602 ISSN1007 - 8738 细胞与分子免疫学杂志 ( Chin J Cell Mol Immunol) 2005, 21 ( 5 )

・论著 ・ 文章编号 : 1007 - 8738 ( 2005 ) 05 - 0602 - 03

从大容量人源噬菌体抗体库中筛选抗黑素瘤特异性抗体
李 　淼 , 陈宇萍 , 王 　刚 , 李春英 , 殷河慧 , 田艳丽 , 高天文 3 (第四军医大学西京医院皮肤科 , 陕西 西安 710032 )

A spec if ic human scFv aga in st ma lig2 随机挑选的克隆中 , 筛得 1 株抗 MM 细胞的抗体 , 该抗体对

人的鳞癌细胞 、角质形成细胞 、黑素细胞 、角蛋白 、胰蛋白
nan t m elanoma selected from a large 酶 、转铁蛋白及小鼠 IgG等细胞或抗原的结合反应均呈阴性 。
human phage an tibody library 免疫组化染色显示 , 该抗体与 MM 细胞系 L ibr 的染色呈阳
性 , 对黑素细胞和痣细胞的染色呈阴性 。 DNA 测序结果表
L I M iao, CHEN Yu 2ping, WAN G Gang, L I Chun 2y ing,
明 , 该抗体 VH 属于人 IgG VH 5 亚群 , VL 属于人 Vκ 亚型 。
Y IN He2hu i, T IAN Yan 2li, GAO T ian 2w en3
结论 : 通过筛选噬菌体抗体库获得到 1 株抗 MM 细胞的特异
Departm ent of Dermatology Xijing Hosp ital, Fourth M ilitary M edi2
性抗体 , 为 MM 的靶向治疗研究奠定了基础 。
cal University, Xi’
an 710032, China
[关键词 ] 　噬菌体 ; 抗体库 ; 恶性黑素瘤 ; 单链抗体
[ Abstract] 　 A IM : To o b ta in the sp e c ific hum a n scFv [中图分类号 ] 　R739. 5; R392. 11 　　 [文献标识码 ] 　A
a ga in s t m a ligna n t m e la nom a (MM ) u s ing p ha ge a n tibo dy li2
b ra ry te chno lo gy. M ETHOD S: The lib ra ry w a s p a nne d w ith
　　恶性黑素瘤 (m alignant melanoma, MM )是一种对
a ce rta in kind o f MM ce lls fo r 4 ro und s. The a n tige n b ind ing
放疗和化疗均不敏感的高度恶性肿瘤 。近年来 , 以
a c tivitie s o f ra ndom c lo ne s w e re te s te d by EL ISA in o rde r to
se le c t sp e c ific a n tibo d ie s, w h ich w e re the n e xam ine d by
抗体为基础的免疫疗法 、肿瘤靶向治疗和基因治疗
DNA se que nce a na lys is a nd im m uno h is to chem is try. 成为肿瘤治疗研究的热点 , 部分已经在实验中甚至
[1 - 3]
RESUL TS: In EL ISA a nd im m uno h is to chem ica l s ta in ing, 在临床上取得了初步的效果 , 其关键是寻找高
the po s itive c lo ne se le c te d from the 80 ra ndom c lo ne s w a s 特异性 、高亲和力的人源性抗体 , 而这正是现在亟待
a b le to b ind o ne kind o f MM ce ll sp e c ifica lly, w h ile no t a b le 解决的问题 。利用噬菌体抗体库技术 , 则是目前解
to b ind o the r irre la va n t ce lls o r a n tige n s, such a s hum a n ’s 决这个问题的一个较好的方法 。本研究旨在从大容
squam o u s ca rc inom a ce lls, ke ra tino cyte s, m e la no cyte s,
量 、具有良好多样性的人源噬菌体抗体库中筛选特
ke ra tin, tryp s ina se , tra n sfe rrin a nd m o u se IgG , e tc. The
异性的抗 MM 细胞的抗体 , 为 MM 的治疗探索更佳
a n tibo dy’s VH ge ne s be lo nge d to hum a n IgG VH 5 subg ro up
的途径 。
a nd the VL be lo nge d to hum a n Vκ sub typ e de te rm ine d by
DNA se que nce a na lys is. CO NCL US IO N: O ne sp e c ific hu 2
m a n p ha ge a n tibo dy a ga in s t MM ce lls w a s o b ta ine d by 1 　材料和方法
[4]
p ha ge d isp la y te chn ique , w h ich m a y be u se fu l fo r fu rthe r 1. 1 　材料 　噬菌体抗体库为海军总医院构建 ,库
de ve lo pm e n t o f tum o r2ta rge te d the rap ie s. 9
容为 1 ×10 , 经单载体细胞内重组法扩增后库容可
[ Keywords] 　p ha ge; a n tibo dy lib ra ry; m a ligna n t m e la nom a 达 3 ×10 。大肠杆菌菌株 XL1 2blue 及 VCSM13 辅助
12

