de la tecnologa de diodos, para reducir significativamente la luz dispersa. Primero, se barre el espectro completo. A continuacin, se coloca en el paso de luz un filtro que bloquea toda la luz por debajo de 430 nm, y se mide el espectro en la regin por encima de 430 nm. La nica luz detectada es la dispersa, que se resta de la primera medida, obtenindose un espectro con la luz dispersa corregida. El proceso completo slo dura 1.5 s (con dos medidas de 0.5 s) y reduce la luz dispersa a niveles equivalentes o mejores a aquellos obtenidos con instrumentos de barrido convencional, con un monocromador.
Descomposicin de Debido a que los espectrofotmetros de diodos irradian la la muestra muestra con luz de todas las longitudes de onda, se ha
argumentado que la muestra se degradar. Sin embargo, las intensidades de luz utilizadas en un instrumento de diodos
129
no son mayores que las de uno convencional. Por ello, cuando se barre un espectro completo, secuencialmente, con un espectrofotmetro convencional, la cantidad total de luz (la suma de la luz a todas las longitudes de onda) a la que se somete a la muestra, es la misma que en un instrumento de diodos. Si la muestra es fotosensible, ambos instrumentos la descompondrn en la misma extensin. Alguna evidencia circunstancial indica que, en algunos casos, un instrumento de diodos puede adquirir espectros de compuestos de mayor fotosensibilidad, que no pueden obtenerse en espectrofotmetros convencionales. Cuando se mide a una longitud de onda, un instrumento convencional debera tener clara ventaja sobre un espectrofotmetro de diodos, ya que somete a la muestra a mucha menos irradiacin. Sin embargo, en la prctica, los problemas de fotodegradacin son extramadamente raros. En el momento de la publicacin de este libro, no se conoca ningn caso documentado.
Complejidad Algunos usuarios estn intimidados por los instrumentos de

