南京医科大学学报!

自然科学版" 第 5S 卷第 ; 期
*>U?* 72N7 [YRm9G:RN7NR: 69HR2RY7=R: Y7Y\RY8 !Y+%)*+( :,-".," " 5??S 年 ; 月

全人源抗肝癌重组免疫毒素的制备及其对肝癌细胞的杀伤作用

王子露#朱 进 4#丁贵鹏#孙景军#张建平 5#冯振卿!#管晓虹 4

A 南京医科大学病理学系#4 分子生物学研究所#江苏 南京 54??5BC 5 南京医科大学第二附属医院普外科#江苏 南京 54??44D

&摘 要’ 目的(构建及表达全人源 抗 肝 癌 6789!74 单 链 抗 体 !7@ "与 相 思 子 毒 素 7 链 !7E*-.!7 "的 原 核 表 达 载 体 #并 检 测 其

对人 <9=;>?5 肝癌细胞系的杀伤作用%方法(应用 F2G 方法体外扩增 7@ 基因#经测序后重组入原核表达载体 #<7HIJ!!7E*-.!
7 相应位点上 # 将构建正确的 #<7HKJ!!7@K7L*-.!7 表达质粒转化 9M,&(- NOF4?# 左旋阿拉伯糖诱导表达 % 表达产物经蛋白纯化
及活性鉴定#采用 6NN 法检测其对 <9=;>?5 细胞的体外杀伤作用% 结果(构建的重组免疫毒素表达载体 #<7HKJ!!7@K7L*-.!7 #
诱 导 表 达 产 物 主 要 以 包 涵 体 形 式 存 在 # 分 子 量 约 P? QH ) 纯 化 的 #<7HKJ!!7@K7L*-.!7 对 <9=;>?5 细 胞 的 最 大 杀 伤 率 为
;?M4;" #R2S? 为 @M45 "JK/(% 结论 ( 构建 $ 表达的全人源抗肝癌 7@K7E*-.!7 融合免疫毒素对肝癌细胞有较明显的杀伤作用 %
&关键词’ 重组免疫毒素) 肝细胞癌) 全人抗体) 7E*-.!7 ) 6789
&中图分类号’ T;UP)G;@V@PW5 &文献标识码’ 7 &文章编号’ #$$%!&’()!*$$S"$;!$>U?!$>

!"#$%&’(%)"* +*, -./&-$$)"* "0 + 1’2+*"&+3 &-4"25)*6*% )22’*"%".)* 676)*$%

1-/6%"(-33’36& (6&()*"26 6*, )%$ 8)33)*7 -00-(% "* 9!! (-33 3)*-
X7Y8 Z-!() #Z3[ \-.4#HRY8 8)-!#".J #:[Y \-.J!]). #Z37Y8 \-+.!#-.J5#^9Y8 Z!".!_-.J!#8[7Y ‘-+&!!&.J4
!"#$%&’(#)’ *+ ,%’-*.*/01 23)4’5’6’# *+ 7#859%. 7*.#96.%& :5*.*/01;<7=1;%)>5)/ ?2@@?AB ?"#$%&’(#)’ *+ C#)#&%.
D6&/#&0E ’-# D#9*)8 F++5.5%’#8 G*4$5’%. *+ ;<7= #;%)>5)/ ?2@@22E H-5)%I

