Tinjauan Pustaka a.

Rhodamin B Rhodamin B adalah salah satu pewarna sintetik yang tidak boleh dipergunaan untuk makanan, selain itu pewarna lainnya yang dilarang adalah Metanil Yellow Rhodamin B memiliki rumus molekul C28H31N2O3Cl, dengan berat molekul sebesar 479.000. Rhodamin B berbentuk kristal hijau atau serbuk-unggu kemerah-merahan, sangat mudah larut dalam air yang akan menghasilkan warna merah kebiru-biruan dan berflourensi kuat. Selain mudah larut dalam air juga larut dalam alkohol, HCl dan NaOH. Rhodamin B ini biasanya dipakai dalam pewarnaan kertas, di dalam laboratorium digunakan sebagai pereaksi untuk identifikasi Pb, Bi, Co, Au, Mg, dan Th. Rhodamin B merupakan zat warna golongan xanthenes dyes. Rhodamin adalah bahan kimia yang digunakan untuk pewarna merah pada industri tekstil dan plastik. Makanan yang diberi zat pewarna ini biasanya berwarna lebih terang dan memiliki rasa agak pahit. Rhodamin B adalah pewarna sintetis yang berasal dari metanlinilat dan dipanel alanin yang berbentuk serbuk kristal berwarna kehijauan, berwarna merah keunguan dalam bentuk terlarut pada konsentrasi tinggi dan berwarna merah terang pada konsentrasi rendah. Rhodamin B sering diselahgunakan untuk pewarna pangan (kerupuk,makanan ringan,es-es dan minuman yang sering dijual di sekolahan) serta kosmetik dengan tujuan menarik perhatian konsumen. Rhodamine B (C28N31N2O3Cl) adalah bahan kimia sebagai pewarna dasar untuk berbagai kegunaan, semula zat ini digunakan untuk kegiatan histologi dan sekarang berkembang untuk berbagai keperluan yang berhubungan dengan sifatnya yang berfluorensi dalam sinar matahari (coms, Hj, 1969).

Rhodamin termasuk senyawa atau molekul yang memberikan warna akibat adanya gugus kromofor, dimana gugus kromofor tersebut yaitu quinoid. Kuantitas warna yang ditimbulkan rhodamin B sangat tajam, hal ini disebabakan oleh adanya dua gugus auksokrom, dimana gugus auksokrom tersebut adalah dimetil ammin. Proses pembuatan zat warna sintetik biasanya melalui perlakuan pemberian asam sulfat dan asam nitrat yang sering kali terkontaminasi oleh logam berat seperti arsen, atau logam berat lain yang bersifat racun. Pada pembuatan zat pewarna organik sebelum mencapai produk akhir harus melalui suatu senyawa antara dulu, yang kadang-kadang berbahaya. Sering kali dalam proses reaksi tersebut terbentuk senyawa baru yang berbahaya yang lebih tertinggal sebagai residu dalam bahan pewarna tersebut. Rhodamin B Termasuk golaongan xanthenes dyes :

