TP de Physiologie Animale :Hmolyse

Universit Montpellier II
Nom du professeur :

Anne 2002

Introduction
Les cellules des tres vivants sont le sige dchange incessant deau ou de substances dissoutes, ces changes se font grce la permabilit membranaire. Ces changes se font du milieu le moins concentr vers le plus concentr grce une force de traction appele osmose ou pression osmotique. Le but du TP dhmolyse est tudier le comportement dhmatie de rat en prsence de solution dosmolarit diffrentes ou des solutions de mme osmolarit mais de composants chimiques diffrents. Lintrt de ce TP est de comprendre les diffrents phnomnes observs lors des expriences et prciser certaines notions telles que lisoosmolarit, isotonicit dune solution et de rsistance globulaire.

Matriels et mthodes.
On veut tudier le comportement des hmaties de rat en prsence de solution dosmolarit diffrentes ou des solutions de mme osmolarit mais de composants chimiques diffrents, les solut utiliss sont initialement prsent dans le sang. En influenant les facteurs (soluts concentration et composition chimiques) nous avons tudi les phnomnes osmotiques quils peuvent engendrer. Prparation des solutions Solutions utiliss proviennent du stock (NaCl 12 , Glucose 5.5%, Ure, Glycrol et Srum Physiologique). On prpare alors des solutions de NaCl diffrentes concentrations avec une solution mre de 12. Solution de NaCl 9 = 6 ml de solution 12 + 2 ml deau distille Solution de NaCl 6 = 4 ml de solution 12 + 4 ml deau distille Solution de NaCl 3 = 2 ml de solution 12 + 6 ml deau distille Nous allons tudier les phnomnes osmotiques lis ces solutions. Ces manipulations vont permettre dtudier les phnomnes qui touchent les hmaties. Nous obtenons 11 tubes hmolyse correspondant chaque solution que nous voulons tudier Schmas de prparation de la manipulation : Dilution des solutions NaCl :
Srum NaCl 3 physiologique NaCl 6 NaCl 9 NaCl 12 Glucose Ure Glycrol

6 ml 2 gouttes suspension dhmatie

4 ml
Eau distille

2 ml

0.5 ml

Tube :

Principe des observations

Aspect macroscopique 1 : Est bas sur la diffrence daspect avec le tube 1 correspondant au tube tmoin. Si la suspension dans le tube hmolyse est de couleur rouge translucide on dit que le sang est laqu et quil y a eu hmolyse. Si la suspension dans le tube hmolyse est trouble il ny a pas eu dhmolyse. Aspect microscopique : Est bas sur lobservation cellulaire (taille, forme et proportion) Cellule gonfle ou clate : hmolyse Cellule crnele ou fltrie : plasmolyse Cellule ronde biconcave : hmatie normale. Aspect macroscopique 2 : Est bas sur le taux dhmolyse, cest dire si le phnomne dhmolyse est : Totale, la suspension dans le tube hmolyse est de couleur rouge due la prsence des molcules dhmoglobines libres par les hmaties qui ont t dtruite avec un culot blanc (correspond aux membranes des hmaties). Partielle :le surnageant prsent dans le tube hmolyse est de couleur orang Avec un culot rouge(hmaties non dtruites). Absent : surnageant est incolore avec la prsence dun culot rouge(correspond aux hmaties non dtruites). Ces diffrentes observations macroscopiques et microscopiques permettent daffiner les rsultats obtenus par le calcul et dexpliquer les phnomnes qui ont touch les hmaties.

