克伦特罗定量 ELISA 试剂盒

产品编号:101225
测试前请仔细阅读本说明
（试剂盒组分应 4°C 保存）

说明
本试剂盒用于猪尿样品中克伦特罗定量检测,请注意该试剂盒适用于猪尿中
1ppb 或 5ppb 临界值的克伦特罗检测，每种临界值具有必须遵循的特定步骤，此
步骤确保得到最适宜结果。如果检测饲料或组织样品,请与 Neogen 代表联系以获
得合适的样品提取步骤.
测试原理
本试剂盒是以样品中的克伦特罗与酶结合物中克伦特罗竞争抗体包被板上有限
抗体位点为基础。
提供的材料
1. EIA 缓冲液: 40ml，用于浓缩酶结合物稀释；
2. 样品缓冲液：25ml,用于样品稀释(1ppb 检测)；
3. 浓缩洗涤缓冲液(10 倍稀释): 25ml；使用之前用去离子水或超纯水做 10 倍
稀释。稀释的洗涤缓冲液用于洗去孵育后微孔板中未结合的酶结合物和标准
品/样品；
4. K-Blue 底物: 20mL. 稳定的 3,3’,5,5，-四甲基对二氨基联苯(TMB)-过氧化氢
(H2O2)混合物装于一个瓶子中，用于微孔板显色。冷冻保存底物（ 光敏
感）；
5. 1N 硫酸：14ml,酸终止试剂（注意：腐蚀性试剂）；
6. 浓缩酶结合物（180 倍稀释）: 200 μl,浓缩的辣根过氧化物酶结合物，使用
前 1:180 稀释；
7. 抗体包被板: 96 孔微孔板，每条 8 孔，用抗克伦特罗抗体包被，直接使用;
检测前请勿洗涤；
8. 标准品: 200μL，绿盖小瓶， 浓度分别为 0，0.05，0.2，0.5，1，2 和
6ng/ml(ppb),直接使用，请勿稀释。
未提供的必需品
1. 去离子水或超纯水；
2. 量程为 10μL-1000μL 的精确微量移液器及一次性吸头
注意: 若一次使用多个板条，建议使用多通道微量移液器以获得最佳结
果。

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3. 用于稀释和混合洗涤缓冲液的刻度量筒；
4. 孵育时覆盖微孔板的薄膜或微孔板盖；
5. 洁净的玻璃器具(如：试管等)，用以稀释酶结合物和样品；
6. 450nm 酶标仪。
可选材料
微量振荡器

操作注意事项
1. 请勿使用过期的试剂盒或其中的组件；
2. 请勿把本试剂盒中的任何试剂或组件与其他任何试剂盒中的任何试剂或
组件混合。本试剂盒的设计确保按照提供时的状态使用可正确工作。
3. 请勿用嘴吸取试剂。
4. 始终将 K-Blue 底物从瓶子倒入洁净的试管或其他容器再使用。为避免底
物的污染，请勿直接从瓶子中吸取底物。
5. 所有的样品都应该认为有引起感染的可能。按照适当的预防措施进行操
作。
6. 除在加入试剂、洗涤或读数时，均应盖上微孔板的盖子。
7. 不用时，试剂盒的组件应冷藏保存。
8. 在打开并从瓶子中移取试剂时，用无菌操作的方法进行。
9. 请勿在对样品或试剂进行操作的区域吸烟、吃东西或喝饮料。
步骤说明
1. 干燥剂必须与未使用的板条一起留在锡箔袋中。不用时，应保持锡箔袋
密封以维持干燥的环境。若封口失败，请用热封口机封口或在其开口端
扎紧。封口前应驱除多余空气；
2. 对缓冲液、酶结合物、标准品和样品进行操作时，一定要使用不同的洁
净吸头;
3. 移取一种试剂前，要用该试剂润洗移液器吸头 3 次(如：吸取所需数量的
试剂然后再放回到该试剂瓶，重复，共 3 次)。这样，吸头就正确地润洗
好了，可用他将试剂转移到微孔或试管中;
4. 向微孔中加入试剂时，请勿让吸头接触孔的内壁，或其他已经存在于孔
中的试剂。这样会导致交叉污染;
5. 标准和样品应做平行样;
6. 浓缩状态下的酶结合物是最稳定的,只对现用板条所需的试剂量进行稀释;
7. 打开盛放酶结合物及对照液的小瓶之前，在竖直方向上轻弹瓶子，以去
除留在盖子上的液体;
8. 加入底物之前，用吸水纸擦去微孔低部外侧的灰尘或指纹;
9. 使用之前，轻轻混合样品和试剂,避免剧烈的搅动;

