ANALISIS KUALITATIF DAN SEMI KUANTITATIF RHODAMIN B DAN TARTRAZINE DALAM SARDINES KALENGAN MEREK XX DAN YY DENGAN METODE

KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS DAN DENSITOMETRI

Laporan Penelitian Analisis Makanan

Oleh: Rachelia Octavia E. (098114008) Johanes Putra W (098114010) Dina Christin (098114015)

LABORATORIUM KIMIA ANALISIS INSTRUMENTAL FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2011

BAB I PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Saat ini, banyak makanan-makanan yang beredar di Indonesia. Makananmakanan tersebut bisa merupakan makanan instan yang tahan lama, maupun makanan yang non-instan. Berbagai bahan tambahan ditambahkan pada makanan, agar lebih menarik dan meningkatkan penerimaan pasien. Salah satu bahan tambahan yang sering ditambahkan pada makanan adalah pewarna. Bahan tambahan berupa pewarna ditambahkan agar makanan tampak menarik. Namun, atas dasar alasan tersebut, banyak pihak yang menggunakan bahan pewarna makanan dalam jumlah yang melebihi batas, bahkan bahan pewarna non pangan, misalnya pewarna tekstil. Penggunaan pewarna tekstil oleh produsen umumnya untuk mengurangi biaya produksi, karena pewarna tekstil harganya jauh lebih murah dari pewarna makanan. Jika ditinjau dari segi kesehatan, pewarna tekstil tentunya tidak baik untuk dikonsumsi, apalagi dalam jumlah banyak. Makanan instan yang cukup digemari masyarakat, terutama pecinta ikan adalah ikan sardines yang dikemas dalam kaleng. Ikan sardines dalam kaleng ini biasanya dilengkapi dengan sausnya. Saus pada makanan tersebut umumnya berwarna merah hingga jingga. Sehingga, memungkinkan digunakannya bahan pewarna pada makanan tersebut. Atas pertimbangan hal tersebut, penulis melakukan uji analisis kualitatif dan kuantitatif bahan tambahan perwarna rhodamin B dan tartrazine pada ikan sardines merek XX dan YY. 1. Rumusan Masalah Berdasarkan latar belakang tersebut dapat diperoleh rumusan masalah sebagai berikut : a. Apakah Sardines merek XX dan YY mengandung bahan pewarna rhodamin B dan tartrazine?

b. Apabila Sardines merek XX dan YY mengandung bahan pewarna rhodamin B dan tartrazine, berapa kadar bahan pewarna tersebut?

2. Manfaat Praktikan dapat mengetahui apakah Sardines merek XX dan YY mengandung bahan pewarna rhodamin B dan tartrazine atau tidak, beserta kadarnya.

B. Tujuan 1. Tujuan Umum Praktikan mampu menganalisis bahan pewarna dalam sampel makanan 2. Tujuan Khusus a. Praktikan mampu mengetahui ada tidaknya pewarna rhodamin B dan tartrazine pada Sardines merek XX dan YY. b. Praktikan mampu mengetahui kadar pewarna rhodamin B dan tartrazine pada Sardines merek XX dan YY.

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA

A. Ikan dalam Kaleng Ikan dalam kaleng juga bisa dibuat sebagai campuran pembuatan kudapan dari bahan ikan. Oleh karena itu, mengetahui tanda-tanda kemasan kaleng yang masih baik atau tidak, sangat diperlukan, karena ikan dalam kaleng akan ikut rusak apabila kemasannya rusak. Adapun ciri-ciri kemasan kaleng yang masih baik adalah kalengnya masih nampak mengkilat, tidak berkarat, bagian atas dan bawah kaleng tidak menggelembung, belum habis masa pakainya (kadaluwarsa), dan etiketnya masih baik. Sementara, tanda-tanda ikan dalam kaleng yang sudah rusak adalah kedua ujung kaleng menggelembung. Kaleng menggelembung disebabkan oleh adanya tekanan gas yang dihasilkan dari proses penguraian ikan oleh

mikroorganisme. Selain itu, bisa juga kaleng masih tampak baik, tetapi jika dibuka tercium bau asam. Bau asam ini disebabkan karena terjadinya proses penguraian ikan dalam kaleng oleh mikroorganisme. Hal ini disebabkan ikan sudah tercemar oleh mikroorganisme sebelum dikalengkan. Apabila kita jumpai produk yang demikian, maka sebaiknya jangan dikonsumsi (Purnomowati, 2008).

B. Pewarna 1. Pewarna Makanan Pewarna makanan merupakan bahan tambahan pangan yang dapat memperbaiki penampakan makanan. Penambahan bahan pewarna makanan mempunyai beberapa tujuan, di antaranya adalah memberi kesan menarik bagi konsumen, menyeragamkan dan menstabilkan warna, serta menutupi perubahan warna akibat proses pengolahan dan penyimpanan (Suhanda, 2006). Pada tahun 1960 dikeluarkan peraturan mengenai penggunaan zat pewarna yang disebut Color Additive Amandement yang dijadikan undang-undang. Dalam undang-

