第 27 卷第 22 期 第 　三 　军 　医 　大 　学 　学 　报 Vol. 27, No.

22
　　 　　
2005 年 11 月 ACTA 　ACADEM IA E　M ED IC INAE　M IL ITAR IS　TERTIA E Nov. 2005 2209

文章编号 : 1000 25404 ( 2005) 22 22209 204

论著
抗肝癌单链免疫毒素 HAb25( scFv) 2PE40 的构建及其导向作用的实验研究
1 1 1 1 2
胡川闽 ,郭建秀 ,李 　鹏 ,陈 　安 ,刘彦仿 　　 ( 1第三军医大学医学检验系临床生物化学教研室 ,重庆 400038; 2第四军
医大学病理学教研室 ,西安 710032)

　　提 　要 : 目的 　构建单链免疫毒素 HAb25 ( scFv) 2PE40 并探讨其导向细胞毒作用 。方法 　采用亚克隆技术 ,首先将

HAb25 ( scFv)与绿脓杆菌外毒素基因突变子 PE40,在 p ly5 载体上构建 HAb25 ( scFv) 2PE40 单链免疫毒素基因 ; 再将其亚
克隆入 pBV220 原核表达载体中 , 转化 DH5α宿主菌 ,温度诱导表达 ; SDS2PAGE观察其表达水平并建立目的蛋白的纯化
方法 ; 间接免疫荧光染色鉴定 HAb25 ( scFv) 2PE40 与肝癌细胞结合的特异性 ; 体外导向细胞毒实验明确其是否具有选择
性靶细胞杀伤活性 。结果 　限制性酶切图谱和序列分析证实在 p ly5 载体上成功地构建了 HAb25 ( scFv) 2PE40 单链免疫
毒素基因 ; 该单链免疫毒素基因在 pBV220 载体中获得高效表达 , 其表达量占菌体总蛋白的 43. 3% ; 纯化后的 HAb25
( scFv) 2PE40 间接免疫荧光染色显示具有与亲本抗体 HAb25 相同的抗原结合特性 ; 导向细胞毒实验结果显示 HAb25
( scFv) 2PE40 具有明确的选择性靶细胞杀伤活性 。结论 　已成功构建和高效表达了单链免疫毒素 HAb25 ( scFv) 2PE40,该
免疫毒素有选择性地杀伤靶肝细胞的生物活性 ( P < 01001) ,为其进一步的基础和临床应用研究奠定了基础 。
　　关键词 : 肝细胞肝癌 ; 单链抗体 ; 免疫毒素 ; 克隆 ; 表达
　　中图法分类号 : R392. 2; R394 233; R735. 7 文献标识码 : A

Con struction of an imm unotox in HAb25 ( scFv ) 2PE40 and its targetin g effects a 2
ga in st human hepa tocellular carc in oma cells
HU Chuan2m in , GUO J ian2xiu , L I Peng , CHEN An , L IU Yan2fang (1 Departm ent of Clinical B iochem istry, College ofMedical La2
1 1 1 1 2

2
boratory, Third M ilitaryMedical University, Chongqing 400038; Departm ent of Pathology, Fourth M ilitaryMedical University, Xi’an 710032)

　　Abstract: O b je c tive 　To construct a single chain Fv immunotoxin HAb25 ( scFv) 2PE40 and exp lore its
targeting effects on hum an hepatocellular carcinoma ( HCC ) cells. M e tho d s 　 First, the HAb25 ( scFv) gene
was ligated w ith PE40, a truncated form of p seudomonas exotoxin on the the p lasm id vector p ly5 to form the
HAb25 ( scFv) 2PE40 gene. Then the HAb25 ( scFv) 2PE40 gene was subcloned into the pBV220 E. Coli exp res2
sion vector for p roduction of the recombinant imm unotoxin. SDS2PAGE was used to identify the exp ression of
objective p rotein. The specificity of HAb25 ( scFv) 2PE40 binding to HCC cells was tested by indirect imm uno2
fluorescent staining, and the in vitro targeting cytotoxic assay was emp loyed to observe the selective cytotoxic ac2
tivity of the objective p rotein. R e su lts 　 Enzym e digestion and sequencing analysis p roved the construction of
HAb25 ( scFv) 2PE40 gene in p ly5 vector. HAb25 ( scFv) 2PE40 gene was highly exp ressed in pBV220 vector
( up to 43. 3% of total cellular p roteins) . Indirect imm unofluorescent staining showed HAb25 ( scFv ) 2PE40
could specifically bind to HCC cells as its parent antibody HAb25. The p rotein was verified to have selective cy2
totoxic activity when cocultured w ith HCC cells. Co nc lu s io n 　A single chain Fv imm unotoxin HAb25 ( scFv) 2
PE40 was successfully constructed. The immunotoxin has selective cytotoxic activity against HCC, which found
a basis for further study on its basic and clinical app lication.
　　Key words: hepatocellular carcinom a; scFv; immunotoxin; cloning; exp ression