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 10. 只使用试剂盒中的一部分试剂时，建议移取合适量的每一种试剂分别到
洁净的容器中用于反复的操作，以减低反复从原装容器中取试剂造成的
污染。

样品准备
本试剂用于猪尿样品中克伦特罗检测, 如果检测饲料或组织样品,请与
Neogen 代表联系以获得合适的样品提取步骤.
如果尿样出现混浊或大颗粒物质存在，取样前须离心以除去样品中颗粒物
质。

测试步骤（1ppb）
1. 用去离子水或超纯水 10 倍稀释洗涤缓冲液（例如：25ml 浓缩洗涤缓冲
液+225ml 去离子水），充分混匀;
2. 决定所需微孔的个数;
3. 稀释酶结合物浓缩液：1μL 酶结合物中加入 180μLEIA 缓冲液(1:180)稀
释），充分混合;
注意: 计算用于稀释的酶结合物体积时，由于移取时的损失，应增加几
个微孔的量。(如：用单吸头移液器，应增加 4 个微孔的量，用多通道微
量移液器，则增加 8 个微孔的量)。
适用于临界值为 1ppb 的标准品是：0,0.05,0.2,0.5,1 和 2ppb
4. 相应孔中加入 20μL 标准品或样品;
5. 每孔加入 150μl 样品缓冲液（为了提高加液速度可采用 8 通道或 12 通
道加样器），轻轻震荡微孔板（可采用微孔板震荡器）；
6. 用塑料膜或用微孔板盖覆盖好微孔板，于室温下孵育 15 分钟；
7. 标准品或样品孵育完成后,移开板盖,倒掉孔内液体,在干净的吸水纸上拍
打微孔板来除去孔中多余液体；
8. 每孔用 300μl 稀释的洗涤缓冲液洗板 3 次，每次洗涤后倒掉液体并在吸
水纸上拍干，也可采用自动微孔洗板机,但洗涤次数应增加为 5 次；
9. 每孔加入已稀释的酶结合物 180μl(用 8 通道或 12 通道加样器)，轻轻混
匀微孔板（也可采用微孔板震荡器）；
10. 用塑料膜或微孔板盖覆盖好微孔板，于室温下孵育 30 分钟（注意：微
孔板远离飘浮物且温度勿波动）；
11. 酶结合完全后移去盖板，倒掉孔内液体，,在干净的吸水纸上拍打微孔板
来除去孔中多余液体；
12. 每孔用 300μl 稀释的洗涤缓冲液洗板 3 次，每次洗涤后倒掉液体并在干
净的吸水纸上拍干，也可采用自动微孔洗板机,但洗涤次数应增加为 5
次；
13. 每孔加入 100μl K-Blue 底物（为了提高实验结果的准确性，可采用 8
通道或 12 通道加样器），轻轻震荡微孔板；