diodos porque creen que son muy complicados. Pero aunque el proceso interno de datos asociado con los espectrofotmetros de diodos es, por supuesto, mucho ms complejo que en los instrumentos convencionales, el usuario nunca es consciente de esta diferencia. Y, mientras los espectrofotmetros de diodos generan muchos ms datos que los convencionales, estos datos se manejan fcilmente con los modernos softwares. Adems, los datos adicionales tienen numerosas ventajas, como se ha tratado a lo largo de este libro.
Errores en la medida de Aunque los espectrofotmetros de diodos pueden producir muestras fluorescentes resultados incorrectos cuando se miden muestras
fluorescentes, los instrumentos convencionales de barrido tambin estn sujetos a error (en Fluorescencia, pgina 79 se ofrece una explicacin).
130
apndice C
apndice C
Referencias
131
Referencias
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134
indice
indice
135
Indice
A
aberracin cromtica, 38 absorbancia, 3, 6, 21, 83, 105 bandas, 7, 11, 76, 77 errores de medida en, 5354, 60 61, 79 interferencias, 69, 70, 74 medida de errores en, 65 y color, 13 absorbancia dbil, 6668 absorbancia fuerte, 6869, 126 cido ntrico, 107 cido perclrico, 103, 107, 109 cido sulfrico, 103 actividad enzimtica, 1516, 29 aditividad, 21, 86 Agilent 8453 espectrofotmetro, 41, 42, 109, 129 aminocidos, 14 anlisis cualitativo, 1016 anlisis cuantitativo, 1627, 58, 64, 97, 98, 127 anlisis multicomponente, 14, 21 26, 125, 126 e isoabsorbancia, 72 anchura de banda espectral instrumental (SBW), 4749, 110, 111, 114 anchura de banda espectral natural (NBW), 4849 anchura de rendija, 66, 128 ngulo de aceptacin, 80 arco de deuterio lmpara, 101, 107, 108 arco de mercurio lmpara, 101, 108 ASTM (American Standard Testing Methods), 107109 autotest, 114
C
cloruro potsico, 104, 108, 112 coeficiente de correlacin, 84, 85, 86, 118 coeficiente de extincin, 1819, 21, 97, 98, 115 color, 1314 confirmacin longitud de onda, 117 controlador de temperatura Peltier, 64 convencional ptica, 79 correccin de tres puntos, 74 correccin Morton-Stubbs. Ver correccin de tres puntos cristal xido de holmio, 108 cristal de densidad neutra, 98, 102, 108 filtros, 107, 112 cristal de xido de didimio, 102 cromforo, 1011, 62 cuantificacin de un solo componente, 20 Cubetas, 58 cubetas, 5861 cuidado de, 61 material, 5859 cubetas con apertura, 60, 61 cubetas de flujo, 60 cubetas rectangulares abiertas, 59 cubetas sin cubrir, 61 curva de calibracin, 19, 8385 curva de trabajo. Ver curva de calibracin
descomposicin de la muestra, 80, 129130 desviacin estndar, 8687, 88, 89, 90, 119, 127 detector fotodiodo, 3536 matriz de diodos, 3637 tubo fotomultiplicador, 35 detector de matriz de diodos, 3637 detector fotodiodo, 3536 detector tubo fotomultiplicador, 35 dicromato potsico, 107, 108 en cido perclrico, 103 en cido sulfrico, 103 diodos espectrofotmetro, 3940 disolucin de perclorato de holmio, 107, 108, 109, 111 disolvente efecto del, 6264 eleccin de, 6162 dispersin, 84, 89, 118 dispersin Rayleigh, 70 dispersin Tyndall, 70 dispersin (scattering), 3, 9, 7071 dispersin Rayleigh, 70 dispersin Tyndall, 70 dispositivos de dispersin, 3435 divisin de haz espectrofotmetro, 44 DNA (cido desoxirribonuclico), 1415 doble haz espectrofotmetro, 4243 doble longitud de onda espectrofotmetro, 45
D B
benceno (vapor), 103, 107, 108 blanco, 38, 41, 42, 44, 46, 64, 65 britnica farmacopea, 104, 106 datos colaterales, 116119, 125 dbil absorbancia, 6668 deriva, 42, 44, 55, 68, 100, 114, 126 derivatizacin qumica, 28 desarrollo de mtodos, 125 desarrollo del mtodo, 8294 descarga de vapor de mercurio lmpara, 107
E
efecto Schlieren, 63, 64 electromagntica radiacin, 3, 32 electromagntico espectro, 2 electrnica energa, 4 energa electrnica, 4 energa rotacional, 4 energa vibracional, 4
136
Indice
ensayos cinticos enzimticos, 28 error estndar de regresin, 84 espectral resolucin, 4649 espectrofotmetro convencional, 3839 espectrofotmetro Agilent 8453, 41, 42, 109, 129 espectrofotmetro con divisin de haz, 44 espectrofotmetro convencional, 3839 espectrofotmetro de diodos, 3940 espectrofotmetro de doble haz, 4243 espectrofotmetro de doble longitud de onda, 45 espectrofotmetro de haz simple, 41 espectrofotmetro HP 8450A, 43, 44 espectros derivados, ??10, 1112, 20 espectroscopa derivada, 7578 espejos cncavos, 38 estabilidad, 33, 43, 45, 100 estadsticas, 119, 127 Estados Unidos farmacopea, 94, 106107, 108 europea farmacopea, 104106, 108, 110, 113 exactitud, 8788, 100 longitud de onda, 5051, 97, 101, 103, 107, 108 exactitud fotomtrica, 5154, 98, 99, 100, 108, 111 exatitud fotomtrica, 108