&!"#$%&’$ ’ (")*’$+,*- N& ,&.a%*),% +.b "c#* "aa + *"’&/E-.+.% -//).&%&c-. "c#*"aa-&. d",%&* ,&/#&a"b &e + !)/+.-f"b +.%-!
!)/+. !"#+%&,"(()(+* ,+*,-.&/+ 6789!74 a-.J("!,!+-. ^d e*+J/".% A7@g J"." +.b +. 7L*-.!7 J"." #+.b %& "c+/-." %!" ,h%&%&c-,-%h
&e %!" #)*-e-"b #*&b),% &. !)/+. 322 ,"(( (-." <9=;>?5M .*$/01#- N!" 7@ J"." e*+J/".%a i"*" +/#(-e-"b Eh F2G +.b -.a"*%"b -.%&
,&**"a#&.b-.J a-%"a &e "c#*"aa-&. d",%&* #<7H K J ! ! 7E*-. ! 7 # +.b %!" e)a-&. #*&%"-. "c#*"aa"b -. J K 9*.5 NOF4? -.b),"b Eh
= !+*+E-.&a"M 7e%"* #)*-e-,+%-&. +.b -b".%-eh-.J -%a +,%-d-%h #%!" ,h%&%&c-,-%h &e %!" #*&b),% &. <9= ;>?5 i+a "d+()+%"b Eh 6NN +aa+hM
2*#34$# (N!" ."i *",&/E-.+.% -//).&%&c-. "c#*"aa-&. d",%&* #<7HKJ!!7@K7E*-.!7 i+a ,&.a%*),%"b a),,"aae)((hM N!" /+-. #*&b),%
i+a -. -.,()a-&. E&b-"a )6NN +aa+h a!&i"b %!+% #)*-e-"b #<7HKJ!!7@K7E*-.!7 !+b &Ed-&)a "ee",%a &. <9=;>?5 #%!" /+c-/)/ Q-((-.J
*+%" i+a ;?M4;j +.b R2S? i+a @M45 "JK/(M 506’43#+06( G"a)(%a &e &)* a%)bh &. #<7HKJ!!7@K7E*-.!7 +.b -%a "ee",%a &. <9= ;>?5
a!&i -%a J*"+% #&%".%-+( e&* %!" %+*J"%"b %!"*+#h &e !"#+%&,"(()(+* ,+*,-.&/+M
&7*8 90%1# ’ -//).&%&c-.) !"#+%&,"(()(+* ,+*,-.&/+ ) 7E*-.!7) !)/+.-f"b +.%-E&bh ) 6789
&7,%+ [.-d 6"b Y+.]-.J0 5??S0 5S !; "k >U?!>U@ ’