undang ini zat pewarna dibagi menjadi dua kelompok yaitu certified color dan uncertified color. a. Certified color Ada dua macam yang tergolong certified color yaitu dye dan lake. Keduanya adalah zat pewarna buatan. Zat pewarna yang termasuk golongan dye telah melalaui prosedur sertifikasi dan spesifikasi yang ditetapkan FDA (Food and Drug Act). Sedangkan zat pewarna lake yang hanya terdiri dari satu warna dasar, tidak merupakan warna campuran, juga harus mendapat sertifikat. i. Dye Dye adalah zat pewarna yang pada umumnya bersifat larut dalam air dan larutannya dapat mewarnai. Pelarut yang dapat digunakan selain air adalah propilenglikol, gliserin, atau alkohol. Dye terdapat dalam bentuk bubuk, butiran, pasta, maupun cairan yang penggunaannya tergantung kondisi bahan, kondisi proses, dan zat pewarnanya sendiri. ii. Lake Diijinkan pemakaiannya sejak tahun 1959, dan penggunaannya meluas dengan cepat. Zat pewarna ini merupakan gabungan dari zat warna (dye) dengan radikal bebas (Al atau Ca) yang dilapisi dengan hidrat alumina atau Al(OH) 3. Lapisan alumina ini tidak larut dalam air, sehingga lake ini tidak larut pada hamper semua pelarut. Sesuai dengan sifatnya yang tidak larut dalam air, zat pewarna ini digunakan untuk produk-produk yang tidak boleh terkena air. Lake sering kali lebih baik digunakan untuk produk-produk b. Uncertified color Zat pewarna yang termasuk dalam uncertified color ini adalah zat pewarna mineral, walaupun ada juga beberapa zat pewarna seperti -karoten dan kantaxantin yang telah dapat dibuat secar sintetik. Untuk penggunaannya, zat pewarna ini bebas dari prosedur sertifikasi dan termasuk daftar yang telah tetap. Satu-satunya zat pewarna uncertified yang penggunaannya masih bersifat sementara adalah carbon black (Winarno, 1995).

2.

Peraturan Pemakaian Zat Pewarna untuk Makanan Uncertified color atau pewarna sintetik tidak dapat digunakan sembarangan. Di

negara maju, pewarna jenis ini harus melalui proses sertifikasi terlebih dahulu sebelum digunakan pada bahan makanan. Di Indonesia peraturan penggunaan zat pewarna sintetik baru dibuat pada tanggal 22 Oktober 1973 melalui SK Menkes RI No. 11332/A/SK/73, sedangkan di Amerika Serikat aturan pemakaian pewarna sintetik sudah dikeluarkan sejak tahun 1906. Peraturan ini dikenal dengan Food and Drug Act (FDA) yang mengijinkan penggunaan tujuh macam zat pewarna sintetik, yaitu orange no.1, erythrosine, ponceau 3R, amaranth, indigotine, napthol-yellow, dan light green. Sejak saat itu banyak pewarna lain yang mendapat izin untuk digunakan pada bahan makanan setelah mengalami berbagai pengujian fisiologis. Pada tahun 1983 FDA disempurnakna menjadi Food, Drug, and Cosmetic Act (FD & C). sejak saat itu zat pewarna sintetik dibagi menjadi tiga kelompok : FD and C color, untuk makanan, obat-obatan, dan komestik; D & C untuk obat-obatan dan komestik (tidak dapat digunakan untuk makanan); dan Ext D & C yang diizinkan untuk dipakai pada obat-obatan dan komestik dalam jumlah yang dibatasi. Pemerintah Indonesia melalui Menteri Kesehatan RI telah mengeluarkan Surat Keputusan tentang jenis pewarna alami dan sintetik yang diijinkan serta yang dilarang digunakan dalam makanan pada tanggal 19 Juni 1979 No. 235/Menkes/Per/VI/79. Kemudian disusul dengan Surat Keputusan Menteri Kesehatan RI tanggal 1 Mei 1985 No. 239/Menkes/Per/V/85, yang berisikan jenis pewarna yang dilarang. Terakhir telah dikeluarkan pula Surat Keputusan Menteri Kesehatan No. 722/Menkes/Per/88, yang mengatur batas penggunaan maksimum dari pewarna yang diijinkan untuk makanan (Winarno, 1995). Selanjutnya di bawah ini diuraikan zat pewarna yang dinyatakan sebagai Bahan Berbahaya Dalam Obat dan Makanan berdasarkan Keputusan Direktur Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan.

Berikut adalah pewarna yang diijinkan penggunaannya di Indonesia, yaitu

Tabel I. Pewarna yang diijinkan penggunaannya dalam makanan Sumber : Direktorat Pengawasan Makanan dan Minuman (1994)

Warna I. Zat warna alam Merah Merah Kuning Kuning Kuning Kuning Hijau Biru Coklat Hitam Hitam Putih II. Zat warna sintetik Merah Merah Merah Oranye Kuning Kuning Hijau Biru Biru Ungu

Nama Alkanan Cochineal red (karmin) Annato Karoten Kurkumin Safron Klorofil Ultramarin Karamel Carbon Black Besi oksida Titanium oksida Carmoisine Amaranth Erythrosine Sunsetyellow FCF Tartrazine Quinelene yellow Fast Green FCF Brliiant blue FCF Indigocarmine (Indigotine) Violet GB

Nomor Indeks Nama

75520 75470 75120 75130 75300 75100 75810 77007 77266 77499 77891 14720 16185 45430 15985 19140 47005 42053 42090 42090 42640

Sedangkan berikut adalah zat warna yang dinyatakan sebagai bahan berbahaya dalam obat dan makanan.
Tabel II. Bahan pewarna berbahaya yang tidak diijinkan penggunaannya dalam makanan dan obat Sumber : SK Menteri Kesehatan RI No. 239/Menkes/Per/V/85

No. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30.