　　抗体与毒素蛋白的交联物称为免疫毒素 , 体内外 下 ,可经内化作用进入靶细胞 , 并在靶细胞内发挥作

实验均显示化学反应耦联的免疫毒素在抗体的导向 用 ,然而用化学反应制备的免疫毒素得率低 ,难以批量
生产 ,且制备过程中对抗体和毒素蛋白的活性都有不
　　基金项目 :重庆市科委自然科学基金资助重点项目 (2004BA5017) [1]
同程度的影响 ,限制了其临床应用 。近年不少作者
　　　　　 　Supported by the Key Sci & Tech Research Project Foundation by Sci2
entific Comm ittee of Chongqing (2004BA5017) 用基因工程方法将抗体与毒素在基因水平上进行融
　　作者简介 :胡川闽 (1963 - ) ,男 ,四川省泸州市人 ,博士 ,教授 ,主要从事基因 合 ,由此构成的免疫毒素称为重组免疫毒素 ,其中研究
工程抗体 、Th细胞分化及信号传导通路方面的研究 。电话 : ( 023) 最多 ,效果最理想的是抗肿瘤单链抗体与毒素基因融
68753761, E 2m ail: Chum inhu@ yahoo. com [2]
　　收稿日期 : 2005 209 212;修回日期 : 2005 210 209
合而构建的单链免疫毒素 。本研究将保持亲本抗