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14. 用塑料膜或微孔板盖覆盖好微孔板，于室温下孵育 15 分钟;
15. 移掉板盖，每孔加入 100μl 酸终止液（为提高实验结果的准确性可采用
8 通道或 12 通道加样器）；
16. 轻轻震荡微孔板，加酸后 30 分钟内于 450nm 下读数；
17. 绘制标准曲线，计算样品中克伦特罗的浓度（见计算）。
测试步骤（5ppb）
1. 决定所需微孔的个数;
2. 稀释酶结合物浓缩液：1μL 酶结合物中加入 180μLEIA 缓冲液(1:180)稀
释），充分混合;
注意: 计算用于稀释的酶结合物体积时，由于移取时的损失，应增加几
个微孔的量。(如：用单吸头移液器，应增加 4 个微孔的量，用多通道微
量移液器，则增加 8 个微孔的量)。
适用于临界值为 5ppb 的标准品是：0,0.2,0.5,1,2 和 6ppb
3. 相应孔中加入 20μL 标准品或样品;
4. 每孔加入已稀释的酶结合物 180μl(用 8 通道或 12 通道加样器)，轻轻混
匀（也可采用微孔板震荡器）；
5. 用塑料膜或微孔板盖覆盖好微孔板，于室温下孵育 45 分钟（注意：微
孔板远离飘浮物且温度勿波动）；
6. 用去离子水或超纯水 10 倍稀释洗涤缓冲液（例如：25ml 浓缩洗涤缓冲
液+225ml 去离子水），充分混匀;
7. 酶结合物/标准品/样品孵育完成后,移去盖板，倒掉孔内液体，,在干净的
吸水纸上拍打微孔板来除去孔中多余液体；
8. 每孔用 300μl 稀释的洗涤缓冲液洗板 3 次，每次洗涤后倒掉液体并在干
净的吸水纸上拍干，也可采用自动微孔洗板机,但洗涤次数应增加为 5
次；
9. 每孔加入 100μl K-Blue 底物（为了提高实验结果的准确性，可采用 8
通道或 12 通道加样器），轻轻震荡微孔板；
10. 用塑料膜或微孔板盖覆盖好微孔板，于室温下孵育 30 分钟;
11. 移掉板盖，每孔加入 100μl 酸终止液；
12. 轻轻震荡微孔板，加酸后 30 分钟内于 450nm 下读数；
13. 绘制标准曲线，计算样品中克伦特罗的浓度（见计算）。

计算
1. 建议使用log-logit曲线模型来计算浓度未知的样品中克伦特罗的水平;
2. 计算每个标准溶液的最大结合百分比（%B/B0值）。方法是用标准溶液
的吸光度值除以0标准溶液的吸光度值，然后乘以100。把比值转换为
logit函数；这里，logit = ln (%B/B0/(100-%B/B0))。（译注：作为分子的吸
光度值应该是另一浓度不为0的标准溶液的吸光度值）

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 例： 0 标准溶液的吸光度 = 1.000 = B0
0.5 ng/mL标准溶液的吸光度= 0.400
%B/B0 = 0.400/1.000 × 100 = 40.0
Logit = ln(40.0/(100-40.0)) = -.405
3. 用相同的方法对所有标准溶液进行计算;
4. 用每一标准浓度的logit值做Y轴，log值为X轴，Y对X作图。用曲线拟合
程序绘制一条曲线(如：4-参数法或线形递减法);
5. 计算每个样品的%B/B0 和logit值;
例： 0 标准溶液吸光度 = 1.000 = B0
样品溶液吸光度 = 0.200
%B/B0 = 0.200/1.000 × 100 = 20.0
Logit = ln(20.0/(100-20.0) = -1.39
6. 利用标准曲线，通过比较每个样品的 logit 值和相应克伦特罗标准品的浓
度来判定样品中克伦特罗的含量。如果样品的 logit 值小于最高标准品
的 logit 值，那么样品中克伦特罗的含量大于该最高标准品（2ppb 或
6ppb，根据使用的形式）;如果样品的 logit 值不可计算（因为%B/B0 超
过 100%），那么样品中克伦特罗的含量小于最低标准品。

交叉反应数据
克伦特罗…………100% 羟基克伦特罗…………60%
妥布特罗…………1.85% Diolic Clenbuterol Metabolite…0.83%
Propranolol…………0.47% Alprenolol…………0.04%
Fenspiride…………0.04% Fenfluramin…………0.03%
……………………………………………………
交叉反应小于 0.01%时，10ng/ml 时也不发生明显反应。

版权
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性的保证。Neogen 不应承担任何由于使用本产品所造成的直接的或间接的
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 1 PPB
快速参考检测程序

适用于 1PPB 检测标准品为:

0, 0.05, 0.2, 0.5,1, and 2 ppb
注意:请查阅产品说明书来获取更详细的用法说明

1 .用去离子水或超纯水 10 倍稀释洗涤缓冲液;
2. 决定所需微孔的个数;
3. 稀释酶结合物浓缩液, ,每孔中加入 1μL 酶结合物及 180μLEIA 缓冲液
(1:180)稀释），充分混合;
4. 相应孔中加入 20μL 标准品或样品;
5. 加入 150μl 样品缓冲液到每一个标准品和样品孔内；
6. 用塑料膜或用微孔板盖覆盖好微孔板，于室温下孵育 15 分钟；
7.标准品或样品孵育完成后,移开板盖,倒掉孔内液体,在干净的吸水纸上拍打
微孔板来除去孔中多余液体；
8. 用 300μl 稀释的洗涤缓冲液洗涤微孔 3 次，每次洗涤后倒掉液体并在吸
水纸上拍干；
9. 每孔加入已稀释的酶结合物 180μl，轻轻混匀微孔板；
10.用塑料膜或微孔板盖覆盖好微孔板，于室温下孵育 30 分钟
注意：微孔板远离飘浮物且温度勿波动；
11.酶结合完全后移去盖板，倒掉孔内液体，,在干净的吸水纸上拍打微孔板
来除去孔中多余液体；
12.用 300μl 稀释的洗涤缓冲液洗涤微孔 3 次，每次洗涤后倒掉液体并在干
净的吸水纸上拍干；
13.每孔加入 100μl K-Blue 底物，轻轻震荡微孔板；
14.用塑料膜或微孔板盖覆盖好微孔板，于室温下孵育 15 分钟;
15.移掉板盖，每孔加入 100μl 酸终止液；
16.轻轻震荡微孔板，加酸后 30 分钟内于 450nm 下读数；

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 5PPB
快速参考检测程序

适用于 5PPB 检测标准品为:

0, 0.2, 0.5,1, 2,and 6ppb
注意:请查阅产品说明书来获取更详细的用法说明

1. 用去离子水或超纯水 10 倍稀释洗涤缓冲液;
2. 决定所需微孔的个数;
3. 稀释酶结合物浓缩液, ,每孔中加入 1μL 酶结合物及 180μLEIA 缓冲液
(1:180)稀释），充分混合;
4. 相应孔中加入 20μL 标准品或样品;
5. 每孔加入已稀释的酶结合物 180μl，轻轻混匀;
6. 用塑料膜或微孔板盖覆盖好微孔板，于室温下孵育 45 分钟
注意：微孔板远离飘浮物且温度勿波动；
7. 酶结合完全后移去盖板，倒掉孔内液体，,在干净的吸水纸上拍打微孔板
来除去孔中多余液体；
8. 用 300μl 稀释的洗涤缓冲液洗涤微孔 3 次，每次洗涤后倒掉液体并在干
净的吸水纸上拍干；
9. 每孔加入 100μl K-Blue 底物，轻轻震荡微孔板；
10. 用塑料膜或微孔板盖覆盖好微孔板，于室温下孵育 30 分钟;
11. 移掉板盖，每孔加入 100μl 酸终止液；
12. 轻轻震荡微孔板，加酸后 30 分钟内于 450nm 下读数；

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 临界值 1ppb 检测步骤
标准品要求：0,0.05,0.2,0.5,1 和 2ppb

每孔内加入 20μl 标准品/样品

每孔内加入 150μl 样品缓冲液
↓孵育 15 分钟
用 300μl 稀释的洗涤缓冲液洗 3 次
↓
每孔内加入 180μl 稀释的酶结合物
↓孵育 30 分钟
用 300μl 稀释的洗涤缓冲液洗 3 次
↓
每孔内加入 100μl 底物
↓孵育 15 分钟
每孔内加入 100μl 硫酸

临界值 5ppb 检测步骤

标准品要求：0,0.2,0.5,1,2 和 6ppb

每孔内加入 20μl 标准品/样品

每孔内加入 180μl 稀释的酶结合物
↓孵育 45 分钟
用 300μl 稀释的洗涤缓冲液洗 3 次
↓
每孔内加入 100μl 底物
↓孵育 30 分钟
每孔内加入 100μl 硫酸

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