Pesquisa Laboratorial do Mestrado- Tcnica Cmara de Neubauer Valdomiro Nery Gonalves - 31/08/2011

Cmara de Neubauer Contagem de clulas microbianas Determinao da Concentrao de clulas

1. Introduo a Cmara de Neubauer 1.1. Quando se trabalha com microorganismos, na maioria das vezes deseja se determinar a concentrao de clulas da suspenso preparada. 1.2. Uma das formas mais comuns de se obter esta estimativa atravs da contagem ao microscpio, utilizando-se uma Cmara de Neubauer, tambm conhecida como Hemacitmetro ou Cmara de Contagem. 1.3. A Cmara de Neubauer uma lmina grossa de uso microscpico, com formato retangular e normalmente de vidro, com uma depresso no centro, utilizada para fazer contagem de clulas por unidade de volume de uma suspenso. 1.4. Na UP h dois modelos de Cmara de Neubauer, uma com a superfcie da cmara espelhada e a outra no espelhada veja fotos abaixo.

Neubauer com Cmara espelhada

Neubauer com Cmara no espelhada

1.5. A Cmara de Neubauer constituda de duas cmaras, ao centro, uma embaixo da outra, sobre as quais colocada a lamnula para a leitura no microscpio.
Cmara Inferior Cmara Superior

1.6. No centro destas cmaras h vrias linhas perpendiculares com marcaes em quadrantes. Observando-se ao microscpio, percebe-se que existem trs tipos de quadrantes denominados A, B e C, de medidas conhecidas, que juntos formam um quadrado maior. 1.7. Estes quadrantes so usados para fazer as contagens e assim determinar a concentrao de clulas em um determinado volume de fluido, para poder calcular a concentrao de clulas no lquido global (do qual foi tirado amostra analisada).

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1.8. Pode-se notar que estes quadrantes tm sub-divises diferentes, fazendo com que o critrio para escolha do quadrante onde sero contadas as clulas, seja o tamanho destas a serem quantificados. Assim, usualmente, clulas muito pequenas so contados no quadrante C, as de tamanho intermedirio no quadrante B, enquanto clulas grandes so contadas no quadrante A (que o caso das leveduras). 1.9. A rea total compreendida pelos 9 quadrantes de 9 mm2 sendo que cada quadrante (A, B e C) so quadrados de 1 x 1 mm. Ao ser colocada a lamnula (especial para ser usada na cmara de Neubauer, estas so mais grossas que as comuns) a distncia da lamnula at a lmina (profundidade) mede 0,1 mm, o que permite se obter um volume de 0,1 mm3 em cada quadrante. 1.10. A preciso da contagem manual utilizando este mtodo depende basicamente: da mistura correta da amostra, para que a concentrao esteja homognea e que no se formem bolhas; do nmero de cmaras (quadrantes) contadas; do nmero de clulas contadas, onde a concentrao vivel de 200 a 500 por 0,1 mm3.

2. Contagem de clulas e determinao da concentrao celular com a Cmara de Neubauer 2.1. Material
*

Cmara de Neubauer e lamnula Microscpio tico Agitador vortex Tubos de eppendorf Estante para tubos de eppendorf Micropipetas de 100 a 1000 L (duas), uma para coletar amostra e outra para gua Micropipeta de 100 L* para carregar a cmara de Neubauer Ponteiras para os dois tipos de pipetas Piscete com gua destilada para as diluies e para limpar a cmara de Neubauer Piscete com lcool 70 % para limpar a cmara de Neubauer Papel macio para limpar/enxugar a cmara de Neubauer e a lamnula Becker de 250 mL para conter gua destilada a ser usada nas diluies Becker de 500 mL para colocar os eppendorf e ponteiras de pipeta usadas Becker de 500 mL para conter o lcool e gua utilizados na limpeza da cmara e lamnula de Neubauer

Obs.: A pipeta de 100 L uma pipeta alaranjada que facilita muito o carregamento da Cmara de Neubauer. Com as outras pipetas fica mais difcil carregar a cmara. Tambm se pode utilizar as pipetas de 50 L que tem o corpo cinza e a ponta e o boto acionador
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amarelos. Estas pipetas ficam dentro de uma gaveta identificada com o nome pipetas, na sala das autoclaves, no lado esquerdo da estufa de esterilizao de vidrarias, ltima gaveta. 2.2. Mtodo 2.2.1. Preparo da bancada de trabalho 2.2.1.1. Cortar mais ou menos 1 metro de papel Kraft (papel marrom em rolo que esta preso a um suporte de corte), coloca-lo esticado sobre a bancada de laboratrio onde se vai trabalhar e organizar sobre o mesmo todos os materiais acima listados.