Nama Auramin (CI basic Yellow 2) Alkanat Butter Yelow Black 7984 Burn Umber Chrysoidine Chrysoine Citrus Red No. 2 Chocolate Brown FB Fast Red E Fast Yellow AB Guinea Green B Indanthrene Blue RS Magenta Methanyl Yellow Oil Orange SS Oil Orange XO Oil Yellow AB Oil Yellow OB Orange G Orange GGN Orange RN Orchil and Orcein Ponceau 3R Ponceau SX Ponceau 6R Sudan I Rhodamin B Scarlet GN Violet GB

Nomor Indeks Warna (CI.NO) 41400 75520 11020 27755 77491 11270 14270 12156 16045 13015 42085 69800 42510 13065 12100 12140 11380 11390 16230 15980 15970 16155 14700 16290 12055 45170 14815 42640

3.

Dampak Zat Warna pada Kesehatan Pemakaian bahan pewarna pangan sintetis dalam pangan walaupun mempunyai

dampak positif bagi produsen dan konsumen, di antaranya dapat membuat suatu pangan lebih menarik, meratakan warna pangan dan mengembalikan warna dari bahan dasar yang hilang atau berubah selama pengolahan, namun dapat member dampak negatif terhadap kesehatan manusia. Beberapa hal yang mungkin memberi dampak negatif tersebut terjadi bila : a. Bahan pewarna sintetis ini dimakan dalam jumlah kecil, namun berulang b. Bahan pewarna sintetis dimakan dalam jangka waktu lama c. Kelompok masyarakat luas dengan daya tahan yang berbeda-beda, yaitu tergantung pada umur, jenis kelamin, berat badan, mutu pangan sehari-hari dan keadaan fisik d. Berbagai lapisan masayarakat yang mungkin menggunakan bahan pewarna sintetis secara berlebihan e. Penyimpanan bahan pewarna sintetis oleh pedagang bahan kimia yang tidak memenuhi persyaratan (Cahyadi, 2006). Zat pewarna alami sejak dulu telah dikenal dalam industri makanan untuk meningkatkan daya tarik produk makanan tersebut, sehingga konsumen tergugah untuk membelinya. Namun sudah sejak lama pula terjadi penyalahgunaan dengan adanya pewarna buatan yang tidak diizinkan untuk digunakan sebagai zat aditif. Contohnya adalah rhodamine B, yaitu zat pewarna yang lazim digunakan sebagai pewarna makanan, dapat menyebabkan kerusakan pada organ hati. Makanan yang diberi zat pewarna rhodamine B dan methyl yellow biasanya berwarna lebih terang dan memiliki rasa agak pahit. Kelebihan dosis pewarna ini dapat menyebabkan kanker, keracunan, iritasi paru-paru, mata, tenggorokan, hidung dan usus. Selain itu, bahan pewarna seperti amaranth dan tartrazin oleh sejumlah studi terkait dapat menyebabkan bintik-bintik merah pada kulit. Penggunaann tartrazin menyebabkan reaksi alergi, asma, dan hiperaktif pada anak. juga

Erythrosine

menyebabkan reaksi alergi pada pernapasan, hiperaktif pada anak, tumor tiroid pada

tikus, dan efek kurang baik pada otak dan perilaku. Fast green FCF menyebabkan reaksi alergi dan produksi tumor. Sedangkan sunset yellow menyebabkan radang selaput lender pada hidung, sakit pinggang, muntah-muntah, dan gangguan pencernaan (Cahyadi, 2006).

4.

Rhodamine B Rhodamine B sebenarnya ialah bahan kimia yang digunakan untuk pewarna

merah pada industry terkstil dan plastic. Untuk makanan, rhodamine B sering dipakai untuk mewarnai krupuk, terasi, kembang gula, sirup, dan sosis. Makanan yang diberi pewarna ini biasanya berwarna lebih terang dan memiliki rasa agak pahit. Kelebihan dosis rhodamine B dapat menyebabkan kanker, keracunan, serta iritasi pada paruparu, mata, hidung, dan tenggorokan. Pewarna rhodamine ini berpendar sehingga dapat dengan mudah dideteksi dengan instrument fluorometer (Surhone, 2010). Rhodamine B mudah larut dalam air dan alcohol serta sedikit larut dalam HCl dan NaOH (ONeil, 2006). Titik lebur dari rhodamine B yaitu 210-211oC (Anonim, 2007). Struktur :

Gambar 1. Struktur Rhodamine B (Surhone, 2010)

5.

Tartrazine Tartrazine adalah salah satu pewarna yang paling sering menimbulkan

intoleransi makanan. Reaksi yang tidak diinginkan ini lebih sering dialami oleh

mereka yang juga sensitif terhadap asam asetilsalisilat. Sekitar 10-40% orang yang peka terhadap aspirin biasanya mudah sekali terserang reaksi alergi oleh tartrazine yang menimbulkan gambaran asma, urtikaria, rhinitis, dan hiperaktivitas anak. Reaksi ini menjadi mungkin karena struktur kimia molekul tartrazine mirip dengan struktur salisilat (Arisman, 2009). Tartrazine sangat mudah larut dalam air (ONeil, 2006). Tartrazine memiliki titik lebur 300oC (Anonim, 2007). Struktur :

Gambar 2. Struktur Tartrazine (Arisman, 2009)

