肿瘤防治杂志 2005 年 3 月第 12 卷第 6 期 　　 CHIN J CANCER PR EV TREA T ,March 2005 ,Vol . 12 　No .

6 ・401 ・

前沿报道

全人源肝癌噬菌体单链抗体的筛选及特异性鉴定
薛国柱1 , 　窦科峰1 , 　赵爱志1 , 　药立波2
1. 第四军医大学西京医院肝胆外科 ,陕西 西安 710032
2. 第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室 ,陕西 西安 710032

Screening of human phage antibodie s with single2chain variable fragment and identifIication
of it s sp ecificity to liver cancer cells
X U E Guo2z hu 1 , DOU Ke2f en g 1 , Z H A O A i2z hi 1 , YA O L i2bo2
1 . Department of Hepato2biliary S urgery , Xi j ing Hos pital , Fourth Military Medical Uni versit y , X i’an 710032 , P. R. China
2 . Department of B iochemist ry and Molecular B iology , Facult y of Preclinical Medicine , Fourth Military Medical
Universit y , Xi’an 710032 , P. R. China

【摘要】　目的 : 对全人源肝癌噬菌体单链抗体 [ ABSTRACT] 　OBJECTIVE : To identify the human phage anti2

库进行鉴定 ,筛选肝癌抗体 ,同时对抗体的活性 bodies with single2chain variable fragment ( ScFv) , to select the ScFv
及特异性进行鉴定 。方法 : PCR 鉴定阳性重组 specific to hepatocellular cancer and to detcct the avidity and speci2
菌 TG1 中人肝癌 ScFv 的插入率 。先以人成纤 ficity of the ScFvs. METHODS : The recombinant phages inserted
维细 胞 吸 附 后 再 以 体 外 培 养 的 肝 癌 细 胞 with ScFv were determined by PCR. The recombinant phages were
SMMC27721 为抗原对所建抗体库进行 3 轮“吸 panned by human liver cancer cell line of SMMC27721 after they
附2洗脱2扩增”的亲和筛选 。将筛选后的 ScFv were counter2selected with human fibroblast cells and human embrro
进行 PCR 鉴定及双酶切鉴定 ; 通过 EL ISA 法及 liver cells L202. After 3 rounds of biopanning ,the ScFvs were identi2
FCM 鉴定其与人肝癌细胞及正常细胞的结合活 fied by PCR and enzymes digestion ,the specificity of ScFv from the
性。结果 :ScFv 基因插入率为 70 % 。在亲和筛 monoclonal bacteria was determined by EL ISA and FCM. RE2
选过程中 ,肝癌噬菌体单链抗体得到富集 ,收获 SULTS :The rate of recombinant bacteria inserted with ScFv was
率逐轮得到提高 ,第 3 轮为第 1 轮的 214 倍 。筛 70 %. From the 1st round to the 3th round of the panning , the
选后的 ScFv 进行 PCR 鉴定及双酶切鉴定 ,均可 number of the eluted phages increased 214 times. The inserted frag2
检测到目的基因 。EL ISA 分析结果显示 18 个 ments were detected from the selected ScFvs by PCR and enzymes
克隆 与 SMMC27721 呈 阳 性 反 应 , 阳 性 率 为 digestion. Positive reactions to SMMC27721 were detected by
90 % ,15 个克隆与成纤维细胞有交叉反应 。得 EL ISA in 18 clones. The positive rate was 90 %. Cross reactions to
到 3 株肝癌单链抗体 。ScFv 的 FCM 鉴定表明 , fibroblast cells were detected in 15 clones. Three ScFvs to liver
以正常胎肝细胞 L202 为对照 ,ScFv 与肝癌结合 cancer cells were acquired. ScFv can combined 411 3 % human liver
比率为 411 3 % 。特异性鉴定表明 ,其与肝癌细 cancer cell line of SMMC27721 using normal liver cells as control by
胞结合活性明显高于正常细胞 。结论 : 利用噬 FCM. CONSL USION:ScFvs to liver cancer cells and its genes were
菌体抗体库技术结合减数筛选得到了肝癌噬菌 acquired by the phage antibody panning assisted by subtraction se2
体单链抗体及其基因 ,且筛选后的抗体片段与 lection. The selected ScFvs has avidity specifically to human liver
人肝癌细胞有特异性的结合活性 。 cancer cells.
肿瘤防治杂志 ,2005 ,12 (6) :401 - 404 Chi n J Cancer Prev T reat , 2005 , 12 ( 6) :401 - 404