(MM ) ; s ing le 2cha in Fv ( scFv )

病毒 为 本 室 常 规 保 存 。两 株 MM 细 胞 系 L iB r 和
[摘 要 ] 　目的 : 用黑素瘤 (MM )细胞系筛选大容量人源噬菌 A375, 以及人的黑素细胞 、角质形成细胞 、鳞癌细胞
体抗体库 , 获得能与 MM 细胞特异性结合的人源性单链抗体 等 , 均为本实验室常规保存 。 DNA 纯化试剂盒和限
( scFv) 。方法 : 用完整的 MM 细胞对大容量人源噬菌体抗体 制性内切酶购自 Takara公司 。 HRP 2抗 M13 单克隆抗
库进行 4 轮“吸附 2洗 脱 2扩 增 ”
筛选 , 并通过细胞 EL ISA 法对 体 (mAb )购自 Pharmacia 公司 。
随机挑选的克隆进行抗原结合活性测定 , 得到的阳性克隆进
1. 2 　方法
一步做 DNA 序列测定和免疫组化染色鉴定 。结果 : 从 80 个
1. 2. 1 　抗 MM 抗体的筛选 　用 MM 细胞系 L iB r对
收稿日期 : 2005 - 02 - 22; 　修回日期 : 2005 - 03 - 28 噬菌体抗体库进行 4 轮特异性富集筛选 , 每轮筛选
作者简介 : 李 　淼 (1976 - ) , 男 , 黑龙江哈尔滨人 , 主治医师 , 硕士.
均测定次级库滴度并计算噬菌体投入产出比 (回收
Tel: ( 029) 88508566; Email: youlonglm @ sina. com
7
3 Corresponding author, Tel: ( 029) 83375401 率 )作为特异性噬菌体抗体富集的指标 。使约 2 ×10
Email: gaotw @ fmmu. edu. cn 个 L ibr细胞悬浮 , 离心取细胞沉淀 , 加入 1 mL 30 g/L
ISSN1007 - 8738 细胞与分子免疫学杂志 ( Chin J Cell Mol Immunol) 2005, 21 ( 5 ) 603