肝细胞性肝癌 !!"#$%&’"(()($* ’+*,-.&/+0 122 " 好的临床治疗作用#具有广阔的应用前景 &5’%

是恶性程度极高的恶性肿瘤#其发病隐匿$转移早$ 6789!74 为恶性黑色素瘤的编码基因#以往研
病死率高% 目前临床对 322 的诊治依然十分困难# 究表明 6789!74 在 322 组织高表达#在癌旁组织
所以 322 的治疗仍是临床急需解决的重大课题之 低表达 # 正 常 及 慢 性 肝 病 组 织 不 表 达 # 在 :662!
一 % 随着分子生物学 $免疫学等相关学科的发展 # 具 ;;54 $<9=!;>?5 $3"#85 肝 癌 细 胞 株 中 的 表 达 均 为
有全身治疗潜能的生物导向治疗成为研究者关注的 阳性 &@’% 因此 6789!74 抗原有可能作为 322 导向
热点 &4’% 国内外的研究表明#免疫毒素对于肿瘤有较 治疗的靶点% 为了探索免疫毒素在 322 导向治疗中
的作用# 本文应用从全人源噬菌体抗体库中筛选出
&基金项目’ 江苏省卫生厅科学基金资助项目!35??4?@ " 的针对 6789!74 抗原的单链抗体及相思子毒素 7
!
通讯作者 #9!/+-(k e".Jf!"._-.Jl!&%/+-(M,&/ 链 # 构建新的重组免疫毒素表达载体 # 纯化其表达产
第 >) 卷第 $ 期
>00) 年 $ 月 王子露等 % 全人源抗肝癌重组免疫毒素的制备及其对肝癌细胞的杀伤作用
物!初步检定其对 !"#$%&’ 肝癌细胞系的毒性杀伤
作用"
! 材料和方法
()* 材料
*+()( 菌种#质粒及细胞株
大肠杆菌 ,-( 及 ,./*0 !本室保存" 质粒 12,’!
34!本室构建!其中克隆有抗 53-"!3* 人源单链抗
体基因$质粒 1!3678!!39:;<!3 !本室构建 !其中克
隆有相思子毒素 3 链的基因 $156!(=, 购自大连宝
生物公司 " 人肝癌细胞株 !"#$%&> 本室保存 "
(?(+> 工具酶与生化试剂
限制性核酸内切酶 !"#$! #%"#" !质粒小量提
取 及 胶 回 收 试 剂 盒 均 购 自 大 连 宝 生 物 公 司 $@;A!
,:B1 镍亲和柱购自 3CD:AEBC 公司 $@F/ 标 记 的 抗
@;A 抗体购自美国 5"FGH 公司$其他均为进口分装
或国产分析纯试剂"
*?> 方法
*?>?* 重组免疫毒素表达载体 1!3678!!34739:;<!
3 的构建
*?>?*?* 目的基因的扩增及纯化
# 引物设计%根据已测定的 34 基因序列!设计
上 游 引 物 序 列 为 I" !G --3 ,GG 3GG 3,- -3-
-,- G3- G,- ,7- ,- -3- ,G!4"!引入 &"#"酶切
位点 $ 设计下游引物为 I"!-- 33, ,GG 3-- 3GG
-GG ,GG ,-- GG- ,,, -3, ,,G G3G G,, --,!4" !
引入 ’"#("酶切位点" $ 目的片段的扩增及纯化%
以含 34 的质粒 12,> 为模板!反应体系 I0 %J!反 应
条件为%KI# 预变性 I C;< ! KI $ I0 A ! IL $ I0 A !
$> $ L0 A ! 共 L 个 循 环 " 然 后 KI $ I0 A ! L0 $
I0 A !$> $ L0 A ! 共 >% 个循环 ! 最后在 $> $ 终末延
伸 $ C;<" 产物以琼脂糖凝胶电泳观察!用胶回收试
剂盒回收及纯化"
*?>?*?> 克隆载体的构建及序列分析
将 纯 化 的 34 基 因 与 156!*=, MDNOP: 连 接 ! 转
化 ’)"#*+ ,-( !蓝白斑挑选阳性克隆 ! 经菌落 /GF 鉴