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体对肝癌细胞特异结合活性的 HAb25 ( scFv) 单链抗
体基因与去除细胞结合结构域的假单胞绿脓杆菌外毒
素基因 PE40 融合 ,构建成 HAb25 ( scFv) 2PE40 抗肝癌
单链免疫毒素 ,并观察了其体外导向细胞毒作用 。
1 　材料与方法
1. 1 　细胞 、
菌种与质粒
　　HCC 29204 肝癌细胞株和 pBV220 表达载体来自第四军医
大学病理学教研室 ; pUCl9 2HAb25 2scFv 重组质粒为本室构建 ;
Ply5 质粒由南方医科大学高基民博士惠赠 ; JM l09、DH5α菌种
购自 Promega公司 。
1. 2 　主要试剂
　　质粒提取试剂 、SDS2PAGE试剂购自华美公司 ; 抗绿脓杆菌
外毒素单克隆抗体由美国西雅图药物研究所 Siegall博士惠赠 ;
荧光素标记的羊抗鼠抗体购自北京中山公司 ; 噻唑蓝购自美国
Sigma公司 ; 各种限制性内切酶 、T4 DNA 连接酶 、PCR 扩增试剂
购自 Promega公司 。
1. 3 　引物
　　含 EcoR Ⅰ和 S a lⅠ酶切位点的单链抗体基因扩增引物 P1:
2CTGAATTCATGCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG23 ′P2: 5 ′
5′ 2 混合物 , 每 孔 加 入 150 μ l 二 甲 基 亚 砜 , 振 荡 10 m in 后 , 测
ACCGTCGACGGTCACGTGGGTCCC 23 ′
由上海生工合成 。
1. 4 　方法
1. 4. 1 　HAb25 ( scFv) 2PE40 单链免疫毒素基因的构建 　　以
pUC19 2HAb25 ( scFv)重组质粒为模板 ,用引物 P1、P2 经 PCR 扩
增反应 ,扩增出 HAb25 ( scFv) 单链抗体基因片段经 EcoR Ⅰ和
H incⅡ双 酶 切 后 回 收 备 用 ; 将 含 有 IL 22 和 PE40 重 组 质 粒
( Ply5)分别以 Sm a lⅠ与 EcoR Ⅰ酶切后回收纯化载体大片段 ;
T4 DNA 连接酶连接 HAb25 ( scFv) 单链抗体基因和带有 PE40
基因的 Ply5 质粒载体 ,转化 JM109 感受态细胞 ,挑取 Amp 抗性
的转化菌落 , 常规方法提取质粒 , 经 EcoR Ⅰ / Pst Ⅰ和 EcoR Ⅰ /
Sm a lⅠ两组双酶切鉴定阳性克隆 ,再经 PCR 扩增和序列分析进
一步证实 。
1. 4. 2 　pBHAb25 ( scFv) 2PE40 表达载体的构建 　　含 HAb25
( scFv) 2PE40 单链免疫毒素基因的重组质粒经 EcoR Ⅰ / PstⅠ双
酶切回收 HA25b ( scFv) 2PE40 基因片段 ,与经同样双酶切线性
化的 pBV220 载体大片段以 T4 DNA 的连接酶连接转化 DH5α
细菌 ,常规方法挑取克隆和提取质粒 , 分别用 EcoR Ⅰ / PstⅠ和
EcoR Ⅰ / Sm a Ⅰ双酶切后 , 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定重组质粒 。
1. 4. 3 　诱导表达和鉴定 　　取含 pBHAb25 ( scFv) 2PE40 表达
载体的菌种 , 接种于含氨苄青霉素的 LB 培养液中 , 32 ℃振荡
培养至 OD 值约为 014,置于 42 ℃水浴摇床中 , 200 r/m in 振荡
诱导表达 3 ～6 h,离心收集菌体 , 进行 SDS2PAGE, 观察重组蛋
白的表达情况 ,用 CS2900 薄层扫描测定蛋白表达量 。
1. 4. 4 　表达产物的纯化与复性 　　100 m l诱导表达的菌体 ,
常规离心洗涤法收集包涵体后 , 在沉淀中加入 015 m l变性液
( 011 mol/L Tris2HCl pH 810, 6 mol/L 盐酸胍 , 2 mmol/L EDTA
pH 810, 015%β2巯基乙醇 ) ,溶解沉淀 ,室温放置 2 h, 加入 100
倍体积的复性液 (011 mol/L Tris2HCl pH 8. 0, 0. 5 mol/L L 2精氨
酸 、50 μmol/L CuSO4 , 2 mmol/L EDTA ) , 10 ℃保温 24 h, 12 000
r/m in离心 10 m in,上清液装入透析袋 ,对透析液 (011 mol/L 尿
素 , 20 mmol/L Tris2HCl pH 8. 0, 0. 25 mmol/L NaCl) , 4 ℃透析
24 ～48 h, 取出透析液 , 12 000 r/m in离心 10 m in, 上样于装填