的 BSA 2PB S, 于 37 ℃封闭 1 h。离心后弃封闭液 , 加 物镜下观察 , 切片中阳性细胞数占切片中全部同类

入 1 mL 噬菌体抗体库 , 于 37 ℃缓慢颠倒混匀 2 h。
离心后弃上清 , 细胞沉淀用 PBS洗 20 遍 , 立即加入
1 mL 对数期生长的 E. coli XL1 2blue, 室温放置 30 m in
+
进行感染 。然后取适量铺 AM P 培养皿以测定结合
的噬菌体数量 。其余转入三角烧瓶中 , 加入 SB 培养
液至总体积为 10 mL , 37 ℃振荡 1 h 后加入 70 mL SB
培养液 , 并加入 AM P 使其浓度为 0. 1 g /L。继续于
37 ℃振荡培养 , 至 A 值为 0. 5 左右时 , 加入 1 mL 的
VCSM13, 于 30 ℃振荡 。约 16 h 后离心取上清浓缩 ,
即为次级噬菌体抗体库 , 按此方法反复筛选 4 轮 。
1. 2. 2 　噬菌体抗体的表达 　从第 3 轮和第 4 轮筛选
后的培养皿上分别挑取 40 个菌落各加入到 1. 5 mL
细胞数的 10%以上为阳性 。
2 　结果
2. 1 　抗 MM 抗体的筛选及鉴定 　经过 4 轮筛选 , 噬
菌体抗体回收率得到约 53 倍的富集 (表 1 ) 。从第 3
轮和第 4 轮挑取的共 80 个单菌落制备噬菌体抗体 ,
经 EL ISA 检测有 57 株可与 MM 细胞系 L ibr和 A375
均结合 , 其中有两株不与人的黑素细胞 、角质形成细
胞 、鳞癌细胞和其他无关抗原结合 , 分别为克隆 12
和克隆 15, EL ISA 的结果 (A490值 )见图 1。
表 1 　每轮筛选噬菌体抗体库的投入产出比
Tab 1 　Output/ input in panning from phage antibody library

LB 培养液中 , 于 37 ℃振荡培养至 A 600≈ 0. 6, 倒出菌 Round Input Output Output/ input

液离心 , 取 沉 淀 供 提 取 质 粒 用 。于 残 液 中 再 加 入 1 3 ×10 12
1. 9 ×10 8
6. 33 ×10 - 5
12 8
2 1. 79 ×10 　　 3. 07 ×10 　 1. 72 ×10 - 4
1. 5 mL LB , 振荡培养 1 h, 加 30 μL 的 VCSM13 超感 3 3 ×1012 6 ×108 2 ×10 - 4
染 , 于 30 ℃振荡培养过夜 。次日 , 将菌液离心 , 上清 4 5 ×1011 1. 685 ×109 　 3. 37 ×10 - 3

即为噬菌体抗体 , 收集并于 4 ℃保存备用 。

1. 2. 3 　抗体特异性的细胞 EL ISA 检测 　用 L iB r细
胞包被 96 孔板 , 以 5 g /L 的戊二醛固定 15 m in, PBS
洗涤 2 次后加入 30 g /L 的 B SA 2PBS ( 300μL /孔 ) , 于
37 ℃封闭 1 h。弃去封闭液 , PBS 洗涤 2 次后 , 加入
待测噬菌体抗体 ( 50 μL /孔 ) 于 37 ℃结合 1 h。 PBS
5 000 稀释的 HRP 2抗 M13 mAb
洗涤 3 次后 , 加入 1 ∶
( 100 μL /孔 )于 37 ℃孵育 1 h。PBS洗涤 3 次后 , OPD
图 1 　两株阳性克隆与 MM 细胞及对照细胞的反应性
底物显色 。显色阳性的克隆再以 MM 细胞 A375、人 Fig 1 　Reactivity of the two positive phage antibodies to different
的鳞癌细胞 、角质形成细胞 、黑素细胞 、转铁蛋白 、 cells
角蛋白 、胰蛋白酶和鼠 IgG等为抗原 , 按相同方法鉴 Col 1 - 5: L iB r, A375, melanocyte, SC cell and keratinocyte, respectively.

定其抗原抗体反应的特异性 。
1. 2. 4 　酶切鉴定和 DNA 测序 　提取阳性克隆的质 2. 2 　两株阳性克隆的酶切鉴定 　两株阳性克隆中 ,

粒 , 用限制性内切酶 N he I和 H in d Ⅲ双酶切鉴定 (完 只有克 隆 15 用 N he I和 H in d Ⅲ双酶 切后 可见 约

850 bp 片段 (图 2 ) 。
整抗体两酶切位点间片段约 800 ～900 bp ) ; 测序由
上海生工公司测定 。
1. 2. 5 　免疫组化染色 　取细胞爬片和常规脱蜡至水
后的石蜡组织切片 , 用 30 mL /L 的 H2 O2 室温反应
10 m in, 微波抗原修复 , 加山羊血清封闭后滴加待测
抗体 4 ℃过夜 , 滴加二抗 ( HRP 2抗 M13 抗体 ) , 37 ℃
孵育 30 m in, DAB 显色 (于显微镜下观察至阳性结果 图 2 　两株阳性克隆的酶切鉴定
出现而背景尚未着色时及时中止显色 ) 。再以苏木素 Fig 2 　Restriction enzyme digestion analysis of p lasm ids ( clone