定后测序"
()>)()4 1!36Q8!!34Q39:;<!3 重 组 表 达 质 粒 的 构
建 式计算细胞生长抑制率%
156!(=,!34 质 粒 ! 用 &"#" #’"#(" 双 酶 切
后 ! 将 34 基因片段与经过同样双酶切的 1!36Q8!!
39:;<!3 进行黏端连接 ! 连接产物转化 ’)"#*+ ,-(!
/GF 及 &"#" #’"#( " 双 酶 切 鉴 定 1!36Q8 !!34Q
39:;<!3 重组质粒"
(%=((
()>)> 重组免疫毒素的诱导表达#纯化
()>)>)( 重 组 免 疫 毒 素 的 诱 导 表 达 和 RDAOD:< 9JPO
鉴定
将 1!36Q8 !!34Q39:;<!3 转 化 菌 株 ")NPJ;
,./(&! 挑取单克隆菌落在含终浓度 (&& C8Q# 氨苄
青霉素的 #! 培养基中 4$ $ 培养过夜 ! 按 (%I& 转接
于含相同浓度氨苄青霉素的培养液中继续培养到
,L&&<C!&)L!加入终浓度为 &)&>& 的左旋阿拉伯糖诱
导 % E !留取未诱导的菌液作为对照" 诱导前后的细
菌培养液加入 S6S 上样缓冲液制备样品 ! 进行 S6S!
/3-" 鉴定 " S6S!/3-" 电泳分离后 ! 采用电转移装
置 !恒流 4&& C3 !> E!将电泳后凝胶上的 蛋 白 成 分
转 移 到 硝 酸 纤 维 素 膜 上 " I& 脱 脂 牛 奶 /!S 封 闭 !
@F/ 标记的抗!@;A 抗体处理!63! 显色"
()>)>)> 重组免疫毒素 34Q39:;<!3 的纯化
左旋阿拉伯糖诱导的培养液经离心回收菌体 !
/!S 重悬!超声碎菌!离心收集包涵体$包涵体经变
性#复性后!上 @;A!,:B1 镍亲和层析柱纯化!收集洗
脱液!S6S!/3-" 电泳鉴定目的蛋白"
()>)4 6PO!9JPO 鉴定纯化蛋白中单链抗体的免疫学
活性
将 4 %J 53-"!3(T* C87CJU 点 于 硝 酸 纤 维 素 膜
上!I&的脱脂奶粉 /!S 封闭! 纯化的重组免疫毒素
34Q39:;<!3 为 一 抗 !@F/ 标 记 的 抗 @;A 抗 体 为 二
抗 !63! 显色 " 4&的 !S3 作为阴性对照 "
(+>+% 重 组 免 疫 毒 素 34Q39:;<!3 对 人 肝 癌 细 胞 系
!"#$%&> 的毒性作用
对数生长期 的 !"#$%&> 细 胞 用 含 (&& 小 牛 血
清的 F/52 (L%& 制备细胞悬液! 按每孔 (’(&4 接种
于 KL 孔 板 !每 孔 (&& %J !置 4$ $ G.> 培 养 箱 中 培
养 >% E" 细胞贴壁后 ! 按不同浓度加入经滤器除菌
的 34Q39:;<!3 & 浓 度 范 围 &+&&( ((&&+&&& %8QCJ ’!
置 4$ $ G.> 培 养 箱 中 继 续 培 养 $> E! 然 后 加 入
5,, &I 8Q#’>& %J 显色 % E!弃孔内培养液!加入 (I&
%J 65S. 振荡 (& C;<!充分溶解结晶物" 每组样品
设置 4 复孔 !取其均值 ! 同时设置不加重组毒素只加
细胞的对照组及不加细胞只加培养液的空白组 " 以
空白组调零!酶标仪测定光吸收值 ,I%&<C!按 下 列 公
FV*W
实验组 , 值 W空白组 , 值
’(&&X
对照组 , 值 W空白组 , 值
(?4 统计学方法
采 用 S/SS(0?0 软 件 对 对 数 浓 度 与 细 胞 存 活 率
的曲线关系进行 /:P9;O 分析! 其中参数估计用 JP8;O
 第 !" 卷第 # 期
*(M!* 南 京 医 科 大 学 学 报 !$$" 年 # 月