【关键词】　噬菌体抗体库 ; 单克隆抗体 ; 单链抗体 ; 肝肿瘤

[ KEYWORDS] 　p hage antibody library ; mo noclo nal antibody ; single chain variable f ragment ; liver neoplasms

【中图分类号】　R735. 7 　　　
【文献标识码】　A 　　　
【文章编号】　1009 - 4571 (2005) 06 - 0401 - 04

【基金项目】　国家自然科学基金资助项目 ( 30371399)
【第一作者简介】　薛国柱 ,男 ,河南新野人 ,博士 ,副主任医师 ,主要从事肿瘤抗体的研究工作 。
Tel :86 - 29 - 83375259 　E2mail :xgzhu2003 @yahoo . com. cn
【通讯作者简介】　窦科峰 ,男 ,陕西乾县人 ,博士 , 教授 ,主任医师 ,主要从事肝癌与肝移植的研究工作 。
Tel :86 - 29 - 83375259 　E2mail :gdwk @f mmu. edu. cn

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・402 ・ 薛国柱 ,等 　全人源肝癌噬菌体单链抗体的筛选及特异性鉴定

　　抗肿瘤单链抗体 ( ScFv) 的报道较多[ 1 ,2 ] ,但大多是 细胞及肝癌细胞的 96 孔板过夜 , 再加入 H RP2羊抗

通过基因工程技术把鼠源杂交瘤抗体改造成小分子单 M13 37 ℃温 育 1 h , 加 入 TMB 显 色 10 min , 加 入
链抗体 ,仍属鼠源抗体 。我们利用噬菌体抗体库技术 , 2 mol/ L 硫酸终止反应 。酶标仪读取各孔光密度值
从肝癌患者的 B 淋巴细胞中克隆出抗体重链和轻链可 ( OD 值) 。以 P/ N > 2. 1 为阳性 。
变区基因 ,以具有氨苄青霉素抗性的 pDAN5 为载体 ,参 1. 2. 7 　阳性单克隆 Sc Fv 与肝癌细胞结合的特异性
照 Sblattero 等[ 3 ] 的方法 ,构建了全人源肝癌单链抗体噬 分析 　以 Sc Fv 为一抗 , 以抗 M213 为二抗 , 然 后以
菌体呈现库 ,我们的研究利用该抗体库进行肝癌噬菌体 FITC - 兔抗羊抗体处理 ,进行流式细胞仪检测 。以正
单链抗体基因克隆并进行抗体的活性分析。 常胎肝细胞为对照 。

1 　材料与方法 2 　结果

1. 1 　质粒 、
菌株 、
细胞及主要试剂 2. 1 　抗体库滴度
B 淋巴细胞来自西京医院肝胆外科 200 例原发性 经 10 倍 系 列 稀 释 , 测 定 抗 体 库 滴 度 为 71 6 ×
肝癌患者。表达载体噬菌粒 pDAN5 、 大肠埃希菌 TG1 、 10 cf u/ mL 。
9