C. Analisis Kualitatif dan Semi-kuantitatif 1. Ekstraksi Cair-cair Pada metode ini, sampel dimasukkan ke dalam corong pisah yang mengandung kedua fase tidak bercampur. Pada ekstraksi cair-cair ini bukanlah volume fase organik yang penting, melainkan jumlah pengekstrasian yang dilakukan. Ekstraksi 10 mL fase organik sebanyak 5 kali akan memisahkan senyawa yang lebih banyak dibandingkan dengan satu kali ekstraksi volume 50 mL, walaupun volume total pelarut organik yang digunakan sama. Sama halnya, sepuluh kali ekstraksi fase organik sebanyak 5 mL akan lebih efisien lagi dan demikian seterusnya. Efek ini (yang umum pada semua jenis ekstraksi) merupakan sesuatu yang masuk akal. Setiap kali salah satu fase dipindahkan dan digantikan dengan pelarut yang baru, kesetimbangan untuk proses partisi akan tersusun ulang sesuai dengan perbandingan

koefisien partisi, dan sampel akan meninggalkan fase berair menuju fase organik dan memperbaiki perbandingan kesetimbangan (Cairns, 2004).

2.

Kromatografi Lapis Tipis Densitometri Prinsip dari KLT yaitu suatu analit bergerak naik atau melintasi lapisan fase

diam (paling umum digunakan gel silica), di bawah pengaruh fase gerak (biasanya campuran pelarut organik), yang bergerak melalui fase diam oleh kerja kapiler. Jarak pemindahan oleh analit tersebut ditentukan oleh afinitas relatifnya untuk fase diam vs fase gerak. Penerapan metode ini yaitu digunakan untuk menenetukan pengotor dalam bahan baku famasi dan produk-produk yang sudah diformulasi, digunakan juga sebagai pemeriksaan identitas dasar terhadap bahan baku farmasi, dan kemungkinan bermanfaat dalam validasi pembersihan, yang merupakan bagian dari pembuatan obat. Kelebihan dari metode ini yaitu deteksi melalui reaksi kimia dengan menggunakan reagen penampak dapat dilakukan yang berarti bahwa kurang lebih setiap jenis senyawa dapat dideteksi jika menggunakan reagen deteksi yang sesuai, robust, murah, dan dikombinasikan dengan deteksi densitometri, metode ini dapat digunakan sebagai teknik kuantitatif untuk senyawa-senyawa yang sulit dianalisis dengan metode-metode kromatografi lain karena tidak adanya kromofor (Watson, 2010). Penggunaan KLT sebagai suatu metode kuantitatif dapat dilakukan dengan menggunakan densitometer untuk membaca intensitas bercak. KLT kuantitatif paling baik digunakan dengan menggunakan system kinerja tinggi. Densitometer dapat digunakan untuk menghitung komponen dalam sampel pada basis fluoresensi atau serapan cahaya UV (Watson, 2010). Pengukuran rasio L/S dengan kromatografi lapis tipis (KLT) terdiri dari pengolahan cepat cairan amnion dengan pemusingan untuk menyingkirkan sel-sel dan partikel lain, ekstraksi dengan pelarut organik, pemekatan, dan aplikasi sampel ke sebuah lempeng lapis-tipis. KLT didasarkan pada pemisahan lesitin dan sfingomielin dengan migrasi suatu pelarut organik di sepanjang lempeng lapis tipis; jumlah relatif

kedua zat ini kemudian dihitung dari pengukuran intensitas atau area bercak dengan menggunakan densitometri. Bagaimanapun, metode KLT merupakan metode

pemeriksaan rasio L/S yang pertama dan sampai saat ini masih digunakan di banyak laboratorium (Sacher, 2002). Pada KLT, sampel diletakkan pada plat dan dibiarkan mengembang. Fase gerak yang digunakan dapat berupa air atau campurannya air dengan pelarut organik yang dapat bercampur (seperti aseton) untuk meningkatkan kelarutan sampel. Setelah mengembang, bercak-bercak yang terbentuk segera dilihat (dengan menggunakan lampu ultraviolet jika obat tersebut memiliki gugus kromofor, atau dengan uap iodine jika obat tidak memiliki gugus kromofor), dan Rf masing-masing bercak ditentukan. Rf adalah hasil pembagian antara jarak perpindahan bercak dengan jarak pengembangan pelarut, dan dituliskan dalam bentuk nilai desimal (Cairns, 2004).

D. Landasan Teori Ikan dalam kaleng merupakan salah satu makanan yang dapat disajikan sebagai kudapan. Bahan tambahan pewarna diberikan untuk menambah nilai estetika dan penerimaan konsumen. Penggunaan bahan tambahan pewarna untuk makanan diatur dalam Surat Keputusan Menteri Kesehatan RI tanggal 1 Mei 1985 No. 239/Menkes/Per/V/85, yang berisikan jenis pewarna yang dilarang. Dan terakhir telah dikeluarkan pula Surat Keputusan Menteri Kesehatan No. 722/Menkes/Per/88, yang mengatur batas penggunaan maksimum dari pewarna yang diijinkan untuk makanan. Rhodamine B merupakan salah satu pewarna sintetik berwarna merah keunguan yang dilarang penggunaannya oleh pemerintah untuk bahan tambahan pangan. Sedangkan tartrazine merupakan salah satu pewarna sintetik yang diperbolehkan untuk bahan pewarna makanan, dengan batas penggunaan 200 mg/kg produk pangan yang diproduksi. Kromatografi lapis tipis merupakan salah satu metode analisis yang dilakukan dengan menotolkan sampel pada lempeng KLT, lalu dikembangkan dalam eluen tertentu hingga batas pengembangan. Analisis kuantitatif dengan KLT dapat

dilakukan dengan bantuan alat densitometri yang akan mendeteksi bercak berdasarkan densitasnya. Bahan pewarna pada suatu produk dapat dianalisis dengan menggunakan metode kromatografi lapis tipis.