fosforescencia, 3 fotomtrica exactitud, 5154, 98, 99, 100, 108, 111 precisin, 5154, 98, 108 fotoqumica reaccin, 3, 80 frecuencia, 3 fuentes de luz, 3334 fuerte absorbancia, 6869, 126
y anlisis multicomponente, 72
L
Lambert. Ver ley de Bouger-Lambert lmpara arco de deuterio, 33 halgena de wolframio, 33 xenon, 34 lmpara de arco de deuterio, 33, 101, 107, 108 lmpara de arco de mercurio, 101, 108 lmpara de descarga de vapor de mercurio, 107 lmpara de xenon, 34 lmpara halgena de wolframio, 33 lentes, 38 ley de Beer, 1620, 21, 83 ley de BeerBouguer-Lambert, 18 19 ley de Bouguer-Lambert, 17 lmite de cuantificacin (LOQ), 89 90 lmite de deteccin (LOD), 8990 linealidad, 8387, 100, 100, 107, 108 llanura de lnea de base, 100, 114 longitud de onda confirmacin, 126 exactitud, 5051, 97, 101, 103, 107, 108 precisin, 5051, 97, 101, 107 promedio, 67, 89, 126, 127 referencia, 64, 72, 74, 86 repetitividad, 50, 51 reproducibilidad, 10, 41, 51, 69, 94 reseleccin, 126127 longitud de onda de confirmacin, 117, 126 luz dispersa, 5152, 9899, 103, 105, 108, 112113, 129
G
geometra de la muestra, 65 GLP (Buenas prcticas de laboratorio), 96, 104, 109 GMP (Buenas prcticas de fabricacin), 96, 104 Golay. Ver Tcnica polinmica Savitzky-Golay granate de neodimio ytrio aluminio, 102
H
haz simple espectrofotmetro, 41 HP 8450A espectrofotmetro, 43, 44
I F
Farmacopea Alemana (DAB), 104 Farmacopea Britnica (BP), 104, 106 Farmacopea de Estados Unidos (USP), 94, 106107, 108 Farmacopea Europea (EP), 104 106, 108, 110, 113 filtros, 35, 80, 98 cristal de densidad neutra, 107, 112 fluorescencia, 3, 7980 identificacin, 1011, 12, 16 idoneidad del sistema, 115 incertidumbre, 84 ndice de refraccin, 65 interferencia, 9, 20, 28 tipos de, 6978 intervalo de confianza, 89 inversa ptica, 40, 79, 80, 128 ioduro potsico, 103, 107, 108, 112 ioduro sdico, 103, 108, 112 ISO 9000, 96 isoabsorbancia, 72, 92
M
matriz, 9, 64, 70, 78 medida de balance, 46 metal sobre cuarzo, 102, 107, 108
137
Indice
mtodo de ecuaciones simultneas simples, 2124, 25, 27, 91 mtodo de mnimos cuadrados, 8, 2425, 27, 84, 91 mtodo de mnimos cuadrados mltiples (MLS), 26 mtodo de mnimos cuadrados parciales (PLS), 26 mtodos estadsticos, 26, 84 coeficiente de correlacin, 84, 85, 86, 118 ecuaciones simultneas simples, 2124, 25, 27, 91 error estndar de regresin, 84 incertidumbre, 84 mnimos cuadrados, 8, 2425, 27, 84, 91 mnimos cuadrados mltiples (MLS), 26 mnimos cuadrados parciales (PLS), 26 regresin del componente principal (PCR), 26 microcubetas, 60 monocromador, 35
P
patrones de emisin, 101 patrones slidos de absorcin, 101 pH, 11, 15, 29, 6263 policromador, 39 precisin, 60, 66, 8889, 94, 119 longitud de onda, 5051, 97, 101, 107 precisin fotomtrica, 5154, 98, 108 prismas, 34 promedio de tiempo, 67, 89, 127 protenas, 14
sensibilidad, 28, 60, 71, 8991, 126, 127 sultona, 124
T
tcnica polinmica Savitzky-Golay, 9 tcnicas de correccin, 78, 92, 125 anlisis multicomponente, 14, 21 26, 72, 125, 126 correccin de tres puntos, 74 espectroscopa derivada, 7578 isoabsorbancia, 72, 92 referencia interna, 41, 55, 64, 74, 89 temperatura, 11, 1415, 19, 29, 62 64 tipos de cubetas, 5860 con apertura, 60, 61 de flujo, 60 microcubetas, 60 rectangulares abiertas, 59 sin cubrir, 61 ultramicrocubetas, 60 tolueno en hexano, 104, 108, 113 transmitancia, 6, 18, 51
R
rango, 91 rango dinmico lineal, 5354, 58, 68, 125, 126 reaccin de hidrlisis de sultona, 124 reaccin fotoqumica, 3, 80 redes hologrficas, 3435 referencia longitud de onda, 64, 72, 74, 86 patrn, 97, 98 valores, 46 referencia interna, 41, 55, 64, 74, 89 reflexin, 3 regresin del componente principal (PCR), 26 resolucin, 105, 108, 128129 resolucin espectral, 4649 robustez, 93, 127128 rotacional energa, 4 ruido, 52, 66, 88, 99, 114, 119 ruido Schott, 52
N
NAMAS (Servicio Nacional de Acreditacin de Medidas), 96 NIST (National Institute of Standards and Technology), 41, 106107, 108, 110, 111 nitrito sdico, 103, 112 NPL (National Physical Laboratory), 41
U
ultramicrocubetas, 60
V
validacin del mtodo, 94 valoraciones espectrofotomtricas, 28 vibracional energa, 4
O
ptica, 38, 61 ptica convencional, 79 ptica inversa, 40, 79, 80, 128 xido de holmio, 109 cristal, 102, 107 en cido perclrico, 103, 107 xido de samario en cido perclrico, 103
S
sales de cobalto, 103, 108 en cido ntrico/perclrico, 107 sales de nquel, 103, 108 en cido ntrico/perclrico, 107 selectividad, 28, 9193, 126 seal-ruido (S/N), 910, 27, 67
138
s1
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Fundamentos de la espectroscopa UV-visible moderna