2.2.2. Preparo da cmara de Neubauer 2.2.2.1. Toma-se a cmara de Neubauer lava-se com jatos de gua do piscete, depois lava-se com jatos de lcool 70 % e em seguida seca-se com o papel macio tomando cuidado para deixar bem seco e no grudar nenhum fiapo de papel na cmara. Faz-se o mesmo procedimento com a lamnula. Observao importante: Sempre deve-se lavar a cmara e a lamnula aps cada leitura, para se efetuar novas leituras ou quando for guard-las. 2.2.2.2. Depois se toma a cmara de Neubauer e passa-se saliva com o dedo nas duas laterais das cmaras para facilitar a fixao da lamnula. Em seguida deve-se fixar a lamnula sobre a cmara de Neubauer, conforme desenho abaixo, pressionando levemente com os polegares a lamnula (tomando cuidado para no tocar na parte que cobre a cmaras para no prejudicar a leitura devido as digitais) fazendo pequenos movimentos para cima e para baixo at sua fixao. Obs: Para se certificar que a lamnula esta devidamente fixada na cmara, inclina-se esta deixando-a verticalmente alinhada a bancada de trabalho; se no cair porque esta bem fixa.
Laterais das cmaras

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2.2.3. Colocao da amostra para contagem na Cmara de Neubauer 2.2.3.1. Com uma micropipeta de 100 ou 50 L, coleta-se a amostra a ser analisada e deposita-se cuidadosamente entre a cmara e a lamnula tomando cuidado para preencher totalmente o volume da camara mas sem deixar vazar e/ou cair amostra sobre a lamnula. Para tanto deve-se aproximar a pipeta da cmara, com uma gota na ponta, sem encostar na lamnula (veja desenho abaixo) o suficiente para que a amostra seja arrastada por capilaridade.

Obs: Na hora de carregar a pipeta e de colocar a amostra deve-se tomar o cuidado para
no formar bolhas na pipeta, pois estas afetam o carregamento da cmara.

Veja que se pode carregar tanto na cmara de cima como na cmara de baixo e fazer duas leituras, sempre tomando o cuidado, na hora de colocar a amostra, para no vazar de uma cmara para outra.
2.2.3.2. Aps a colocao da amostra na cmara aguarda-se um momento para que haja a sedimentao das clulas e procede-se a contagem ao microscpio. Geralmente mais fcil de visualizar as leveduras com a objetiva de 40 X.

Obs: Caso seja necessrio, pode-se melhorar a visualizao das clulas utilizando algumas gotas de corantes como o cristal violeta ou azul de metileno na gua a ser utilizada na diluio da amostra em anlise.
2.2.3.3. Para leveduras e bactrias, pela prtica melhor escolher para trabalhar os quadrantes A, sendo que a contagem vivel, ou seja, a contagem facilitada quando h de 8 - 20 clulas em cada um dos 16 quadrados deste quadrante. Quando h mais do que 20 clulas em cada quadrado fica muito difcil conta-las, sendo ento necessrio fazer a diluio da amostra. 2.2.4. Diluio da amostra para contagem na Cmara de Neubauer 2.2.4.1. Para efetuar a diluio da amostra primeiramente temos que agit-la no vortex, para perfeita homogeneizao, tomamos 100 L (0,1 mL) com uma micropipeta, colocamos em um eppendorf e adicionamos 900 L (0,9 mL) de gua destilada (diluio 1:10). 2.2.4.2. Tambm devemos homogeinizar cuidadosamente esta nova soluo no vortex com o eppendorf fechado para no vazar, e procedemos ao carregamento da cmara conforme descrito nos itens 2.2.2 e 2.2.3 e seus sub itens. 2.2.4.3. Caso o nmero de clulas por quadrado ainda no esteja dentro da faixa tima para contagem, procede-se nova diluio, agora tomando 100 L (0,1 mL) do eppendorf diludo, aps homogeneizao do mesmo no vortex, e colocando em outro eppendorf com a adio de 0,9 mL (900 L) de gua (agora efetuamos uma diluio 1:100). E assim fazemos sucessivamente at que seja vivel a contagem das clulas.

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2.2.5. Leitura e Determinao da concentrao de clulas na Cmara de Neubauer 2.2.5.1. Vimos que para leveduras aconselhvel utilizar os quadrantes A da cmara de Neubauer. Vimos que existem 4 quadrantes A iguais na cmara e pode-se optar por fazer a contagem em qualquer um deles. Uma maior preciso pode-se obter contando todas as reas A na cmara e depois tira-se a mdia. 2.2.5.2. interessante estabelecer uma sequencia de contagem dos quadrados e segui-la sempre para evitar erros. Por exemplo pode-se seguir a sequencia indicada no desenho abaixo.

2.2.5.3. Para fazer a leitura podemos dispor de um desenho de 16 quadrados para ir anotando os nmeros de clulas lidos em cada um dos 16 quadrados do quadrante A. Veja o exemplo abaixo. 9 9 8 5 11 3 3 7 0 8 6 10 7 3 5 1 Total de clulas nos 16 quadrados igual a 95.

2.2.5.4. Para calcular a concentrao de clulas fazemos o seguinte raciocnio: Vimos que o volume de cada quadrante de 0,1 mm3 ou em 0,0001 cm3 ou mL Logo ao contarmos o nmero total de clulas de um quadrante temos quantas clulas temos em 0,0001 mL ou em 1 x 10-4 mL Assim podemos fazer a seguinte regra de trs: Se em 1 x 10-4 mL Em 1 mL ------temos --------teremos- --Nmero de clulas contadas (C) N clulas

Multiplicando em cruz temos: N = C x 104 clulas/mL No caso de termos feito alguma diluio temos que multiplicar pelo fator de diluio: N = C . D x 104 clulas/mL Assim no nosso exemplo acima onde tivemos 95 clulas contadas, e supondo que fizemos uma diluio 1:10, temos: N = C . D x 104 = 95. 10 . 104 = 9,5 x 106 clulas/mL