RESULTATS.
Les rsultats des observations macro et microscopiques se trouve dans le tableau rcapitulatif. Calculs des concentrations osmolaires ou osmolarits des solutions du tube 2,3,4,5,6. Exemple de calcul : Solution de NaCl Tube n2 : Solution de NaCl 3 correspond 3 g pour 1000 ml deau dou CNaCl = 3 g/l Concentration massique en NaCl CNaCl = 3 g/l Dou la concentration molaire[NaCl]= CNaCl / MNaCl = 3/58.5 = 0.051 mol/l ou 51 mmol/l NaCl se dissocie en 2 il suffit donc de multiplier la concentration molaire par 2 pour obtenir losmolarit de la solution de NaCl 3. La concentration osmolaire = nombre de particules dissocies * la concentration molaire initiale ,pour le NaCl nombre de particule dissoci est 2
H2O

Solution de glucose 5.5 %. Tube n6 : Glucose 5.5% correspond 55g/l Concentration massique du glucose 5.5 % : CGlucose= 55g/l D ou la concentration molaire [Glucose ]= CGlucose/ MGlucose = 55/180 = 0.305mo/l le Glucose ne se dissocie pas dans leau alors la concentration du glucose est gale losmolarit de la solution de glucose 5.5% cest dire 0.305osmol/l ou 305 mosmol/l. Tube n 7 et 8 : Solution dUre et de Glycrol. Concentration osmolaire est la mme pour la solution de Glycrol , dUre et de NaCl 9. Concentration osmolaire de la solution de NaCl 9 =CnaCl 9/MNaCl*2=9*2/58.5=0.308 osmol/L Concentration osmolaire de NaCl 9=Concentration osmolaire de lure LUre ne se dissocie pas dans leau donc la concentration osmolaire = la concentration molaire de lure [Ure]=Cure/Mure alors Cure=[Ure]*Mure=0.308*62.02=18.5 g/l Mme mthode pour le calcul de la concentration massique du glycrol .

Tableau rcapitulatif des calculs :

Tubes Proportion du Concentration solut dans la massique des solution solutions en g/l de 3 3 6 9 12 5.5 % _ _ 6 9 12 55 18.5 28.4 Masse molaire des soluts en g/mol 58.5 58.5 58.5 58.5 180 60.06 92.09 Concentration molaire des solutions en mmol/l 51 102.5 154 205 305 308 308 Osmolarit des solutions en mosmol/l 102 205 308 410 305 308 308

2 Solution NaCl 3 3 Solution de NaCl 6 4 Solution de NaCl 9 5 Solution de NaCl 12 6 Solution de Glucose 5.5% 7 Solution dUre 8 Solution de Glycrol

Connaissant la loi de Vant Hoff := RTC = pression osmotique R=constante des gaz parfaits T= temprature absolue en Kelvin C= concentration osmolaire de la solution en Osmol/l Nous calculons la pression osmotique du plasma 37C la concentration osmolaire du plasma est la mme que la concentration osmolaire de la solution de NaCl 9. =R*T*C=0.082*310*0.308=7.8 atm

Principes osmotiques :

C2
2 Milieu extrieur

C1

Milieu intrieur : Hmatie

Osmocit : Si C1 > C2 : le milieu extrieur (C2) est hypoosmotique par rapport au milieu intrieur (C1) Si C1 < C2 : le milieu extrieur est hyperosmotique par rapport au milieu intrieur Si C1 = C2 : le milieu extrieur est isoosmotique par rapport au milieu intrieur Tonicit : Sil y a entre deau (2) dans lhmatie (C1) la solution est dite hypotonique pour les hmaties Sil y a sortie deau (1) dans lhmatie la solution est dite hypertonique pour les hmaties Sil y a quilibre (entres les changes deau)la solution est dite isotonique pour les hmaties

Tableau rcapitulatif des rsultats :

Tubes Solutions Observations
Macro 1 Microscopique Macro 2

Osmolarit Osmoticit des solutions en mosmol/l

Tonicit

Srum physiologique

Trouble

NaCl 3

Sang laqu Trouble

Hmaties de tailles normales et lgrements crneles Fantomes dhmaties

Absence dHmolyse

Isoosmotique

Isotonique

Hmolyse totale

102

Hypoosmotique

Hypotonique

NaCl 6

Hmaties de Hmolyse grandes partielle tailles Hmaties de tailles normales et lgrements crnels Hmatie fortement crnel Absence dHmolyse