E. Hipotesis Hi : Dalam sarden merek XX dan YY terkandung bahan pewarna rhodamin B dan tartrazine . Ho : Dalam sarden merek XX dan YY tidak terkandung bahan pewarna rhodamin B dan tartrazine .

BAB III METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian ini merupakan jenis penelitian non eksperimental dengan rancangan penelitian deskriptif karena di dalam penelitian ini tidak dilakukan manipulasi terhadap subyek uji yaitu sarden merek XX dan YY. Peneliti hanya mendeskripsikan keadaan yang ada.

B. Definisi Operasional 1. Ekstraksi cair-cair adalah proses pemisahan solut dari suatu cairan pembawa menggunakan pelarut cair (solven) 2. Kromatografi lapis tipis digunakan untuk memisahkan komponen-komponen atas dasar perbedaan adsorpsi atau partisi oleh fase diam dibawah gerakan pelarut pengembang. 3. Rf merupakan perbandingan jarak yang digerakkan oleh senyawa dengan jarak yang digerakkan oleh permukaan pelarut. 4. Densitometri merupakan teknik kuantitatif untuk senyawa-senyawa yang sulit dianalisis dengan metode-metode kromatografi lain karena tidak adanya kromofor

C. Alat Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah blender, bekker gelas, gelas arloji, corong pisah, chamber, pengaduk, mikropipet, TLC Scanner, lempeng silika gel, rotavapor, kertas saring.

D. Bahan Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sarden (merek XX dan YY), silika gel GF254, aquadest, petroleum eter, standar rhodamin B dan tartrazine, serta eluen n-butanol:metil etil keton:NH4OH:H2O (5:3:1:1).

E. Tata cara Penelitian 1. Identifikasi Sampel Identifikasi bertujuan untuk memastikan apakah sampel yang dianalisis benarbenar merupakan sampel yang diinginkan. Hal ini dilakukan dengan melihat keterangan yang tertera pada kemasan yaitu meliputi kandungan sarden, nomor batch, tanggal kadaluarsa. Selain itu pada kemasan sampel juga diamati apakah masih dalam kondisi yang bagus atau sudah rusak, karena hal tersebut bisa mempengaruhi hasil analisis.

2. Preparasi sampel untuk dianalisis Masing-masing sarden dihancurkan dengan diblender. Setelah sampel menjadi homogen, diambil 5 gram sampel yang telah dihomogenkan. Hal ini dilakukan sebanyak 3 kali sebagai replikasi.

3. Ekstraksi Sampel Sampel diberi aquades dan petroleum eter masing-masing sebanyak 15 ml. Pewarna polar akan larut dalam aquadest sedangkan pengotor lain akan larut dalam petroleum eter. Setelah itu sampel disaring menggunakan kertas saring untuk memisahkan antara pewarna dengan endapan yang tidak terhomogenkan, lalu dibilas dengan aquades hingga bersih. Setelah itu dimasukkan ke dalam corong pisah dan digojog kemudian fase yang larut dalam petroleum eter akan berada di atas sedangkan fase yang larut dalam aquadest akan berada di bawah. Diambil fase yang larut dalam petroleum eter dengan membuka tutup corong pisah dan ditampung dalam bekker gelas. Setelah itu fase yang larut dalam petroleum eter diekstraksi kembali dengan aquadest sebanyak 15 ml untuk mengambil pewarna yang mungkin masih tertinggal. Ekstraksi kembali dengan menggunakan aquadest dilakukan sebanyak 2 kali atau hingga tidak ada pewarna yang masih tertinggal di fase petroleum eter. Hasil dari fase larut petroleum eter

dibuang, sedangkan fase yang larut dalam aquadest digunakan untuk analisis selanjutnya. Apabila sampel yang diekstraksi terlalu encer dilakukan pemekatan.

4. Pembuatan Larutan Baku Tartrazine Baku tartrazin ditimbang sebanyak 50 mg, lalu dilarutkan dengan air dan dimasukkan ke dalam labu ukur 10mL, sehingga didapatkan larutan baku pertama dengan konsentrasi 5000 ppm. Dari larutan tersebut, diambil sebanyak 1mL, lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL, ditambahkan aquadest hingga batas, sehingga diperoleh larutan baku kedua dengan konsentrasi 500 ppm. Lakukan hal tersebut hingga diperoleh seri konsentrasi larutan baku 5000;500;50;5;dan 0,5 ppm.

5. Pembutan Larutan Baku Rhodamin Baku Rhodamin ditimbang sebanyak 50 mg, lalu dilarutkan dengan air dan dimasukkan ke dalam labu ukur 10mL, sehingga didapatkan larutan baku pertama dengan konsentrasi 5000 ppm. Dari larutan tersebut, diambil sebanyak 1mL, lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL, ditambahkan aquadest hingga batas, sehingga diperoleh larutan baku kedua dengan konsentrasi 500 ppm. Lakukan hal tersebut hingga diperoleh seri konsentrasi larutan baku 5000; 500; 50; 5;dan 0,5 ppm.