captulo 3 Tratamiento y medida de muestra

captulo 4 Desarrollo y validacin del mtodo

captulo 5 Operacin de rutina

apndice A Exactitud y precisin

apndice B Caractersticas de los espectrofotmetros de diodos

apndice C Referencias indice

Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible

Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible

Longitud de onda [m] Figura 1 El espectro electromagntico

Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible

La energa asociada con la radiacin electromagntica se define por la siguiente ecuacin:

Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible

E total = E electronica + E vibracional + E rotacional

E electronica > E vibracional > E rotacional

Figura 2 Transiciones electrnicas en el formaldehdo

Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible

Figura 3 Transiciones electrnicas y espectros de los tomos

Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible

Figura 4 Transiciones electrnicas y espectros UV-visible en molculas

Derivadas de espectros Si un espectro se expresa en absorbancia (A) como una

Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible

Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible

Figura 5 Derivadas de los espectros de una banda gaussiana de absorbancia

Obtener las derivadas de los espectros

Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible

Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible

Carbonilo (aldehdo) RHC=O

Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible

Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible

Figura 6 Mejora de la resolucin

Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible

Color El color es una propiedad importante de una sustancia. El

Figura 7 Transmisin y color

Long. de onda [nm]

Color absorbido rojo naranja

amarillo-verde verde verde azulado azul verdoso azul violeta

Figura 8 Absorbancia y colores complementarios

Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible

Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible

A DNA = A adenina + A guanina + A cito sin a + Atimina

Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible

Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible

Paso ptico Figura 9 Transmitancia y concentracin: la ley de Bouguer-Lambert

Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible

Paso ptico Figura 10 Transmitancia y paso ptico: ley de Beer

Combinando las dos leyes se obtiene la ley Beer-Bouguer-Lambert:

A = log T = log ( I I o ) = log ( I o I ) = bc

Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible

Concentracin Figura 11 La ley de BeerBouguer-Lambert

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A = bc d dA ------ = ----- bc d d d d A -------- = ------- bc d d

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Mtodo de ecuaciones simultneas simples

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Para una mezcla de x e y donde cx = cy = 1, las absorbancias medidas deberan ser:

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(+ 10 %), el clculo cuantitativo da lugar a los resultados mostrados en la Tabla 2:

Mtodo de mnimos cuadrados

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Real Absorbancia [UA]

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Sulfhemoglobina Oxihemoglobina Carboxihemoglobina Hemoglobina (pH 7.07.4) Desoxihemoglobina