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SP Sepharose Fast Flow 的阳离子交换柱 ,用含 1 mol/L NaCl的
PBS 洗脱 ; 得到的初纯品上样于平衡好的 H itrap butyl FF 疏水
层析柱 , 洗脱液为含 0. 75 mol/L (NH4 ) 2 SO4的 PBS 洗脱得到
纯化蛋白 ,无菌过滤后 ,紫外分光光度计测定蛋白含量 。
1. 4. 5 　 HAb25 ( scFv) 2PE40 免 疫 活 性 的 鉴 定 　 　用 含 4%
NaN3的 PBS (0101 mol/L pH 714) 离心洗涤 HCC 29204 肝癌细
胞 (约 1 ×106 ) 3 次后 , 涂于明胶处理过的载玻片上 , 冷丙酮固
定 30 m in, PBS洗涤 3 次 , 加不同稀释度的上述纯化的 HAb25
( scFv) 2PE40 的蛋白于细胞上 , 4 ℃冰箱过夜 , PBS洗涤 3 次 ,
加抗绿脓杆菌外毒素的单克隆抗体 ( 1 ∶200 ) , 37 ℃孵育 2 h,
PBS洗涤 3 次 ,加 F ITC 标记的羊抗鼠抗体 ( 1 ∶ 15) , 37 ℃作用 2
h, PBS洗涤 3 次 ,缓冲甘油封片 ,荧光显微镜下观察结果 ,对照
设计包括亲本抗体阳性对照 ,抗 HPV 抗体无关抗体对照和 PBS
空白对照 。
1. 4. 6 　HAb25 ( scFv) 2PE40 的导向细胞毒实验 　　体外培养
的 HCC 29204 肝癌细胞按 1 ×104细胞接种于 96 孔培养板中 ,培
养 24 h, 弃 去 旧 培 养 液 , 加 入 用 培 养 液 稀 释 的 不 同 浓 度 的
HAb25 ( scFv) 2PE40 和亲本抗体 ( HAb25 )孵育 2 h,用不含血清
的 1640 培养液重复振荡洗涤 3 次 ,加入新培养液 ,继续培养 48
h,每孔加入 50 μ l噻唑蓝 ( 5 mg/m l) , 37 ℃反应 4 h, 弃去反应
D ( 495 ) nm值 ,并根据公式 :
D ( 495 )处理组
杀伤率 = [ 1 - ] ×100%
D (495)空白组
　　计算制剂各浓度的细胞杀伤率 ,对照设立包括 PBS空白对
照和 SGC 27901 胃癌细胞的替代对照 。
2 　结果
2. 1 　HAb25 ( ScFv) 2PE40 单链免疫毒素基因的构建
　　含有 IL 22 和 PE40 基因的 Ply5 重组质粒经 Sm a lⅠ / EcoR Ⅰ
双酶切 ,能切下 1 个 400 bp 的 IL 22 基因片段和 419 kb 含有 PE
基因的载体大片段 ,该载体大片段在 T4 DNA 连接酶的作用下
与经 EcoR Ⅰ / H incⅡ双酶切处理的 HAb25 ( scFv)单链抗体基因
片段连接 ,转化处于感受态的 JM l09 细菌 , 随机挑取的 6 个克
隆 ,常规方法提取质粒 ,经 EcoR Ⅰ / PstⅠ双酶切 ,有两个克隆能
切下 118 kb 和 315 kb 大小的两个片段 , 118 kb 约等于 PE40
11083 kb和 HAb25 ( scFv) 0174 kb之和 ,对照的 Ply5 重组质粒
经 EcoR Ⅰ / PstⅠ双酶切 ,能加切下 1. 7 kb和 3. 5 kb 两个片段 ,
1. 7 kb 片段等于 IL 22 基因和 PE40 基因之和 , 进一步用 VH 2
BACK和 VLFOR 引物 ,经 PCR 扩增这两个阳性克隆 ,均能扩增
出约 740 bp 大小片段的单链抗体基因 ,说明已构建成功 HAb25
( scFv) 2PE40 重组质粒 。
2. 2 　pBHAb25 ( scFv) 2PE40 表达载体的构建与鉴定
　　含 HAb25 ( scFv) 2PE40 单链免疫毒素基因的重组质粒经
EcoR Ⅰ / PstⅠ双酶切后 ,与同样 EcoR Ⅰ / PstⅠ双酶切线性化的
pBV220 载体片段 ,按常规方法连接 , 32 ℃热休克转化 DH5α
感受态细菌 ,随机挑选的 10 个克隆 , 经 EcoR Ⅰ / PstⅠ双酶切 ,
其中有 8 个克隆均能切下 1 个约 1. 8 kb 片段 ,进一步 EcoR Ⅰ /
Sm a lⅠ双酶切 ,能切下 1 个约 0. 9 kb基因片段 ,由 PE40 基因的
物理图谱 可 知 , 0. 9 kb 基 因 片 段 正 好 等 于 HAb25 ( scFv ) 和
PE40 基因中 Sm a lⅠ至 S a lⅠ之间片段之和 , 序列分析证实 pB 2
HAb25 ( scFv)表达载体已构建成功 ,见图 1。
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第 22 期 　 scFv) 2PE40 的构建及其导向作用的实验研究 　　
胡川闽 ,等 . 抗肝癌单链免疫毒素 HAb25 ( 　　 2211