模型法$并求出半数抑制量 45"$%

! 结 果

!6& )’ 基因的扩增
琼脂糖凝胶电泳结果显示 & 针对 )’ 基因设计
的上下游引物& 可扩增出 #"$ +7 左右的 158 产物
带 9图 ": % 经测序验证&其序列与本课题组已知的 )’
基因序列相一致%

% !低分子量标准蛋白质" & !未诱导菌" ! !诱导菌" ’ !诱导菌超

声破碎后上清" ( !诱导菌超声破碎后沉淀" " !纯化的重组蛋白#

图! 重组 )’*)+,-.!) 表达产物的 /0/!1)23 检测结果

& !

& !%)23!)& 点膜" !!;/) 点膜%

图’ )’*)+,-.!) 纯化产物的 0CA!+BCA 鉴定

之 间 具 有 较 明 显 的 相 关 性 & 呈 剂 量!效 应 关 系
(1?H,@C. 拟合优 度 检 验 & !!$$6$’&’ K $6$")(图 % )%
;3I#($! 的存活率与浓度之间做 1,C+-A 分析& 方程
!6! 重组免疫毒素表达质粒 7;)0*<!!)’*)+,-.!)
为 1,C+-A91:L$6&M’&$6’DNO &45"$ 为 ’6&! #<*JB %
的构建
将测序正确的 )’ 基因经一系列酶切’连接’转
化步骤 & 获得 7;)0*<!!)’*)+,-.!) 表达质粒 # 该质
粒用 158 鉴定及 !"#" ’$"#%" 双酶切 & 均可获得
#"$ +7 的 0=) 片段& 表明重组免疫毒素表达质粒
7;)0*<!!)’*)+,-.!) 的构建成功#
!6’ 重组免疫毒素的诱导表达和产物纯化
&!#/0/!1)23 和 >?@A?,. +BCA 结果显示!未诱
导细菌无新生蛋白条带 & 诱导后细菌样品中出现分
子量为 D$ E0 新生蛋白带&与 )’ 和 )+,-.!) 二者形
成的融合蛋白 %, 相等# 该目的蛋白主要以包涵体
形式存在于菌裂解后的沉淀中(图 !)% 经变性与复
" 讨 论
性 处 理 后 的 目 的 蛋 白 & 用 F-@!G,H7 镍 亲 和 柱 纯 化
后 & 可得到纯度较高的蛋白 (图 ! )% 免疫毒素是用化学方法或基因工程方法将抗肿
!6( 纯化蛋白的活性鉴定 瘤抗体或某些细胞表面受体的配基与生物来源的毒
0CA!+BCA 结果显示&在 %)23!)& 点样处有明显 蛋白偶联而成的肿瘤治疗药物 & 从而进行肿瘤导向
的色斑&而对照基本无反应% 表明 )’*)+,-.!) 的纯 治疗% 这充分利用了抗体的特异识别特性& 靶向结
化蛋白具有与 %)23!)& 结合的特异性9 图 ’:% 合肿瘤细胞&将治疗药物集中在癌灶&可提高治疗效
!6" )’*)+,-.!) 对人 ;3I#($! 肝癌细胞系的 毒 性 率&降低对其他组织的毒性和损伤%
作用 最初免疫毒素多使用鼠源性单抗作为弹头 & 采
%GG 结 果 显 示 & 重 组 免 疫 毒 素 )’*)+,-.!) 对 用化学交联的方法将抗体与毒素分子联结 & 这种免
;3I#($! 细胞具有 较 好 的 杀 伤 作 用 & 浓 度 与 &"($.J 疫毒素存在明显缺点! $ 鼠源性单抗在人体内具有
第 ;" 卷第 4 期
;66" 年 4 月 王子露等 , 全人源抗肝癌重组免疫毒素的制备及其对肝癌细胞的杀伤作用 -:7&-

免疫原性!会产生人抗鼠抗体"!"#" #!影响治疗效 "&8"’()*#" 重组免疫毒素具有良好的生物学活性 !

果$! 单抗药物的分子量大!在体内易被清除$ " 交 对体外培养的 5,14:6; 肝 癌 细 胞 系 的 最 大 杀 伤 率
联药物不稳定!在体内易解离!毒素易产生不良反应 为 46<-4$ % 提示本文构建) 表达的全人源抗肝癌
等% 随着基因工程技术的发展!由小分子抗体构成 "&8"’()*#" 融合免疫毒素对肝癌细胞有较明显的杀
的重组免疫毒素越来越受到人们的青睐 % 由于其分 伤作用 ! 有望成为一种具有一定临床应用价值的抗
子 体 积 小!对 实 体 瘤 穿 透 作 用 强 !特 别 是 全 人 抗
&!’
肝癌导向治疗药物 %
体!与鼠源性单抗相比其免疫原性明显减弱而血清
& 参考文献 ’
半衰期显著延长 &"’% 许多重组免疫毒素已进入临床
&- ’ 5=00>(?)>@A 1!< 2BB=*/0C>(DE>=0)F G0(D0>H)>G ?/(
试验阶段 &$’%
C>ED0/F>@@=@D( FD(F)*/BD &I ’< +DG0(/>*0>(/@/HJK;66:K -;4
本 文 选 择 了 全 人 源 抗 !%% 单 链 抗 体 ("&# 及
LM 3=EE@ -NO 3;&;P;:-<
"’()*#" 尝试表达融合免疫毒素 % "& 是本课题组从 &; ’ Q)0R+>(D@A .IK S(>)0BD* TK U)@G/* UK !" #$< T>F/B’)*D*0
全人源噬菌体抗体库中筛选出的抗 #"+,#"- 的特 )BB=*/0/V)*G ?/( 0(>D0)*H FD*F>(&I ’< 2*0 I #>A #)F(/’)/@K
异 性 单 链 抗 体 !经 ./0#,123" )免 疫 细 胞 化 学 检 测 ! ;66:K ;W&X4#7YO M44PM7;<
显示其可与 #"+,#"- 特异性结合!提示 "& 保留有完 && ’ 刘彬彬 ! 叶胜龙 ! 贺 平 ! 等 % 肝 癌 组 织 中 三 个 #"+, 家