205

Hypoosmotique

Hypotonique

NaCl 9

Trouble

308

Isoosmotique

Isotonique

NaCl 12

Trouble

Absence dhmolyse

410

Hyperosmotique Hypertoniqu e

Glucose 5.5%

Trouble

Hmaties normales Fantomes dhmaties

Absence dhmolyse Hmolyse totale

305

Isoosmotique

Isotonique

Ure

Sang laqu

308

Isoosmotique

Hypotonique

Glycrol

Sang laqu

Fantomes dhmaties

Hmolyse totale

308

Isoosmotique

Hypotonique

Analyses et Interprtations des rsultats

Nous savons que losmolarit du plasma est quivalent celui du milieu intrieur des hmaties est celui dune solution de NaCl 9 . Concentration osmolaire de la solution de NaCl de 9 est de 308 mosmol/l. Donc losmolarit de lhmatie du rat est de 308 mosmol/l. Tube n1 : La solution dans le tube correspond au milieu extrieur reconstitu artificiellement des hmaties du rat, les aspects macroscopiques (1 suspension trouble et 2 surnageant claire avec culot rouge) et microscopiques ( hmaties normales) permettent de dire quil ny a pas eu d hmolyse. La tonicit du srum physiologique est isotonique cest dire lchange deau est la mme entre la solution (milieu extrieur) et les hmaties (milieu intrieur). Conclusion :ni Hmolyse , ni Plasmolyse Tube n2 : C1>C2

La solution prsente dans le tube 2 est une solution de NaCl 3 , les observations et la comparaison avec le tube tmoin, montrent que les hmaties ont t hmolys, aspect macroscopique1 le sang est laqu, les cellules sont clates. Il y a donc eu un change deau de part et dautres de la membrane des hmaties. Losmolarit de la solution de NaCl 3 (C2) < losmolarit prsente dans la cellule (C1), alors la concentration en sel du milieu extrieur est hypoosmotique par rapport concentration de sel prsent dans les hmaties.

Schma des mouvements deau :

Solution NaCl 3 C2 <

Hmatie C1

Les flches reprsentent les mouvements deau proportionnellement leurs tailles.

Lentre massive deau dans le solut dans le solut entrane le phnomne dhmolyse et lclatement de la cellule entrane la libration des molcules dhmoglobine dans le milieu extrieur expliquant ainsi laspect macroscopique 1(sang laqu),la prsence de cellules clates pour lobservation au microscope et lhmolyse totale pour laspect macroscopique 2. Conclusion :Hmolyse totale Tube n 3 : C1>C2 Losmolarit de la solution est gale losmolarit dans la cellule , le milieu extrieur est hypoosmotique par rapport au milieu intrieur de lhmatie. Il devrait y avoir le phnomne dhmolyse, or ce nest pas le cas , les aspects macroscopiques et microscopique montre le contraire, mais la forme des cellules et la comparaison avec le tube n1 montre quil y a eu hmolyse mais que celle ci est partielle. La membrane de cellule est capable de rsister cette pression osmotique exerce par la solution de NaCl 6 . Le milieu extrieur est donc hypotonique entranant une lgre entre deau laspect rond des hmaties. Schma des mouvements deau : Sloution de NaCl 6 C2 < Hmatie C1

Conclusion :Absence dHmolyse Tube n4 : C1= C2

Losmolarit de la solution est gale losmolarit dans les hmaties, le milieu est isoosmotique par rapport au milieu intrieur des hmaties. Le milieu extrieur est donc isotonique, les changes deau sont le mme de part et dautres de la membrane donc le phnomne dhmolyse est absentes, ces rsultats sont confirms par les observations microscopiques et macroscopiques, les hmaties sont normales, le sang est laqu et le taux dhmolyse est absent. Le tube n4 peut correspondre au tube 1 cest dire au milieu habituel de lhmatie. Schma des mouvements deau : Solution deNaCl 9 Hmatie C2 = C1

