・642・ Herald of M edicine Vol125 No17 July 2006

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肝癌细胞特异性结合双价抗体的构建表达与鉴定
1, 2 1 1 1 1
黄 　宇 ,余 　冰 ,邢 　薇 ,沈 　昕 ,肖代雯 ,
1 1 1 1 1 1
刁智娟 ,刘 　静 ,代 　维 ,赵晓蓉 ,雷 　萍 ,沈关心
( 1. 华中科技大学同济医学院免疫学系 ,武汉 　430030 ; 2. 福建省厦门市第一医院检验科 , 361000 )

[摘 　要 ] 　目的 　构建和表达与肝癌细胞特异结合的双价单链抗体 ( bivalent single 2chain Fv, B sFv) ,并鉴定该双价

抗体的生物活性 。方法 　以与肝癌细胞特异结合的单链抗体 ( scFv) 为模板 , 设计引物引入中间连接肽 ( G4 S) 及酶切位
点 A sc I,通过聚合酶链反应 ( PCR)方法扩增出两个 scFv片段 , 将其连入原核表达载体 pAB1; 构建的表达载体转化大肠
测序鉴定 。阳性菌经 IPTG 诱导表达 , 表达产物经 SDS2PAGE,
埃希菌 TG1,挑取单克隆细菌进行扩增 , 提取质粒酶切 、
W estern blot鉴定 ,间接免疫荧光流式细胞术 ( FACS)测定与肝癌细胞特异结合的特性 。结果 　经酶切鉴定以及 DNA 测
序结果表明该 B sFv构建成功 , SDS2PAGE、
W estern blot鉴定表明表达蛋白相对分子量与 B sFv理论值一致 ,且表达产物同
亲本 scFv比较 ,与肝癌细胞特异结合活性增强 。结论 　B sFv构建成功 , B sFv较 scFv具有明显优势 ,为其用于临床肿瘤
的诊断和治疗奠定了基础 。
[关键词 ] 　单链抗体 ; 肝癌细胞 ; 双价抗体
[中图分类号 ] 　 R966 　　　 [文献标识码 ] 　A 　　　 [文章编号 ] 　1004 20781 ( 2006 ) 07 20642 204

Con struction, Expression and Iden tif ica tion of a B iva len t S in gle Cha in
Var ia ble Fragm en t ( BsFv) Spec if ica lly B in d in g to L iver Cancer Cell
HUANG Yu , YU B ing , X IN G W ei , SHEN Xin , X IAO Dai2wen , D IAO Zhi2juan , L IU J ing , DA IW ei ,
1, 2 1 1 1 1 1 1 1

ZHAO Xiao 2rong , LE I Ping , SHEN Guan 2xin ( 1. D epa rtm en t of Imm unology, Tong ji M ed ica l College,
1 1 1

Huazhong U n iversity of S cience and Technology, W uhan 430030, Ch ina; 2. D epa rtm en t of C lin ica l L abora tory,
the F irst Hospita l of X iam en C ity, Fu jian P rovince 361000, Ch ina )
ABSTRACT 　O bjective 　 To p roduce and exp ress a biralent sigle 2chain Fv ( B sFv) specifically binding to liver cancer
cells, and to identify its biologic activity. 　M ethods 　 PCR p rim ers were designed to introduce interlinker G4 S and the
restriction endonuclease A sc I, and two fragments were p roduced from the parent scFv SLH 210 by PCR , and then linked into the
exp ression vector pAB1. The cell2binding activities of the B sFv and scFv were analyzed by FACS using some cell lines. 　
Results　B sFv was found to bind to selected cell lines more specifically than parent scFv. 　Conclusion 　B sFv is successfully
constructed w ith p rom inent superiority to scFv, laying a foundation for its use in the diagnosis and treatm ent in clinical tumors.
KEY WO RD S　Single 2chain variable fragment; L iver cancer cells; B ivalent scFv

