医学分子生物学杂志 , 2006, 3 ( 4) : 260 2262 　J Med Mol B iol, 2006, 3 ( 4) : 260 2262

抗 TfR 单链抗体 —AP融合蛋白的构建 、表达与鉴定

1, 2 1 1 1 1 1 1 3 1
肖代雯 , 黄宇 , 沈昕 , 邢薇 , 刁智娟 , 刘静 , 雷萍 , 陶娟 , 沈关心

1
华中科技大学同济医学院免疫学系 　武汉市 , 430030
2
四川省人民医院 　成都市 , 610072
3
华中科技大学同济医学院附属协和医院皮肤科 　武汉市 , 430022

【摘要 】　目的 　构建 、表达和鉴定抗转铁蛋白受体 ( TfR ) 单链抗体 ———碱性磷酸酶 (AP) 融合蛋白 。

方法 　用 S fi Ⅰ和 N ot Ⅰ分别酶切抗转铁蛋白受体 scFv表达质粒 pUC19 /119, 获得 scFv基因 , 直接亚克隆
到表达载体 pDAP2 中 , 在 TG1 菌中表达 scFv2AP 融合蛋白 , SDS2PAGE 分析 scFv2AP 的分子量 , 酶免疫测
定鉴定其抗体和酶活性 。结果 　 scFv2AP融合蛋白表达载体经 scFv特异性引物 PCR 扩增 , 扩增产物经琼脂
糖凝胶电泳可见约 700 bp 条带 , 符合 scFv基因理论值大小 , IPTG诱导产物经 SDS2PAGE 分析可见约为 75
ku的蛋白条带 , 符合 scFv2AP融合蛋白分子量的理论值大小 , 直接细胞 EL ISA 测定证明表达产物 scFv2AP
融合蛋白具有结合人 TfR 和 AP活性的双重功效 。结论 　抗人 scFv2AP融合蛋白表达载体构建成功 , 表达产
物具有结合人 TfR 和 AP活性的双重功效 , 为其临床检测应用奠定了基础 。
【关键词 】　转铁蛋白受体 ; 单链抗体 ; 碱性磷酸酶 ; 融合蛋白
【中图分类号 】　Q816

Con struction, Expression and Character iza tion of scFv 2AP Fusion
Prote in aga in st Tran sferr in Receptor
1, 2 1 1 1 1 1
X IAO Daiw en , HUANG Yu , SHEN Xin , X IN G W ei , D IAO Zhijuan , L IU J ing ,
1 3 1
LE I Ping , TAO Juan , SHEN Guanxin
1
D epa rtm en t of Imm unology, Tong ji M ed ica l College of Huazhong U n iversity of S cience & Technology,
W uhan, 430030, Ch ina
2
The People ’s Hospita l of S ichuan P rovince, Chengdu, 610072, Ch ina
D epa rtm en t of D erm a tology, U n ion Hospita l, Tong ji M ed ica l College, Huazhong U n iversity of S ci2
3

ence & Technology, W uhan, 430022, Ch ina

【Abstract】　O bjective 　 To construct, exp ress and characterize scFv2AP fusion p rotein against
transferrin recep tor1M ethods　ScFv gene was obtained by digesting scFv exp ressing vector pUC19 /
119 w ith Sfi I and Not I restriction enzymes, then subcloned into exp ressing vector pDAP2, which
was then transformed into E1 coli TG11 The positive colonies were selected by p lasm id PCR 1 The ex2
p ression of fusion p rotein ( scFv2AP ) was induced by IPTG and its activity was detected by direct
cell EL ISA 1 Results　Agarose gel electrophoresis showed a p roduct of p lasm id PCR of 700 bp; SDS2
PAGE disp layed a band of 75 ku and direct cell EL ISA showed that scFv2AP could specifically bind
to human TfR and had AP enzyme activity1Conclusion 　W e have successfully constructed the scFv2
AP fusion p rotein against transferrin recep tor1
【 Key words】　 transferrin recep tor; single chain Fv fragment; alkaline phosphatase; fusion p ro2
teins

资助项目 : 国家自然科学基金 (No130500437)

作者简介 : 肖代雯 , 女 , 1977 年生 , 硕士研究生
通讯作者 : 沈关心 (电话 : 027 283692640, E 2mail: myjsz@mails1 tjm u1 edu1 cn)
This work was supported by a grant from the National Natural Science Foundation of China (No1 30500437)
Author’s brief introduction: X IAO Daiwen, female, born in 1977, Graduate student for master degree
Corresponding author: SHEN Guanxin ( Tel: 86 227 283692640, E 2mail: myjsz@mails1 tjm u1 edu1 cn)
 医学分子生物学杂志 , 2006, 3 ( 4) : 260 2262 　J Med Mol B iol, 2006, 3 ( 4) : 260 2262 ・261・