轻度复染 , 乙醇梯度脱水 , 二甲苯透明及中性树胶封 12 and clone 15 )

M: DNA marker; 1: D igested p lasm id clone 12; 2: Undigested p lasm id
固 。每次实验均以 PB S代替一抗作为阴性对照 。结
[5]
clone 12; 3: D igested p lasm id and target fragment from clone 15; 4: Undi2
果判定采用林彤等 的判定方法 , 每张切片在 40 倍
gested p lasm id from clone 15.
 604 ISSN1007 - 8738 细胞与分子免疫学杂志 ( Chin J Cell Mol Immunol) 2005, 21 ( 5 )

2. 3 　克隆 15 的可变区 D NA 序列测序结果 　测序结 抗体库技术的新进展 , 利用此技术 , 可不经免疫直接

[8]
果分析表明 , 克隆 15 的 VH 基因为 378 bp , 属于人免 从噬菌体抗体库中筛选出特异性抗体 。特异性人
疫球蛋白 VH 5 亚群 ; VL 基因为 331 bp , 属于人 Vκ 亚 源抗 MM 抗体的筛选 , 对以抗体为基础的 MM 靶向
群 。克隆 15 的测序和分析结果见图 3。 治疗和影像学诊断具有重要的意义 。抗肿瘤细胞膜
VH 的核苷酸序列 : 表面抗原的抗体 , 则比抗细胞内抗原的抗体更有价
GCTAGCTGAGGA GACGGTGACCGTGGTCCCTTTGCCCCA GACGTCCA TGTA GTAGTA GCCACCGT
AGTTACTGTA GTCGGTTTGCCTCGCACA GTAATACA TGGCGGTGTCCGAGGCCTTCA GGCTGCTC 值 。本研究中所用的抗体库为经过单载体细胞内重
CACTGCA GGTAGGCGGTGCTGA TGGACTTGTCGGCTGA GA TGGTGACCTGGCCTTGGAA GGACG
组法 (Loxp 2Cre定位重组系统 ) 两次重组配对后构建
GGCTGTA TCCGGTA TCA GAGTCACCA GGA TA GATGATCCCCA TCCACTCCA GGCCTTTCCCGGGC
12
ATCTGGCGCACCCA GCCGATCCA GTAGCTGGTAAGGCTGTA TCCAGAACCCTTACA GGAGATCTT 的人源性大容量抗体库 , 重组后库容约为 3 ×10 ,
CAGA GACTCCCCGGGCTTTTTCACCTCTGCTCCAGACTGTACCAGCTGGACCTC
具有良好的多样性 , 在获得高亲和力抗体以及进行
VL 的核苷酸序列 :
[9]
ATGCCGAAATTGTGA TGACATA GTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCA GGGGAAAGA GCCACC 抗体性能改造方面具有较强的优势 。
CTCTCCTGCA GGGCCA GTCAGA GTGTTA GCA GCA GCTACTTA GCCTGGTACCA GCAGAAACCTG
GCCA GGCTCCCA GGCTCCTCATCTA TGGTGCATCCA GCAGGGCCACTGGCA TCCCAGACA GGTT
EL ISA 的结果表明 , 所得克隆 15 能与 MM 细胞
CAGTGGCAGTGGGTCTGGGACA GACTTCACTCTCACCATCA GCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTG 系 L iB r和 A375 结合 , 而与人的鳞癌细胞 、角质形成
CAGTGTA TTACTGTCAGCA GTATGGTA GCTCACCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAA GCTGACC
GTCCTA GG 细胞 、黑素细胞 、角蛋白 、胰蛋白酶 、转铁蛋白及小
图 3 　人源性抗 MM 细胞 scFv可变区基因的序列 鼠 IgG等无关细胞或抗原均不结合 , 且该抗体对黑
Fig 3 　 DNA sequences of the variable region of human scFv 素细胞和痣组织的免疫组化染色均呈阴性 , 证实其
against MM cell
为特异性的抗 MM 细胞的抗体 。但是免疫组化染色
2. 4 　克隆 15 的免疫组化染色 　以克隆 15 为一抗 , 结果显示 , 该抗体与 L ibr 细胞的结合染色呈阳性 ,
对 L ibr细胞的染色呈阳性 (图 4A ) , 阴性对照结果明 而与 A375 细胞的结合染色呈阴性 , 提示该抗体所结
确 , 呈阴性 (图 4B ) 。A375 细胞 、黑素细胞和痣组织 合的两种 MM 细胞上的膜抗原在种类和结合活性方
染色均为阴性 。 面可能有所不同 。在 L ibr细胞上可能有较高的表达 ,
而由于 EL ISA 的灵 敏 度 较 高 或 操 作 的 原 因 , 反 使
A375 细胞的 A 490值较高 , 其原因有待进一步研究 。