6. Analisis Kualitatif Sampel Sampel ditotolkan pada lempeng silika gel sebanyak 1L begitu juga dengan standar yang digunakan. Standar yang digunakan adalah rhodamin B dan tartrazine. Jarak penotolan 2 cm dari bawah ke atas dan jarak dengan penotolan berikutnya 2 cm. Lempeng dibiarkan mengering di udara terbuka kemudian dielusi didalam bejana yang telah dijenuhkan dengan eluen n-butanol:metil etil keton:NH4OH:H2O (5:3:1:1). setelah sampel terpisah, lempeng diambil dari dalam chamber dan dikeringkan di udara terbuka.

Lempeng KLT diamati bercaknya dan dihitung Rf-nya. Apabila bercak yang dihasilkan sampel dan standar memiliki warna dan Rf yang sama, maka kemungkinan besar sampel yang dianalisis mengandung rhodamin B dan tartrazine.

7. Analisis Semi-Kuantitaf Sampel Hasil dari pemisahan sampel menggunakan KLT dianalisis menggunakan densitometri. Lempeng KLT tersebut dimasukkan ke dalam TLC Scanner dengan menggunakan panjang gelombang 429 nm untuk analisis tartrazine, dan 590 nm untuk analisis rhodamin. Kemudian akan didapatkan kromatogram. Dari kromatogram tersebut dapat ditentukan AUC (Area Under Curve). Setelah itu dibandingkan antara AUC sampel dengan standar. Kemudian dihitung kadarnya.

Hasil dan pembahasan Tujuan percobaan kali ini adalah untuk mengetahui keberadaan dan kadar pewarna sintetik Rhodamine B dan Tartrazine dalam sampel ikan sardines kalengan merek XX dan YY. Rhodamine B merupakan salah satu pewarna sintetik yang dilarang keberadaannya dalam suatu produk makanan, sedangkan Tartrazine merupakan pewarna yang ditujukan untuk makanan namun hanya dalam batas tertentu yaitu dengan batas penggunaan 200 mg/kg produk pangan yang diproduksi. Rhodamin B berbahaya bagi tubuh, karena dapat menyebabkan kanker, keracunan, serta iritasi pada paru-paru, mata, hidung, dan tenggorokan. Sedangkan tartrazin dalam jumlah yang melebihi batas berbahaya bagi tubuh, karena dapat menyebabkan asma, urtikaria, rhinitis, dan hiperaktivitas anak. Oleh karena itu, pengujian ini penting untuk dilakukan agar diketahui keberadaan dan kadar dari kedua bahan tersebut dalam suatu sampel makanan. Langkah pertama yang harus dilakukan adalah mengidentifikasi sampel yang akan digunakan. Identifikasi dilakukan secara visual dan harus diperhatikan secara teliti, apakah sampel yang diperoleh benar-benar sesuai dengan sampel yang akan diuji dan masih dalam kondisi yang baik atau tidak. Identifikasi sampel ini dilakukan dengan mengamati sampel, label pada kemasan, tanggal kadaluwarsa, serta keutuhan kemasan. Identifikasi sampel ini sangat penting untuk dilakukan sebagai langkah awal dalam suatu analisis makanan agar jangan sampai sampel yang digunakan bermasalah atau bahkan salah. Setelah diidentifikasi, langkah berikutnya yaitu preparasi sampel. Sampel ditimbang terlebih dahulu berat bersihnya apakah kurang lebih sesuai dengan yang tertera pada kemasan atau tidak. Berdasarkan hasil penimbangan, bobot bersih dari sampel YY yang akan diuji adalah 152,5343 g sedangkan untuk sampel XX adalah 153,9950 g, namun pada kemasan tertera bobot bersihnya adalah 155 g. Sampel YY dan XX kemudian masing-masing diblender agar

homogen dan daging ikannya menjadi halus. Hasil sampel yang sudah diblender kemudian ditimbang 5 gram dan siap untuk diekstraksi Sampel YY dan XX diekstrasi dengan metode ekstraksi cair-cair. Ekstraksi cair-cair dilakukan dengan menambahkan pelarut polar dan nonpolar kedalam sampel. Rhodamine dan Tartrazine secara teoritis larut dalam air, oleh karena itu dalam ekstraksi cair-cair ini, aquades digunakan sebagai pelarut polar dan petroleum eter digunakan sebagai pelarut nonpolar. Dari ekstraksi cair-cair ini diharapkan lemak dan senyawa nonpolar lainnya yang terdapat dalam sampel dapat terlarut dalam petroleum eter dan apabila dalam sampel mengandung Tartrazine dan Rhodamin akan larut dalam aquades. Lemak dan senyawa nonpoar lainnya akan sangat mengganggu dalam proses elusi pada KLT oleh karena itu perlu dihilangkan. Sampel dicampur dengan aquades dan petroleum eter, kemudian campuran tersebut disaring menggunakan kertas Whatman. Setelah penyaringan pertama, perlu dilakukan pembilasan pada kertas saring untuk melarutkan pewarna yang mungkin saja masih tertinggal pada kertas saring tersebut. Pada saat percobaan dilakukan, baik sampel YY dan XX hanya dilakukan 1 kali pembilasan untuk masing-masing sampel, karena pada 1 kali pembilasan itu sudah tidak terdapat pewarna yang tertinggal. Hasil penyaringan yang diperoleh terdiri dari 2 lapisan. Lapisan yang berada di atas merupakan lapisan petroleum eter, sedangkan yang berada di bawah merupakan aquades. Campuran kemudian dipisahkan dengan menggunakan corong pisah. Bagian yang diambil dari hasil pemisahan tersebut adalah bagian yang terlarut dalam aquades karena pewarna Tartrazine dan Rhodamine B larut dalam aquades. Setelah dipisahkan, larutan tersebut dilihat apakah terlalu encer atau tidak, bila larutan terlalu encer maka harus dipekatkan supaya dapat terlihat dengan jelas elusinya. Larutan yang didapat pada percobaan ini sudah cukup pekat dan ketika dilakukan orientasi pengelusian, hasil elusinya terlihat jelas dan dapat dideteksi dengan sinar UV.