整抗体分子结合抗原的特异性!且其免疫原性弱 ! 是 &4’ 族基因的克隆&I ’% 中国肿瘤生物治疗杂志!-WWW !$ +; *,

肿瘤导向治疗的理想载体 " 文章待发表 *% "’()*#" 74PW6<

&: ’ 郭建巍 ! 蔡美英 % 新型小分子抗体 GFQZ 多聚体与肿瘤靶
为相思子毒素 " 链% 完整的相思子毒素由 " 链和 5
向&I ’% 生物医学-工程学杂志!;66& !;6 "; *,&$-P&$M<
链组成!5 链具有半乳糖凝集活性!可与细胞膜上受
&M ’ 黄 家 强 < 新 一 代 治 疗 用 抗 体 &I ’% 国 外 医 学-分 子 生 物 学
体结合!帮助 " 链进入细胞 内 !催 化 $63 核 糖 体 亚
分册 !-WW4 !-W"; *,74PW;<
基失活 !从而抑制蛋白质合成过程中多肽链的移位 ! &$ ’ [D) 1!K U)00>G TK 3>0G>( "K !" #$< !>ED0/0/V)F)0J )* FD(F>(
最终因蛋白质合成障碍导致细胞死亡 % 完整相思子 ED0)>*0G (>F>)Z)*H >(’#&7K D (>F/B’)*D*0 )BB=*/0/V)*
毒素由于 5 链 的 非 特 异 性 结 合 而 使 其 在 免 疫 毒 素 0CD0 0D(H>0G 0C> >(’5; (>F>E0/( &I ’< %@)* FD(F>( T>GK
中的应用受到限制 % 本文只采用相思子毒素 " 链!
&7’
-WWWK MLWYO ;&--P;&-M<
这样可减小对正常组织的损害!并且由于分子量小! &4 ’ 夏 骏 !李 晓 宇 !陈 秀 英 !等 %# 淀 粉 样 多 肽 人 源 性 抗 体
的 筛 选 与 鉴 定 &I ’% 南 京 医 科 大 学 学 报 " 自 然 科 学 版 *!
使融合蛋白易于运输和在肿瘤局部的渗透 ) 扩散 %
;66:!;:":*,&;7P&&-<
本文构建和表达了全人源抗肝癌单链重组免疫
&7 ’ 李 丽 琴 !郑 晓 军 !陈 乐 贵 !等 % 相 思 子 毒 素 的 分 子 特 点 及
毒素 "&8"’()*#"!表达产物主要以包涵体形式存在%
其在临床中的应用前景 &I ’% 中国新药杂志 !;66; !--LMY ,
包涵体具有表达量高!易于纯化!可避免细胞水解酶
&$6P&$&<
对重组蛋白的破坏等优点% 经变性)复性及纯化后! &收稿日期’ ;66M#6-#6&
通过 #99 法检测其活性!结果表明 !表达的抗肝癌