参考文献 :
[ 1 ] 宋丽华 , 宋现让 . 乳腺癌治疗新药 Hercep tin [ J ]. 国外医学 ・肿
瘤学分册 , 2002, 29 ( 1) : 39 - 43.
[ 2 ] 王碧芸 . Hercep tin 对转移性乳腺癌的靶向治疗作用 [ J ]. 中华肿
瘤杂志 , 2003, 25 ( 2) : 204 - 205.
[ 3 ] McLaughlin P, Grillo 2Lopez AJ, L ink BK, et a l. R ituxim ab chim eric
anti2CD20 monoclonal antibody therapy for relap sed indolent lympho2
ma: half of patients respond to a four2dose treatm ent p rogram [ J ]. C lin
O ncol, 1998, 16: 2825 - 2833.
图 4 　L ibr细胞的免疫组化染色 [ 4 ] 王 　刚 , 王 　琰 , 化 　冰 , 等 . 人源性天然抗体库的构建及初步
Fig 4 　 Immunohistochem ical staining in L ibr cells ( ×400 ) 鉴定 [ J ]. 细胞与分子免疫学杂志 , 2002, 18 ( 1) : 69 - 72.
A: L ibr cells; B: Negative control. [ 5 ] 林 　彤 , 孙建方 , 曾学思 , 等 . 恶性黑素瘤和普通痣细胞痣细胞
外信号调节激酶途径相关蛋白的研究 [ J ]. 中华 皮肤科 杂志 ,
3 　讨论 2004, 37: 506 - 508.

mAb 可以和癌细胞表面的标记分子结合 , 在肿 [ 6 ] Jackson H, Bacon L, Pedley RB, et al. Antigen specificity and tumor tar2
geting efficiency of human carcinoembryonic antigen2specific scFv and af2
瘤的定位诊断和导向治疗研究中具有重要价值 。但
finity2matured derivatives[ J ]. B r J Cancer, 1998, 78 ( 2) : 181 - 188.
是传统用的 mAb的相对分子质量 (M r ) 大 , 不易深入 [ 7 ] Shaw ler DL, Bartholomew RM , Sm ith LM , et al. Human immunere2
到肿瘤组织的内部 ; 而且其鼠源成分容易激发人抗 sponse to multip le injections of murine monoclonal IgG[ J ]. Imm unol,
[7]
鼠抗体反应 ( HAMA 效应 ) , 限制了其有效应用 。 1985, 135 ( 2) : 1530 - 1535.
[ 8 ] 董志伟 , 王 　琰 . 抗体工程 [M ]. 第 2 版 . 北京 : 北京医科大学出
基因工程 scFv具有 M r 小 、免疫源性低 、穿透性强 ,
[6]
版社 , 2002: 109 - 117.
以及在癌组织中分布均匀等多种优点 , 具有较好 [ 9 ] Sblattero D , B radbury A. Exp loiting recombination in single bacteria
的临床应用前景 。 to make large phage antibody libraries[ J ]. N a t B iotechnol, 2000, 18:

噬菌体抗体库技术是将噬菌体展示技术应用于 74 - 80.