Langkah selanjutnya adalah menyiapkan larutan standar Tartrazine dan Rhodamine B yang berfungsi sebagai pembanding. Pembanding digunakan untuk mengetahui apakah sampel yang diuji benar-benar zat yang dimaksud atau

bukan. Digunakan lima konsentrasi larutan untuk masing-masing standar Tartrazine dan Rhodamine B. Pembuatan seri konsentrasi larutan standard ini juga nantinya akan digunakan sebagai kurva baku pada analisis kuantitatif, apabila dalam sampel positif mengandung Tartrazine dan Rhodamin B. Setelah dilakukan pembuatan larutan sampel dan standar, masing-masing larutan tersebut ditotolkan pada plat KLT. Untuk larutan standar terdapat 5 konsentrasi dan masing-masing sampel terdapat 3 replikasi. Volume totolan yang digunakan sebanyak 2 L. Digunakan alat Auto Sampler (Camag) untuk menotolkan sampel tersebut agar bercak yang dihasilkan berukuran kecil. Ukuran bercak kecil akan meghasilkan pemisahan yang optimal dan tidak berekor (tailing), namun apabila penotolan terlalu banyak akan menyebabkan resolusinya kurang baik dan dapat menghasilkan bercak yang berekor (tailing). Lempeng KLT yang digunakan seharusnya diaktifkan terlebih dahulu supaya pori-pori dari silika gel terbuka dan mempermudah proses elusi. Namun pada percobaan ini lempeng KLT tidak diaktifkan karena oven yang digunakan dipakai untuk banyak zat sehingga dikhawatirkan dapat mengkontaminasi lempeng silica gel. Tahap selanjutnya adalah mengembangkan sampel dan standar dalam bejana yang sudah dijenuhkan dengan uap fase gerak. Tujuan penjenuhan adalah agar di dalam bejana tercipta suasana yang penuh dengan uap fase gerak, sehingga elusi dapat berjalan dengan baik. Penjenuhan dilakukan dengan memasukkan kertas saring ke dalam bejana, lalu biarkan fase gerak membasahi seluruh kertas saring. Lempeng KLT yang sudah ditotolkan dengan standar dan sampel dimasukkan ke dalam bejana yang sudah jenuh tersebut. Tinggi tepi bagian bawah lempeng KLT pada percobaan adalah 2 cm, sedangkan jarak elusi adalah 10 cm. Pada saat akan mengelusi, yang harus diperhatikan adalah tinggi larutan fase gerak dalam bejana tidak boleh melebihi jarak tepi bawah lempeng KLT agar tidak terkena totolan

sampel. Apabila fase gerak mengenai totolan sampel, maka sampel dapat terlarut dalam fase gerak dan tidak akan terelusi. Selain itu dalam meletakkan Lempeng KLT harus berseberangan dengan kertas saring yang digunakan untuk penjenuhan, karena apabila diletakkan dibagian kertas saring, memungkinkan fase gerak yang ada di kertas saring merembet ke lempeng KLT yang digunakan. Pada percobaan ini, teknik pengembangan yang digunakan adalah ascending/menaik. Untuk mendeteksi bercak yang muncul pada plat KLT tidak diperlukan bantuan pereaksi semprot untuk memperjelas warna yang muncul dikarenakan sudah terlihat jelas pada saat dideteksi dengan sinar UV. Pereaksi semprot sebenarnya berfungsi untuk memperpanjang kromofor sehingga larutan menjadi lebih berwarna dan lebih mudah untuk dideteksi. Fase terbalik merupakan fase dimana fase diamnya lebih non polar daripada fase geraknya. Pada praktikum ini digunakan fase terbalik karena sampel cenderung bersifat polar, sehingga apabila digunakan fase normal maka afinitas sampel dengan fase diam akan lebih kuat akibatnya sampel tidak akan terpisah dengan sempurna, namun apabila digunakan fase terbalik, fase gerak dengan sampel memiliki kepolaran yang sama sehingga akan dapat terpisah dengan baik. Kromatografi lapis tipis dapat digunakan untuk uji kualitatif. Pada uji kualitatif, jika sampel memiliki Rf dan warna yang sama dengan standar, maka kemungkinan besar sampel mengandung senyawa yang sama dengan standar. Dari hasil yang didapatkan, sampel YY dan XX berwarna coklat muda, sedangkan standar Rhodamine B berwarna merah dan standar tartrazine berwarna kuning muda. Dilihat dari warnanya disimpulkan bahwa sampel tidak mengandung pewarna Rhodamine B dan Tartrazine. Selain analisis kualitatif secara manual, dilakukan pula analisis menggunakan densitometry. Densitometri merupakan salah satu detektor yang didasarkan pada indeks bias suatu senyawa. Kromatogram yang diperoleh dari hasil pengelusian tartrazine (Gambar 1) dan Rhodamin B (Gambar 2), Nampak bahwa Rf antara

standard dan sampel berbeda, bahkan pada sampel tidak menunjukkan adanya peak.