　　转铁蛋白受体 ( TfR ) 是一种表达于快速增殖 物 , A405测值 。重复 3 次 。

细胞的跨膜糖蛋白 , 与细胞增殖期所需物质转运有
2 　结果
密切关系 。在许多肿瘤细胞表面 , 特别是在肝脏肿
[ 1 22 ]
瘤细胞表面高度表达 。因此 , 抗 TfR 抗体被认 211 　抗 TfR scFv2AP融合蛋白表达载体的构建与鉴定
为是目前可用于肿瘤定位诊断和靶向治疗可行性较 含抗 TfR scFv基因的质粒 pUC19 /119 用 S fi Ⅰ
[ 3 24 ]
高分子 。本研究在已成功构建抗 TfR ScFv的基 和 N ot Ⅰ双酶切 , 琼脂糖凝胶电泳可见 3 000 bp 的
础上 , 进一步利用基因工程技术制备抗 TfR scFv pUC19 /119 质粒条带和获约 700 bp 的 ScFv基因条
碱性磷酸酶 ( AP ) 的融合蛋白 , 并进行表达及其 带 (图 1 ) , 然后将 scFv 基因与相应酶切的携带
[5]
活性测定 。 AP 基因的 pDAP2 载体连接 , 产物转化大肠杆菌
+
TG1, 在 Amp 的 LB 平板上 , 获得 20 ～30 个菌落 ,
1 　材料和方法
选取 6 个阳性菌落经扩增培养后进行小量质粒提
111 　细菌和载体 取 ,做质粒 PCR , PCR 产物经电泳鉴定 , 其中来自 5
大肠埃希菌 TG1 购自 Stratagen 公司 。含抗人 个单克隆菌落的质粒 PCR 产物在约 700 bp 处均可
[5]
TFR ScFv 的表达载体 pUC19 /119 由本室构建 , 见一明显条带 (图 2 ) , 表明 scFv 基因已亚克隆至
表达载体 pDAP2 由奥地利 Kerschbaum er博士惠赠 , pDAP2 载体中 。 1 个单克隆菌落的质粒 PCR 产物
含碱性磷酸酶 ( AP ) 基因 , scFv 可克隆到 AP 基 在相应位置可见一较弱的条带 ,可能为假阳性 。
因表达载体 中 , 含 Lac 启 动 子 , 可 用 IPTG 诱 导
ScFv2AP融合蛋白的表达 , 利用其 N 端的 pelB 前
导肽可引导融合蛋白到达质周腔 , 6 2H is标记 , 便
于用亲合层析纯化 。
112 　细胞株
肝癌细胞株 7721, 高表达 TFR , 本室保存 。
113 　外周血淋巴细胞
密度梯度离心分离正常人外周血单个核细胞
( PBMC ) , 静止状态下低表达 TFR。
图 1 　质粒 pUC19 /119 限制性内切酶双酶切
114 　酶类
M: DNA marker;
T4 DNA 连接酶购自 USB 公司 ; 小牛碱性磷酸
1: 质粒 pUC19 /119 经 S fiⅠ和 N otⅠ双酶切
酶 、 RNA 酶购自 Boerhinger M annheim 公司 。 S fi Ⅰ
和 N otⅠ内切酶为 Ferm entas试剂公司产品 。
115 　抗 TfR scFv - 碱性磷酸酶融合蛋白表达载体的构建与
表达
　　用 S fi Ⅰ和 N ot Ⅰ分 别 酶 切 scFv 表 达 质 粒
pUC19 /119, 电泳回收 scFv 基因 , 与经相应酶切
的表达载体 pDAP2 连接 , 构建 scFv2AP 表达载体 ,
转化 TG1 大肠杆菌 , 用质粒 PCR 筛选阳性菌落 ,
IPTG诱导 scFv2AP融合蛋白的表达 。取 IPTG诱导
的细菌培养上清 , SDS2PAGE 鉴定其分子量 。
图 2 　抗 TfR scFv - AP 融合基因原核表达载体单克隆菌落
116 　直接细胞 EL ISA 法鉴定抗 TfR scFv - 碱性磷酸酶融
质粒 PCR 鉴定图
合蛋白活性
7
M: DNA marker; 1 ～6: 质粒 PCR 产物
　　取对数生长的 SMMC7721 细胞及 PBMC1 ×10
个 /m l, 分别加入 96 孔反应板中 , 每孔 20 μ l, 加 212 　抗 TfR scFv2AP融合蛋白的诱导表达与鉴定