肝癌细胞系 SMMC27721 由本室保存 ,人胚胎肝细胞 L2 2. 2 　PCR 法鉴定抗体基因插入率

02 由武汉生物保藏中心提供 , 辅助病毒 M13 K07 由董 PCR 法检测 20 个菌落 ,14 个克隆扩增出 ScFv ,目
鸿林博士惠赠。r Taq 酶及限制性核酸内切酶 Nhe Ⅰ、 的基因插入率为 70 % (图 1 ,Fig. 1) 。
Bss H Ⅱ
均为大连宝生物产品 ,质粒提取试剂盒为杭州维 2. 3 　肝癌噬菌体 ScFv 的筛选
特洁公司产品。PCR 引物序列为 5′ 2 TACCTATTGC2 以人 成 纤 维 细 胞 吸 附 后 再 以 人 肝 癌 细 胞 系
CTACGGCA GC 23′, 5′
2ACTTTCAACA GTA GCGGC2 SMMC27721 对噬菌体抗体库进行 3 轮“吸附2洗脱2扩
CGC23′,由上海基康公司合成。 增”的富集筛选 , 将每一轮洗脱下来的噬菌体再感染
1. 2 　方法 T G1 细菌 ,并取少量细菌铺盘 , 测定噬菌体滴度 , 计算
1. 2. 1 　噬菌体抗体库滴度测定 　将 1～10 μL 经适当 每一轮筛选后噬菌体的收获率 。噬菌体收获率由第 1
稀释的噬菌体抗体库铺氨苄青霉素培养板 ,37 ℃培养 轮的 21 2 ×10 - 5 %增加到第 3 轮的 41 7 ×10 - 3 % ,共增
过夜 ,计数集落 ,计算集落形成单位 ( cf u) 。 加了 214 倍 。
1. 2. 2 　PCR 法鉴定抗体基因插入率 　挑取单个细菌 2. 4 　噬菌体单克隆 ScFv PCR 鉴定
集落 ,加入 3 mL 含氨苄 100 μg/ mL 的 LB 培养过夜 , 以来自 20 个单克隆菌落的质粒为模板进行 PCR
按文献方法 [ 4 ] 提质粒 ,取 2 μL 为模板 ,采用 25 μL 体 反应 ,全部扩增出约 750 bp 片段 ( 图 2 ,Fig. 2) 。
系 ,进行 ScFv PCR 扩增 。琼脂糖凝胶电泳检测相应 2. 5 　阳性单克隆 ScFv 酶切鉴定
的 DNA 扩增带 。 采用完全随机方法挑取 10 个单克隆质粒以 Nhe
1. 2. 3 　人源肝癌噬菌体 ScFv 的筛选 　取冻存抗体库菌 Ⅰ及 Bss H Ⅱ双酶切 , 均放出约 750 bp 片段 ( 图 3 ,
种 1 mL ,进行噬菌体表面呈现 ,调整滴度为 1012 cfu/ mL 。 Fig. 3) 。
先以人成纤维细胞吸附后再以人肝癌细胞系 SMMCa2 2. 6 　阳性单克隆 ScFv 活性分析
7721 对初级库进行筛选 ,然后以人肝癌细胞 SMMC27721 采用完全随机方法选取 20 个克隆 ,进行噬菌体表
进行吸附筛选。共进行 3 轮筛选富集。 面呈现后的抗体上清对人成纤维细胞 、 人胚胎肝细胞
1. 2. 4 　阳性噬菌体单克隆 PCR 鉴定 　挑取第三轮筛 L202 及 SMMC27721 的结合活性进行 EL ISA 检测 。
选出的单克隆 ,按前述方法提取单克隆质粒进行 ScFv 基 结果显示 18 个克隆与 SMMC27721 呈阳性反应 ,阳性
因克隆。采用完全随机方法挑取 20 个单克隆 ,加入 3 mL 率为 90 % ,15 个克隆与成纤维细胞有交叉反应 。3 个
含 100μg/ mL 氨苄青霉素的 LB 培养液过夜培养 ,常规提 克隆与 SMMC27721 结合所测 OD 值分别为 01 566 ±
取质粒。以质粒为模板进行 PCR 反应 ,然后以 1 %琼脂 01 074 、
01 395 ±01 002 和 01 406 ±01 024 ,与成纤维细胞
糖凝胶电泳鉴定是否扩增出目的基因。 结合的 OD 值分别为 01 142 ±01 011 、 01 071 ±01 006 和
1. 2. 5 　阳性噬菌体单克隆酶切鉴定 　采用完全随机 01 075 ±01 005 ,与人胚胎肝细胞结合的 OD 值分别为
方法挑取 10 个单克隆质粒以 Nhe Ⅰ 及 Bss H Ⅱ双酶切 , 01 159 ±01 035 、
01 116 ±01 014 和 01 091 ±01 019 。
以 1 %琼脂糖凝胶电泳鉴定是否含有目的基因。 2. 7 　阳性单克隆 ScFv 与肝癌细胞结合的特异性分析
1. 2. 6 　阳性单克隆 Sc Fv 活性分析 　挑取阳性单克 克隆 11 以 Sc Fv 为一抗 ,以抗 M213 为二抗 ,然后
隆 ,以含空载体的 T G1 菌为对照 。按前述方法进行噬 以 FITC2兔抗羊抗体处理 ,进行流式细胞仪检测 ,以正
菌体表面呈现 ,收集上清即为噬菌体抗体 。将单克隆 常胎肝细胞 L202 为对照 ,结果 Sc Fv 与肝癌结合比率
ScFv 及对照上清加入接种有人成纤维细胞 、
人胚胎肝 为 411 3 % ( 图 4 ,Fig. 4) 。