Gambar 1. Kromatogram standard Tartrazine sampel XX dan sampel YY

Berdasarkan hasil percobaan, didapatkan nilai Rf untuk 5 konsentrasi larutan standar Tartrazine adalah 0,12; 0,15; 0,15, sedangkan untuk larutan standard konsentrasi keempat dan kelima tidak didapatkan nilai Rf-nya karena konsentrasi terlalu kecil sehingga tidak terlihat. Untuk nilai Rf sampel YY yaitu 0,24; 0,33; 0,33 dan untuk nilai Rf sampel XX yaitu 0,32; 0,32; 0,3. Berdasarkan nilai Rf tersebut dapat disimpulkan bahwa sampel tidak mengandung pewarna Tartrazine.

Gambar 2. Kromatogram standard Rhodamine B sampel XX dan sampel YY

Sedangkan untuk 5 konsentrasi larutan standard Rhodamine B, didapatkan nilai Rf : 0,36; 0,35, sedangkan untuk larutan standard konsentrasi ketiga, keempat dan kelima tidak didapatkan nilai Rf-nya karena konsentrasi terlalu kecil sehingga tidak terlihat. Untuk nilai Rf sampel YY yaitu 0,23; 0,25; 0,25 dan untuk nilai Rf sampel XX yaitu 0,27; 0,28; 0,27. Berdasarkan nilai Rf tersebut dapat disimpulkan bahwa sampel tidak mengandung pewarna Rhodamine B. Dari nilai Rf yang diperoleh nampak bahwa proses elusi kurang maksimal. Hal ini disebabkan chamber yang digunakan tidak dapat tertutup rapat dan fase diam yang digunakan belum diaktivasi. Hasil percobaan pada analisis kualitatif menunjukkan bahwa sampel tidak mengandung bahan pewarna tartrazine dan rhodamin B, sehingga tidak dilakukan

analisis kuantitatif. Apabila dalam percobaan ini ditemukan keberadaan tartrazin dan rhodamin B, analisis semi kuantitatif dilakukan dengan bantuan alat densitometer sebagai detector, kemudian data yang diperoleh terolah dalam program WinCats, sehingga nantinya akan diperoleh Luas area tiap kurva yang terbentuk dari masing-masing bercak. Hasil AUC pada standard (Seri konsentrasi larutan standard) dicari persamaan linearnya, serta nilai linearitas yang didapat. Dari kurva baku tersebut juga dapat diketahui LOD dan LOQ masing-masing senyawa. Dari kurva baku nantinya juga dapat diketahui presisi dari data yang diperoleh. Hal-hal tersebut penting untuk diketahui terkait dengan validasi metode yang digunakan. Namun pada percobaan ini tidak didapatkan kurva baku

Tartrazine karena konsentrasi keempat dan kelima terlalu kecil sehingga AUC tidak terbaca. Kurva baku Rhodamine B juga tidak didapatkan karena konsentrasi ketiga, keempat, dan kelima terlalu kecil sehingga AUC tidak terbaca. Dikarenakan tidak ada kurva baku, maka tidak dapat ditentukan nilai dari SD dan CV. Sehingga berbagai parameter validasi metode tidak dapet diperoleh.

Kesimpulan 1. Pada sardines merek YY dan XX tidak terkandung pewarna rhodamin B dan tartrazin karena dari hasil Rf tidak didapatkan kesamaan antara Rf standar dan Rf sampel. 2. Pada sardines merek YY dan XX tidak diperoleh kadar pewarna rhodamin B dan tartrazine.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim a, 2007, http://www.chemnet.com/cas/id/81-88-0/Rhodamine-B.html, diakses pada tanggal 9 November 2011 Anonim b, 2007, http://www.chemnet.com/cas/my/1934-21-0/tartrazine.html, diakses pada tanggal 9 November 2011 Arisman, Dr. MB, M.Kes., 2009, Keracunan Makanan Buku Ajar Ilmu Gizi, 66, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta Cahanar, P. dan Irwan Suhanda, 2006, Makan Sehat Hidup Sehat, 186, 187, Kompas, Jakarta
Cairns, D., 2004, Intisari Kimia Farmasi, edisi 2, 31, 32, Jakarta, EGC

Cahyadi, Wisnu, 2006, Analisis dan Aspek Kesehatan Bahan Tambahan Pangan, 58, Bumi Aksara, Jakarta Hadiati, 2004, Kamus Ilmu Pengetahuan Alam, 223, Balai Pustaka, Jakarta ONeil, M. J., 2006, The Merck Index: An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals (Merck Index), Volume 2, Merck, Purnomowati, Ida, Diana H., Cahyo S., 2008, Aneka Kudapan Ikan, Kanisius, Yogyakarta
Sacher, R. A. dan Richard A. M., 2002, Tinjauan Klinis Hasil Pemeriksaan Laboratorium, 553, Jakarta, EGC

Surhone, Lambert M., Miriam T. T., Susan F. M., 2010, Rhodamine B, 84, VDM Verlag Dr. Mueller AG & Co. Kg., Jerman Watson, D. G., 2010, Analisis farmasi : Buku Ajar untuk Mahasiswa Farmasi dan Praktisi Kimia Farmasi, edisi 2, 367, 384, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta Winarno, 1995, Kimia Pangan dan Gizi, 86, 87, PT Gramedia Pustaka Utama, Jakarta