复性后 , Sepharose Fast Flow 的阳离子交换柱和 H itrap butyl FF

疏水层析柱纯化 ,最后 , 100 m l诱导表达细菌获得 20 mg纯化的
HAb25 ( scFv) 2PE40单链免疫毒素 ,纯度达为 9512% ,见图 2。

1: DNA / Hind Ⅲ markers; 2: pGHAb25 ( scFv) was digested with EcoR Ⅰ

and Sm alⅠ; 3: pBHAb25 ( scFv) 2PE40 was digested with EcoRⅠand Sm al
Ⅰ; 4: pBHAb25 ( scFv) 2PE40 was digested with EcoR Ⅰand PstⅠ
图 1 　pBHAb25 2scFv2PE40 表达载体的鉴定
F ig 1 　 Iden tif ica tion of pBHAb25 2scFv 2PE40 expression vector
1: Molecular weight standard; 2: pBHAb25 ( scFv) 2PE40 control; 3:
Induction of pBHAb25 ( scFv) 2PE40; 4: Purified HAb25 ( scFv) 2PE40
2. 3 　单链免疫素素的诱导表达
图 2 　pBHAb25 2scFv 2PE40 诱导表达图谱
　　含 pBHAb25 ( scFv) 2PE40 表达载体的菌株 , 经 42 ℃诱导
F ig 2 　SD S 2PAGE of in duced expression D H5α con ta in in g
后 ,与未诱导的同一菌株对照 , 在 SDS2PAGE 电泳图谱上出现
pBHAb25 2scFv 2PE40
一条新的高表达蛋白带 , 参照蛋白标准分子量参照 , 其大小约
为 70 ×103 ,与预计的 PE40 毒素蛋白 ( 44 ×103 ) 和 HAb25 2scFv
2. 4 　单链免疫毒素的免疫活性
抗体 ( 25 ×103 ) 之和约为 70 ×103 一致 , 薄层激光扫描结果显
　　间接免疫荧光染色结果显示 , 相应稀释度的 HAb25 亲本
示 pBHAb25 2scFv 表达的 70 ×103 蛋白带占菌体总蛋白带的
抗体及 HAb25 ( scFv) 2PE40 均能与肝癌细胞呈特异性结合 , 阳
4313% ; pBHAb25 ( scFv) 2PE40 温度诱导表达后 , 经 SDS2PAGE
性部位主要定位于肝癌细胞膜上 ,细胞浆内亦有少许黄绿色荧
电泳分析 , 70 ×103 的 HAb25 ( scFv) 2PE40 蛋白主要存在于沉
光 (图 3B、C ) ,而 、
对照实验为阴性 (图 3A ) ,说明研制的单链免
淀中 ,表明产物主要以包涵体的形式存在于细菌中 , 经变性与
疫毒素较好地保持了亲本抗体的免疫活性 。

A: PBS control; B: HAb25; C: HAb25 ( scFv) 2PE40

图 3 　单链免疫毒素的免疫活性
F ig 3 　 Imm unoactiv ity of HAb25( scFv) 2PE40 tested on the HCC 29024

2. 5 　单链免疫毒素的导向细胞毒作用
　　图 4 所示各浓度的制剂对肝癌细胞 ( HCC 29204 ) 2 h 预处
理后的杀伤率 ,对各组实验所测出的 D ( 495 ) 值 ,采用线性拟合
统计 方 法 , 进 行 了 多 因 素 的 析 因 分 析 , 其 结 果 显 示 HAb25
( scFv) 2PE40 所测各浓度范围内对靶肝癌细胞都有杀伤活性 ,
与对照亲本抗体 ( HAb25 ) 相比相差非常显著 ( P < 0101 ) 。此
外 ,对 照 实 验 提 示 对 胃 癌 细 胞 无 杀 伤 活 性 , 与 亲 本 抗 体
( HAb25 )相比相差不显著 ( P > 0105 ) ; 亲本抗体对肝癌细胞和
胃癌细胞 ( SCG27901 ) 均无杀伤活性 , 与 PBS 空白对照组相比 图 4 　单链免疫毒素 HAb25( scFv) 2PE40 与亲本抗体 HAb25 对肝
相差不显著 ( P > 0105 ) 。 癌靶细胞的导向细胞毒作用的对比
F ig 4 　 Com para tive study on targetin g cytotox ic ity of HAb25
( scFv) 2PE40 and HAb25