入戊二醛 20 μ l, 固定 5 m in, PB S洗细胞 2 次 , 加 含 scFv2AP 基因表达载体的阳性转化菌培养过
含 1 % B SA 的 PBS 封闭液 200 μ l/孔 , 37 ℃ 2 h, 夜 , IPTG诱导表达 , 细菌培养上清作 SDS2PAGE,
PB S洗 3 次 , 每孔加入 IPTG诱导的细菌培养上清 可见一约 75 ku 的特异性蛋白条带 , 符合 ScFv - Ap
100 μ l, 37 ℃反应 60 m in, PB S洗细胞 3 次 , 加底 融合蛋白的分子量 , 空菌未见 75 ku 的蛋白条带
 ・262・
(图 3 ) 。表明抗 TfR scFv2AP 融合蛋白构建 、表达
成功 。
图 3 　12 % SDS2PAGE检测 scFv2AP的表达
1: 空菌 TG1; 2: 蛋白 M arker; 3: scFv2AP诱导上清液
213 　抗 TfR scFv2AP融合蛋白的结合活性鉴定
TfR 阳性细胞 SMCC7721, 加 scFv2AP 细菌培
养上清后 , 加 AP的底物显色 , 酶标仪测 405 nm A
值 , 样品孔的平均 A 值为 ±1121, 明显高于 PBMC
A 值 ( ±0152 ) 及仅含 Ap 表达载体转化菌表达产
物对照的 A 值 ( ±0132 ) 。说明 IPTG 诱导培养的
细菌上清含有与人 TfR 特异性结合并具有 AP 活性
的的融合蛋白 。
3 　讨论
TfR 通常分布于快速增殖的细胞膜表面 , 特别
是在肿瘤细胞表面高度表达 , 因此 , 检测细胞表面
TfR 可能用于肿瘤的诊断和预后的评估 。对白血
[ 6 27 ]
[2]
病 、淋 巴 瘤 、肺 癌
[9]
瘤 等的研究也证实 TfR 对肿瘤的诊断和预后判断
具有潜在的应用价值 。此外 , 人血清中还存在可溶
性转铁蛋白受体 ( sTfR ) , 是缺少胞浆和跨膜部分
的 TfR 片段 , 有研究表明 , 血清 sTfR 可反应机体
铁的代谢状况 。检测 sTfR 可作为缺铁性贫血的辅
[ 10 ]
助诊断指标 , 能较好地评价体内铁缺乏状况及
[ 11 ]
红细胞生成情况 。 sion of transferrin recep tor by human colon cancer cells directly
目前对 TfR 的检测多为免疫学方法 , 使用的抗
体主要为单克隆抗体和多克隆血清 。 scFv 是由免
疫球蛋白 VH 和 VL 相连形成的单一肽链 。 Fv片段
为抗体分子的一个小单位 。与单克隆抗体相比 ,
[ 10 211 ]
scFv具有以下优点
体分子的 1 /6, 从而组织穿透力强 , 体内清除快 ;
特别适合于某些感染性疾病和肿瘤的临床诊断和治
疗 ; ②可由大肠埃希菌发酵大量生产 ; ③由于是单
链 , 易于进行分子改造 , 制备融合蛋白 。本研究制
肖代雯 , 等 . 抗 TfR 单链抗体 —AP融合蛋白的构建 、表达与鉴定
备的抗 TfR scFv 具有很好的特异性和敏感性 , 用
于免疫组化检测很有优势 。
常规的酶免疫及荧光免疫分析 , 需将抗特异性
抗体 (一抗 ) 的二抗用酶或荧光素标记 。此过程
对每一批标记的抗体都需要标准化 。通过基因工程
技术 , 按特定的需要在 scFv 上连接酶构成融合蛋
白 , 可取代传统化学交联的酶标抗体并可大量制
备 。由于 scFv2酶 融合蛋白具有双重特性 , 可特异
性与抗原结合 , 同时又具有酶的活性 。与 M cAb 相
比 , 分子量小 , 无抗体分子的恒定区 , 试验时背景
反应低 , 作为免疫检测及抗原定位分析的试剂有其
独特的优点 。 scFv2酶 融合蛋白应用于免疫学检测
可省略繁琐的酶标记或荧光标记等操作步骤 , 如
AP和抗 CEA 或 AFP 等肿瘤相关抗原的 scFv2酶 融
合蛋白 , 既具有 AP 的活性 , 又可与 CEA 或 AFP
结合 , 通过一步法即可检测血清标本中的 CEA 或
AFP。
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