　　单链抗体 ( single 2chain variable fragment, scFv) 是 为基础 , 通过中间连接肽 ( interlinker) 将两个相同的
一种基因工程抗体 , 具有分子量小 、 易于穿透肿瘤组 scFv 连接 , 形式为 : VH 2VL 2interlinker2VH 2VL , 以构建
织、血浆清除率高等特点 ,目前已广泛应用于临床 。但 一种双价且能与 HepG2 特异结合的小分子抗体 , 从而
是 ScFv也存在一定缺陷 ,如仅仅具有单一抗原结合位 提高其与肝癌细胞特异结合的能力 。
点 ,血浆清除过快等 。为了克服该缺点 ,构建多价和多 1 　材料与方法 　
[ 1 ～3 ]
特异性的重组抗体成为近来的研究热点 。同济医 1. 1 　质粒 、
菌株和细胞系 　 SHL10 为能与 HepG2 细
学院免疫学系已从噬菌体抗体库 Griffin. 1 L ibrary 中 胞相对特异结合的 scFv ; 原核表达载体 pAB1 由德
[4]

筛选出一种能够与肝癌细胞系 HepG2 相对特异结合 [7]

国 R. E Konterm ann 教授惠赠 ; 表达菌株 TG1、
正常
[ 4 ～6 ]
的 scFv,命名为 SLH10 。笔者在本实验以 SLH10
肝细 胞 系 L02、肿 瘤 细 胞 系 HepG2 、MCF 27、Hela、
[收稿日期 ] 　2006 202 209 SMMC7721、
A549 等均为本实验室保存 。
3
[基金项目 ] 　 国家重点基础研究发展计划基金资助 (基
1. 2 　HepG2 特异结合双价抗体表达载体的构建 　首
金编号 : 2002CB513109 )
先利用多克隆位点 SfiI和 NotI (购自 MB I公司 ) , 将
[作者简介 ] 　黄 　宇 ( 1979 - ) , 男 , 福建厦门人 , 硕士 , 主
SHL10 从 pHEN2 载体亚克隆至表达载体 pAB1, 以构
要从事肿瘤免疫学研究工作 。电话 : 027 - 83690694, E 2mail:
Huang_yu1979@ yahoo. com. cn。 建 scFv 表 达 载 体 pAB1 2scFv。进 一 步 以 单 链 抗 体
[通讯作者 ] 　沈关心 ,男 ,教授 ,博士生导师 ,电话 : 027 - SHL10 为 模 板 , 设 计 出 两 对 引 物 。 P1: VHSfi I, 5 ’2
83692611, E 2mail: m jysz@mails. tjm u. edu. cn。 ATTAGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGG2TGC 23 ’; P2:

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VL 2linker, 5 ’2ACTGGCGCGCCCTCCACTTCCACCTCC 2 BSA 洗涤 3 次 ; 重悬于 F ITC 标记的羊抗鼠 IgG溶液 50