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3 　讨论
抗体不仅有特异性识别抗原决定基的能力 , 而且
具有很好的稳定性和根据需要工程化生产的可能 。因
此 ,抗体技术出现后即引起了广泛关注并得到迅速发
图 1 　CR 扩增 ScFv 片段 ( 第一泳道为 Marker) 展 。作为肿瘤生物学和抗体工程技术发展的结果 , 最
Fig. 1 　ScFv Fragments amplified by PCR ( 1 :DNA marker)
初批准用于治疗人类肿瘤的 2 个抗体已进入临床应
用 : 用于治疗非霍奇金淋巴瘤的 Rit uxan 和治疗乳腺
癌的 Herceptin 。这 2 个抗体都能和过度表达于靶肿
瘤细胞表面受体 ( 非霍奇金淋巴瘤的 CD20 和乳腺癌
的 ErbB2) 结合 。Rit uxan and Herceptin 可产生直接
治疗效果 ,或是诱导细胞凋亡 ( Rit uxan ) , 或产生生长
抑制 ( Herceptin ) 。只有抗体的一部分作用于已知细
图 2 　PCR 扩增 ScFv 片段 ( 第一泳道为 Marker)
胞表面受体 ( 如 ErbB2 ) , 产生这种直接抑制肿瘤生长
Fig. 2 　ScFv Fragments amplified by PCR ( 1 :DNA marker)
的作用 ,因此必须设法采用其他策略 ,如用抗体连接对
肿瘤细胞有杀伤作用的毒素等[ 5 ,6 ] 。自从首次报道用
小鼠 B 细 胞 杂 交 瘤 技 术 制 备 mA b 以 来 , 已 有 29
年 [ 5 ] 。FDA 批准同意用 mA b 治疗也已 18 年 [ 5 ,6 ] 。目
前进行临床试验的 mAb 约有 140 种 ,大部分仍是由鼠
图 3 　10 个单克隆质粒 Nhe Ⅰ及 BssH Ⅱ双酶切鉴定 杂交瘤技术生产 。而噬菌体抗体为抗体的片段 , 分子
( 第一泳道为 Marker) 小、穿透力强 、廓清快 、
异源性低 ,而且能在原核系统中
Fig. 3 　Identification of recombinant pla smid enzyme dige stion 表达 ,易于生产 。利用抗体库技术可简便地制备出针
of 10 clone s ( 1 :DNA marker) 对不同肿瘤患者多种肿瘤的 mAb 片段 , 这些 mA b 片
段与细胞毒素 、 破坏细胞的酶和细胞因子等连接后 ,可
形成对肿瘤细胞有特异性杀伤作用的复合物 , 称为免
疫毒素或生物导弹 。对感染性疾病 、 器官移植排斥反
应的防治及肿瘤的早期诊断 、 治疗 ,以及手术及化疗后
晚期肿瘤的辅助治疗均具有广阔的应用前景 [ 4 ,5 ] 。
噬菌体抗体库技术省去了传统单抗制备中的细胞
融合 ,甚至可以不经免疫 ,直接利用抗原从库中筛选特
异性抗体 ,并可直接克隆到抗体基因 ,使单抗的制备变
得简单易行 、稳定有效 。而这一技术面临的挑战是 ,如
何在最大限度地减少非特异性的噬菌体结合的同时 ,
最大限度地富集特异性噬菌体 , 因此筛选方法的改进
始终是该技术发展的动力 [ 7 ] 。
噬菌体展示库技术 ( p hage display technology ) ,
在一定程度上较好地模拟了体内抗体生成亲和力成熟
过程 ,可快速高效地从大量克隆中筛选展示特异性抗
体的噬菌体 ,为制备高亲和性的抗体提供了有力工具 。
其特点是“它既可识别相应的抗原并与其结合 ,又能够
感染宿主菌进行再扩增”。该技术可绕过免疫制备全
人源性抗体 ,可有效避免鼠源性抗体在人体应用时诱
发产生人抗鼠抗体 ( HAMA ) 等不良反应 。它将表型
( 与抗原特异结合 ) 与基因型 ( 含 V 区基因 ) 联系在一
起 , 把识别抗原的能力和进行再扩增的能力结合起
图 4 　FCM 检测 ScFv 与肝癌细胞结合的特异性 来 ,是一种高效的筛选体系 ,在人源性特异抗体的筛选
Fig. 4 　Sp ecifity of ScFv to liver cancer cells by FCM 和制备上独具优势 [ 6 - 8 ] 。