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免疫毒素 ,也主要以不溶性的包涵体形式存在于菌体
3 　讨论
中 ,不溶性的包涵体表达产物需要变性与复性处理后 ,
　　近年来重组免疫毒素已成为导向治疗肿瘤研究的 才能形成具有功能性的蛋白 , 但其不溶性的特点又有
一个热点 ,部分重组免疫毒素已获准进入临床试用 ,展 利于去除细菌中包括内毒素在内的细菌杂蛋白 , 而便
示出良好的应用前景 。重组免疫毒素研究已证明 , 其 于表达产物的纯化 。从 2 h预处理细胞毒实验结果可
与一般化学耦联法制备的免疫毒素相比优点明显 , 主 以看出 , HAb25 ( scFv) 2PE40 在所测各浓度范围内对
靶细胞 ( HCC 29204 肝癌细胞 ) 均有明确的杀伤活性 ,
要表现为 : ①分子稳定性好 , 融合蛋白不易分开 ; ②毒
而亲本抗体 ( HAb25 )对肝癌细胞 ,以及 HAb25 ( scFv) 2
副作用低 ,由于已去除了毒素原有的受体结合域 ,毒素
PE40 对胃癌细胞均不表现出有细胞毒活性 ,进一步分
不能与抗体特异抗原以外的分子结合 , 使毒素作用局
析 HAb25 ( scFv) 2PE40 对肝癌细胞的杀伤活性 , 具有
限在肿瘤局部 ; ③效力高 ,其原因是重组免疫毒素仅含
剂量依赖的特点 。此外 ,还表现出高浓度时 ,其杀伤作
有抗体的可变区部分和毒素的生物毒性部分 , 分子量
[3]
用有平台期的现象 。据推测 , 这是因为靶细胞仅存在
小 ,易穿过血管进入肿瘤中心发挥作用 。重组免疫 一定数量的 HAb25 抗体所对应的抗原 ,当这些抗原全
毒素中应用的抗体主要是 scFv和 Fab 等能保持抗原 部与 HAb25 ( scFv)结合后 , 再给予更高浓度的 HAb25
结合活性的小分子抗体 , 其中 scFv应用最为广泛 , 所 ( scFv) 2PE40,其也不能继续与靶细胞发生结合 , 同时
涉及的毒素以绿脓杆菌外毒素应用最为广泛 , 取得的 也说明 HAb25 ( scFv) 2PE40 对肝癌细胞的杀伤作用 ,
[4]
成绩最大 。绿脓杆菌外毒素 ( PE ) 是一含 613 个氨 是在 HAb25 ( scFv)单链抗体的介导下进入靶细胞 , 在
3
基酸的单链多肽 ,分子量 66 ×10 ,该多肽链由 3 个结 靶细胞内 PE40 抑制其蛋白质合成 , 最终导致 HAb25
构域 ( dom ain )组成 : domain Ⅰ ( 1 ～252 aa ) , 为与细胞 ( scFv) 2PE40 的选择性细胞毒作用 。
膜受体结合的 domain; domain Ⅱ ( 253 ～364 aa ) ,为 PE
参考文献 :
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3

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[ 10 ] Kim S H. Exp ression and purification of recombinant immunotoxin —a
的单链免疫毒素融合蛋白的分子量一致 , 其表达量占 fusion p rotein stabilizes a single2chain Fv ( scFv) in denaturing condi2
细菌总蛋白的 4313% , 与文献 [ 10 ]比较有明显的优 tion [ J ]. Protein Exp r Purif, 2003, 27 ( 1) : 85 - 89.
势 。进一步分析 , 高表达的 HAb25 ( scFv) 2PE40 单链 (编辑 　薛国文 )

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