ACCTAGGACGGTCAGCTTGGT23 ’; P3: L in 2ker2VH , 5 ’2 μL 中 , 4 ℃孵育 30 m in, 800 r・m in21离心 5 m in, 弃上
GGAGGGCGCGCCAGTATGGCCCAGGTGCAG23 ’; P4: 清液 , PBS21% B SA 洗涤 3 次 , 重悬于 PB S 溶液 300 ～
VL 2NotI, 5 ’2ATGTGCGGCCGCACCTAGGACGGTCAGC 2 400 μL 中上流式细胞仪 , BDFACSCalibur测定其荧光
TT23 ’
。以 P1 为上游引物 , P2 为下游引物 ; 其中在 P2 强度 ,计数阳性结合细胞百分率 。
引入 linker ( GGGGSGGRAS ) 和 酶 切 位 点 A sc I (购 自 2 　结果 　
MB I公司 ) 。利用 P1、P2 扩增出片段 SfiI2scFv2linker2 2. 1 　双价抗体的构建 　通过 PCR 从模板单链抗体
A sc I。以 P3 为上游引物 ,引入酶切位点 A sc I, P4 为下 SHL10 扩增出两个 scFv 片段 SfiI2scFv2linker2A sc I及
游引物 ,扩增出片段 A sc I2scFv2NotI。将此两个目的片 A sc I2scFv2NotI, 经 电泳提 示扩 增片 段大 小 约 750 bp
段通 过 SfiI、A sc I、NotI 3 个 酶 切 位 点 , 连 接 至 载 体 (图 1 ) , 符合预期大小 ; 连接转化后表达载体 pAB1 2
pAB1,以构建双价抗体表达载体 pAB1 2B sFv。将构建 scFv及 pAB1 2B sFv经酶切鉴定 ,分别得到 750 和 1 500
的两个表达载体分别转化大肠埃希菌 TG1, 挑取单克 bp 大小预期产物 (图 2 ) , 测序结果表明序列正确 , 双
隆细菌进行扩增 ,提取质粒进行酶切 、 测序鉴定 。 价抗体的两个片段已连入载体 ,构建成功 。
1. 3 　抗体的诱导表达 　挑取单克隆细菌 , 接种于含
21
100 mg・L 氨苄西林的 2 ×YT 含 1%葡萄糖培养基
中 , 37 ℃振荡培养过夜后 , 第 2 天按 1 ∶100 转接入
新鲜含氨苄西林的 2 ×YT含 0. 1%葡萄糖培养基中 ,
培养至吸光度 (A 600 nm )为 0. 6 ～1. 0 时 ,加入 IPTG至终
21
浓度 1 mmol・L ,置 23 ℃诱导表达 ,分别于 2, 4, 6, 12
和 24 h 收 集 菌 液 1 mL , 将 收 集 的 菌 液 以 8 000
21
r・m in 离心 1 m in,弃上清 ,菌体重悬于 SDS2PAGE 上 　　M. DNA marker; A. 片段 A sc I2scFv2NotI ; B. 片段 SfiI2scFv2
样缓 冲 液 1 00 μL , 混 合 , 沸 水 浴 中 煮 5 m in 后 置 linker2A sc I
- 20 ℃备用 。进行 SDS2PAGE 分析获得最适表达时 图 1 　PCR 扩增出的两个 scFv片段 　
间 。并进行亚细胞定位分析 ,并取空菌 、 空载体作为对
照。
1. 4 　W estern blot 表达 　取表达样品 5 μL 进行 SDS2
PAGE,将电泳后的凝胶 ( 150 mA ×1 h )电转移至硝酸
纤维素膜 , 5%脱脂奶粉 4 ℃封闭过夜 , 加入鼠抗 his
单克隆抗体孵育 2 h,加入辣根过氧化物酶标记的羊抗
鼠 IgG溶液孵育 1 h, 加入底物液 (含 DAB、H2 O2 ) 显
色。 　　A. 表达载体 pAB1 2scFv经酶切后产物 ; B、C均为表达载体
1. 5 　抗体的纯化 　将表达抗体的大肠埃希菌扩大培 pAB1 2B sFv经酶切后产物 ; M. DNA marker
养 ,获得 600 mL 细菌培养物 , 离心收集菌体 。制备外 图 2 　转化后表达载体 pAB1 2scFv及 pAB1 2B sFv的酶切鉴定 　
周质蛋白 , 将收集的菌体按每 100 mL 重悬于 Native 2. 2 　抗体的表达及纯化 　收集少量表达菌体进行
B inding 缓冲液 8 mL 中 , 加入溶菌酶使其终浓度为 1 SDS2PAGE 分析 ,提示单双价抗体均有表达 ; 不同诱导
21
mg・mL , 置冰浴 30 m in, 超声碎菌后 10 000 g 离心 时间分析提示随着时间的延长 ( 2 ～24 h ) 表达总量增
30 m in,取上清液过层析柱纯化 , 收集蛋白 ,透析脱盐 , 加 ; 表达定位分析提示以可溶性蛋白形式表达在周质
B radford法测定蛋白浓度 。 腔中的蛋白量低 ,而以包涵体形式表达仍占较大的量 。
1. 6 　间接免疫荧光流式细胞术 ( FACS) 　培养正常肝 将周质腔提取物进行免疫印迹分析提示在蛋白相对分
细胞系 L02 以及肿瘤细胞系 , 将纯化后的抗体分别与 子量标准约 36 000 及 47 000 ～87 000 之间有条带 (图
21
5 ×10 个细胞混合 (抗体终浓度 10 μg ・mL ) , 37 ℃
5
3 ) ,相对分子量符合预期值 , 即单链抗体相对分子量
21
孵育 30 m in 后 , 800 r ・m in 离心 5 m in, 弃上清液 , 约为 30 000,双价抗体相对分子量约为 60 000,说明抗
PB S21%B SA 洗涤 3 次 ; 加入鼠抗 his抗体 , 37 ℃孵育 体在细菌周质腔有表达 。大量表达纯化后 , 将过柱产
21
30 m in, 800 r ・m in 离心 5 m in, 弃上清液 , PB S21% 物进行 SDS2PAGE 分析提示得到预期产物 。