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・404 ・ 薛国柱 ,等 　全人源肝癌噬菌体单链抗体的筛选及特异性鉴定

肿瘤抗原种类繁多 , 免疫原性低 , 难于纯化 , 其抗 和力较高 。对 Sc Fv 与肝癌细胞结合特异性的 FCM

体制备非常困难 。用常规方法制备的单抗往往种类单 分析结果表明 ,其与肝癌细胞结合比率为 41. 3 % 。我
一 ,且因属异种抗原 ,限制了其在临床上的应用 [ 8 ] 。抗 们将对这些克隆进一步分析 ,并通过改进筛选策略 ,以
体基因的多样性提供了构建可能靶分子的新方法 , 人 获得更为理想的全人源抗肝癌噬菌体抗体及其基因 。
们可从人自身单链抗体噬菌体文库筛选出相应靶抗原
【参考文献】
的抗体 。利用噬菌体抗体库技术建立的抗肿瘤基因文
库 ,可以绕过杂交瘤 , 甚至绕过免疫 , 很方便地得到针 [ 1 ] 　Szardenings M. Phage display of rando m peptide libraries : appli2
cations , limit s , and potential [ J ] . J Recept Signal Transduct
对多种肿瘤不同抗原 ,不同决定簇的功能抗体片段 。
Res , 2003 ,23 (4) :307 - 349.
目前文献报道的特异性噬菌体抗体 , 多数是由固
[ 2 ] 　陆东东 ,张锡然 . 抗人肝癌 MDscFV 基因的表达及其免疫活性初
相纯化抗原筛选得到的 [ 7 ] 。经典筛选技术的前提条件 步研究 [J ] . 临床肝胆病杂志 ,2003 ,19 (5) :302 - 303.
是 ,目的抗体所针对抗原的性质明确且可获得到纯品 。 [ 3 ] 　Sblattero D ,Bradbury A. Exploiting reco mbination in single bac2