Conclusion: Ni hmolyse , ni Plasmolyse Tube n5 : C2 > C1 Losmolarit de la solution est suprieure losmolarit dans les hmaties, le milieu extrieur est donc hyperosmotique par rapport au milieu intrieur des hmaties. Le milieu extrieur est donc hypertonique entrainant la sortie de leau des hmaties et donc le phnomne de plasmolyse. Le rsultat est confirm par lobservation microscopique, les cellules sont fltries cellules bords crnels, cela montre que les cellules ont perdu de leau. Les observations macroscopiques confirment quil ny a pas eu dhmolyse, la suspension est trouble pour laspect macroscopique 1 et laspect macroscopique 2 surnageant claire et culot rouge prouve qu il y a absence d hmolyse. Cette concentration en NaCl 12 entrane une plasmolyse , la menbrane des hmaties sont alors capables de rsister la pression osmotique exerc par la solution de NaCl 12. Schma des mouvements deau : Solution de NaCl 12 Hmatie C2 > C1

Conclusion : Plasmolyse Tube n6 : C1=C2 Losmolarit de solution de glucose est la mme que celle des cellules. Donc la solution de glucose est isoosmotique par rapport au milieu intrieur des hmaties. Et donc que la solution de glucose 5.5% est isotonique, alors lchange deau est le mme de part et dautres de la membrane .La solution de glucose nentrane donc aucun phnomne ni dhmolyse ni de plasmolyse cette absence de phnomne est confirme par les aspects macroscopiques( sang trouble et prsence dun surnageant claire et dun culot rouge aprs centrifugation ) et microscopique les hmaties sont normales. Conclusion :Ni Hmolyse , Ni Plasmolyse

Tube n7 : LOsmolarit de la solution dure est identique au milieu intrieur de la cellule, et le milieu est isoosmotique par rapport au milieu intrieur des cellules. La solution devrait tre isotonique or ce nest pas le cas daprs les observations macroscopiques (sang laqu, et la suspension aprs centrifugation est de couleur rouge avec un culot blanc) et microscopiques ( cellules clates) prouvent quil y a eu hmolyse. Lure traversant la membrane elle ninflue donc pas sur la pression osmotique extrieur. La concentration en Ure va alors squilibrer entre les 2 compartiments (Equivalence entre milieu intrieur et extrieur ). En consquence le milieu intrieur de lhmatie est plus concentr que le milieu extrieur (car la solution dure pntre dans lhmatie) est donc provoque une hmatolise. Schma des mouvements deau : Solution dure Hmaties C1 > C2

Conclusion: Tube n8 : Solution de glycrol mme interprtation que pour lUre. Losmolarit du plasma correspond losmolarit dune solution de NaCl 9 (0.308mosmol/l ). La pression osmotique exerce par le plasma 37 C est nettement spcieuse la pression atmosphrique, les hmaties du rat sont alors capables de rsister une pression 8 fois suprieures celle de latmosphre terrestre.

Conclusion
Ces rsultats exprimentaux nous ont permis de dterminer losmolarit des hmaties de rat, en effet des taux de glucose et de NaCl respectivement de 5.5 % et 9 sont tout fait correcte pour une prsence dhmaties de formes normale et oprationnelles. On remarque que lure et le glycrol ont provoquer une hmolyse, du au fait que ces substances peuvent traverser la membrane contrairement au NaCl et au glucose. Mais on peut penser que dans certains taux dure et de glycrole les hmaties ne seront pas hmolyses si il y a une prsence correcte de NaCl ou de glucose dans le substrat permettant de maintenir lquilibre osmotique. Nous pouvons aussi remarquer que les hmaties de rat sont capables de rsister une forte pression osmotique (8 fois suprieures celle de latmosphre terrestre).