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2. 3 　双价抗体与不同细胞系结合活性及特异性 　本 3 　讨论 　
实验采用的几种细胞系进行间接免疫荧光测定显示 , 本实验室从 Griffth 1 噬菌体抗体库筛选获得能与
双价抗体与正常肝细胞 L02 结合率降低 ,与 HepG2 细 HepG2 细胞株特异性结合的单链抗体 SLH10, 在此基
胞的结合率增加 (图 4 ) , 说明对靶细胞的结合能力有 础上 ,笔者设计并成功构建双价抗体 。双价抗体的构
所 提 高 。单 链 抗 体 同 MCF 27 细 胞 、Hela 细 胞 、 建有多种形式 ,如利用化学耦联法 、 亮氨酸拉链或部分
SMMC7721 细胞 、A549 细胞有少量非特异结合 , 而双 抗体恒定区来实现二聚化 , 近年来的研究趋向于通过
价抗体同这些细胞的结合率下降 。进一步说明将单链 一个连接肽 ( interlinker) 将两个 scFv 构建在一条链
抗体构建成双价抗体后 , 提高了抗体对靶细胞结合能 上 ,避免了构建步骤复杂 , 以及两个 scFv可能错配形
[ 7, 8 ]
力。 成没有活性的抗体等缺点 。同时实验证实两个
scFv间连接肽的长度对双价抗体介导的细胞效应有
重要意义 ,两个 scFv间的 linker不能太短 ,以有利保持
[9]
抗体形成正确空间构象 , 并利于稳定性 。因此在本
实验中 ,笔者设计了一个 interlinker,长度为 10 个氨基
酸 ,其序列为 GGGGSGGRAS, 其中 G4S是最为常见的
[ 10 ]
连接肽 , 将两个 scFv连接成一条肽链 , 成功获得表
达 ,并具有活性 。
基因工程抗体的表达量不高 ,有活性的产物少 ,一
　　A. pAB1 2B sFv经表达后周质腔提取物 ; B. pAB1 2scFv经
直是这一领域存在的问题 。近年来人们在各种研究中
表达后周质腔提取物 ; M. 预染蛋白 marker
尝试各种表达载体 。真核表达载体能够获得正确折叠
图 3 　细菌周质腔提取物进行 W estern B lot　
的产物 ,但是表达量低 ,不利大量表达纯化 。近年酵母

　　A. scFv、B sFv与正常肝细胞 L02 的结合阳性率分别为 10. 27% , 1. 77% ; B. 与肝癌细胞 HepG2 的结合阳性率分别为 12. 91% ,
17. 95% , C. 与宫颈癌细胞 Hela的结合阳性率分别为 6. 07% , 4. 03% ; D. 与乳腺癌细胞 MCF7 的结合阳性率分别为 4. 57% , 4. 13% ;
E. 与肝癌细胞 SMMC7721 的结合阳性率分别为 8. 12% , 7. 25% ; F. 与肺癌细胞 A549 的结合阳性率分别为 17. 90% , 10. 75 %
图 4 　 scFv和 B sFv同几种细胞系结合活性比较 　

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表达系统有了一定进展 , 但是条件还不成熟 。而相对 gle 2domain antibody app roach to tumor antigen discovery