对于无法提纯或抗原性质不确定的抗原 ( 如癌细胞表 teria to make large p hage antibody libraries[J ] . Nat Biotechnol ,
2000 ,18 (1) :75 - 80.
面受体) ,采用传统的筛选方法可使抗原失活 , 如某些
[ 4 ] 　Zampieri S , Mahler M , Blut hner M , et al . Recombinant anti2P
膜蛋白 ,因此 ,需建立新的筛选系统或对传统的筛选技
protein autoantibodies isolated f ro m a human autoimmune librar2
术进行改进 [ 9 ] 。直接用细胞系从单链噬菌体抗体库中 y : reactivit y , specificit y and epitope recognition [ J ] . Cell Mol
筛选细胞表面受体结合的抗体已有报道 [ 6 ,9 ] 。 Kup sch Life Sci , 2003 , 60 (3) :588 - 598.
等 [ 9 ] 用肿瘤细胞作为靶抗原 , 已从噬菌体抗体库中筛 [ 5 ] 　Stockwin L H , Holmes S. The role of t herapeutic antibodies in
drug discovery[J ] . Biochem Soc Trans , 2003 ,31 (2) :433 - 436.
选出与黑色素瘤细胞特异性结合的抗体 。
[ 6 ] 　Huston J S , George A J . Engineered antibodies take center stage
我们以 pDAN5 为载体 , 从 200 例原发性肝癌患
[J ] . Hum Antibodies. 2001 ,10 (3 - 4) :127 - 142.
者的 B 淋巴细胞中克隆出抗体重链和轻链可变区基 [ 7 ] 　Osbourn J , J ermut us L , Duncan A. Current met hods for t he
因 ,构建了全人源肝癌单链抗体库 ,滴度达 109 mL - 1 。 generation of human antibodies for t he t reat ment of autoimmune
PCR 法鉴定目的基因插入率为 70 % 。以 SMMC27721 diseases[J ] . Drug Discov Today , 2003 , 8 (18) :845 - 851.

细胞对该抗体库进行 3 轮筛选 。在“吸附2洗脱2扩增” [ 8 ] 　Korn T , Nettelbeck D M , Volkel T ,et al . Reco mbinant bispecif 2
ic antibodies for t he targeting of adenoviruses to CEA2expressing
的筛选过程中 ,回收的噬菌体比率却逐渐增加 ,3 轮共
t umour cells : a co mparative analysis of bacterially exp ressed sin2
增加了 214 倍 。在洗脱下来的噬菌体中 ,含 Sc Fv 基因 gle2chain diabody and tandem scFv[J ] . J Gene Med ,2004 ,6 (6) :
的克隆比率也得到明显提高 ( 由筛选前的 70 %增到筛 642 - 651.
选后的 100 %) ,证实了特异性噬菌体抗体在筛选过程 [ 9 ] 　Kup sch J M , Tidman N H , Kang N V , et al . Isolation of human

中得到富集 。因此 ,用噬菌体抗体抗体库技术制备肿 t umor2specific antibodies by selection of an antibody p hage li2

brary on melano ma cell s[J ] . Clin Cancer Res ,1999 ,5 ( 4) : 925 -
瘤单抗不失为一种有效的方法 。首先利用正常人成纤
931.
维细胞对非特异性噬菌体抗体进行吸附 , 使得筛选出
的抗体的特异性更强 。对阳性单克隆 Sc Fv 活性分析
收稿日期 :2004 - 10 - 12 　修回日期 :2005 - 01 - 10
表明 ,90 %的克隆与 SMMC27721 呈阳性反应 ,特别是 ( 编辑 : 陈万军)
其中 3 株呈强阳性反应 ( 比正常细胞高 3 倍以上 ) , 亲

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