以上两者 ,原核表达系统价格低廉 , 易于操作 , 能实现 and the development of novel p roteom ics reagents [ J ]. J
M ol B iol, 2004, 341 ( 2 ) : 161 - 169.
大量表达而且可以纯化 ,仍是目前实验中的最优选择 。
[ 3 ] 　Deyev S M ,W aibel R , Pluckthun A , et a l. Design of multi2
笔者将抗体构建到带有信号肽 pelB 的载体 pAB1 上 ,
valent comp lexes using the barnase banstar module [ J ].
表达产物在信号肽的作用下能够被导入细菌的周质
N a t B iotechnol, 2003, 21 (12) : 1486 - 1492.
腔 。由于具有与真核细胞内质网相似的氧化环境 , 小
[4] B ing Y, M ing N , W en H L , et a l. Human scFv antibody
分子抗体可以在各种分子伴侣作用下得以形成正确的 fragments specific for HCC selected from a large human
[8]
折叠 。经过纯化后 , 测定蛋白浓度提示我们大约能 naive scFv phage disp lay library [ J ]. W orld J
从 1. 0 L 细菌培养物中得到 0. 8 ～1. 0 m g有活性的产 Gastroen terol, 2005, 11 ( 26 ) : 3985 - 3989.
物 。鉴定其细胞结合活性发现 , 双价单链抗体同亲本 [ 5 ] 　余 　冰 ,倪 　明 , 朱慧芬 , 等 . 肝癌细胞特异性结合单链
抗体比较 ,其细胞结合活性有所提高 。其可能原因是 抗体的表达及其特性初步研究 [ J ]. 细胞与分子免疫学
一方面双价抗体具有两个结合位点 , 提高了抗体与靶 杂志 , 2005, 21 ( 6 ) : 710 - 713.
[ 6 ] 　程 　欣 ,黄永建 ,朱慧芬 ,等 . HCC 特异性结合的 scFv 2
分子的结合概率 , 另一方面与靶细胞结合时同时有两
AP融合蛋白的构建与表达 [ J ]. 细胞与分子免疫学杂
个位点结合 ,提高了其结合牢固程度 ,从而提示双价抗
志 , 2005, 21 ( 6 ) : 714 - 716.
体同靶细胞结合的亲合力要高于 scFv。同多个细胞系
[ 7 ] 　Korn T, Nettelbeck D M , Volkel T, et a l. Recom 2binant bis2
的结合活性比较发现 , scFv有一定的非特异性结合 ,构 pecific antibodies for the targeting of adenoviruses to CEA 2
建成双价抗体后 ,同 HepG2 细胞的结合率增加 ,而对其 exp ressing tumour cells: a comparative analysis of
他细胞系结合率下降 ,这说明其结合活性有所提高 。 bacterially exp ressed single 2chain diabody and tandem scFv
双价双特异抗体较 scFv具有更多的优势 , 因而具 [ J ]. J Gene M ed , 2004, 6 ( 6 ) : 642 - 651.
有广泛的前景 。 scFv分子相对分子量约为 30 000, 血 [8] Todorovska A , Roovers R C, Hoogenboom H R , et a l. De 2
浆清除快 ; 双价抗体相对分子量约为 60 000,因而在血 sign and app lication of diabodies, triabodies and tetrabodies

液中能够具有更长的半衰期 , 而不影响其对肿瘤的穿 for cancer targeting [ J ]. J Imm unol M ethods, 2001,

248 ( 1 - 2 ) : 47 - 66.
透力 。本实验结果也支持双价抗体由于结合位点的增
[ 9 ] 　Gall F L , Reush U , Kip riyanov S M , et a l. Effect of linker
加 ,比具有更高的亲合力 。本实验为将来进一步构建
sequences betw een the antibody variable domains on the
多价或多特异性抗体 , 为其应用于肿瘤的诊断与治疗
formation, stability and biological activity of a bispecific
奠定基础 。
tandem diabody [ J ]. P rotein Eng D es S el, 2004, 17 ( 4 ) :
[参考文献 ]
357 - 366.
[ 1 ] 　Kip riyanov SM , LeGall F. Generation and p roduction of en2
[ 10 ] 　沈关心 ,周汝麟 . 现代免疫学实验技术 [M ]. 武汉 : 湖北
gineered antibodies [ J ]. M ol B iotechnol, 2004, 26 ( 1 ) : 39 -
60. 科学技术出版社 , 2002. 55 - 94.

[ 2 ] 　Zhang J B , L i Q G,M ackenzie R , et a l. A pantavalent sin2

3
重组可溶性 TRA IL 冻干保护剂的初步筛选
李政海 ,李继东
(深圳新鹏生物工程有限公司 , 518057 )

[摘 　要 ] 　目的 　筛选出适合肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 ( TRA IL ) 冻干制剂的保护剂 。方法 　在 TRA IL 蛋

白中加入不同浓度配方的甘露醇 、
清蛋白和乳糖 ,经过冷冻干燥 ,观察冻干制剂的色泽 、
外观 、
溶解度和澄明度 ,并且测定
冻干制品的水分和生物学活性 ,筛选出最佳保护剂 。结果 　初步筛选出 2%甘露醇 + 3%乳糖作为 TRA IL 蛋白的保护
剂 。结论 　TRA IL 蛋白药物加入该保护剂后 ,外观 、
溶解度 、
澄明度及生物活性都比较好 。在不同温度 ,对 TRA IL 蛋白生
物活性有很好的稳定作用 。
[关键词 ] 　肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 ; 保护剂 ; 筛选
[中图分类号 ] 　R977. 6; TQ460. 6 　　　 [文献标识码 ] 　A 　　　 [文章编号 ] 　1004 20781 (2006) 07 20645 203

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