Terlihat bahwa semua jenis rhodamin mengandung gugus auksokrom, ini mengakibatkan intensitas warna dari rhodamin sangat tajam bila dibandingkan dengan jenis pewarna lain. Pewarna makanan merupakan bahan tambahan pangan yang dapat memperbaiki tampilan makanan. Secara garis besar, pewarna dibedakan menjadi dua, yaitu pewarna alami dan sintetis. Selain itu, khusus untuk makanan dikenal pewarna khusus makanan (food grade). Ironisnya, di Indonesia terutama industri kecil dan industri rumah tangga makanan masih banyak menggunakan pewarna nonmakanan-pewarna untuk pembuatan cat dan tekstil (Edi Setyo Mudjajanto,2006,dalam Kompas Minggu,15 Januari 2006, Jakarta). Dampak Rhodamin terhadap tubuh Rhodamine 6G menyebabkan kerusakan sel yang parah dan rhodamine B secara signifikan mengurangi jumlah sel. Rhodamine 123 tidak memiliki efek yang berarti, sedangkan. Lebih jauh lagi, rhodamine B mengurangi jumlah sel vaskuler endothelial pada pembuluh darah sapi dan sel otot polos pada pembuluh darah hewan berkulit duri setelah 72 jam dalam kultur. Sehingga tidak berlebihan jika studi ini menyimpulkan bahwa rhodamine B menghambat proses proliferasi lipo fibroblast pada manusia. b. Deteksi Zat Pewarna Teknik Analisa Canggih Di laboratorium yang maju, analisis pewarna makanan sudah secara rutin dilakukan, dengan berbagai metoda, teknik dan cara. Sebagian besar dari cara analisa tersebut masih berdasarkan suatu prinsip kromatografi atau pun menggunakan alat spektrophotometer. Cara tersebut digunakan untuk mendeteksi zat pewarna tersebut secara teliti, karena itu minimal diperlukan fasilitas yang cukup canggih serta dituntut tersedianya berbagai pelarut organik, yang biasanya cukup mahal harganya. Di samping itu teknik tersebut juga memerlukan tenaga terampil yang profesional. Grafik tersebut di atas merupakan molar extinction coefficient Rhodamin B yang dilarutkan dalam etanol. Molar extinction coefficient Rhodamin B adalah 106,000 M- 1cm-1 pada panjang gelombang 542,75 nm. Babu & Indushekhar S (1990) dari NIN Hyderabad India, telah melaporkan hasil penelitiannya, bahwa deteksi zat pewarna sintetik dapat dilakukan secara sederhana dengan menggunakan peralatan yang sederhana, seperti gelas, air dan kertas saring. Sehingga tidak diperlukan adanya pelarut ataupun memerlukan tersedianya peralatan khusus. Metoda ini dapat dikerjakan di rumah maupun di lapangan. Keistimewaan atau keuntungan penting dari metoda tersebut adalah karena cara analisisnya tidak membutuhkan ketersediaan zat pewarna-pewarna standar apapun.

Ide dari metoda sederhana ini didasarkan pada kemampuan zat pewarna tekstil yang berbeda dengan zat pewarna makanan sintetis, di antaranya karena daya kelarutannya dalam air yang berbeda. Zat pewarna tekstil seperti misalnya Rhodamin B (merah), Methanil Yellow (kuning), dan Malachite Green (hijau), bersifat tidak mudah larut dalam air. Pada Tabel 1, dapat dilihat daftar beberapa pewarna sintetik yang mudah larut dan tidak mudah larut dalam air. Sedangkan prinsip kerjanya adalah kromatograph kertas dengan pelarut air (PAM, destilata, atau air sumur). Setelah zat pewarna diteteskan di ujung kertas rembesan (elusi), air dari bawah akan mampu menyeret zat-zat pewrna yang larut dalam air (zat pewarn makanan) lebih jauh dibandingkan dengan zat pewarna tekstil. Kromatografi Kromatografi adalah suatu nama yang diberikan untuk teknik pemisahan tertentu. Pada dasarnya semua cara kromatografi menggunakan dua fase tetap ( stationary) dan yang lain fase bergerak (mobile); pemisahan-pemisahan tergantung pada gerakan relative dari dua fase ini (Sastrohamidjojo,1991). Kromatografi kertas Prinsip kerjanya adalah kromatography kertas dengan pelarut air (PAM, destilata, atau air sumur). Setelah zat pewarna diteteskan di ujung kertas rembesan (elusi), air dari bawah akan mampu menyeret zat-zat pewrna yang larut dalam air (zat pewarn makanan) lebih jauh dibandingkan dengan zat pewarna tekstil. Kromatrogafi lapis tipis Diantara berbagai jenis teknik kromatrografi, kromatografi lapis tipis (KLT) adalah yang paling cocok untukk analisis obat di laboratorium farmasi (Stahl,1985). Kromatografi Lapis Tipis dapat digunakan untuk memisahkan berbagai senyawa seperti ion-ion organik, kompleks senyawasenyawa organik dengan anorganik, dan senyawa-senyawa organik baik yang terdapat di alam dan senyawa-senyawa organik sintetik. KLT merupakan kromatografi adsorbs dan adsorben bertindak sebagai fase stasioner. Empat macam adsorbs dan adsorben bertindak sebagai fase stasioner. Empat macam adsorben yang umum dipakai ialah silica gel ( asam silikat ), alumina ( aluminum oxydae ) , kieselguhr ( diatomeus earth ) dan selulosa. Dari keempat jenis adsorben tersebut yang paling bnayak dipakai adalah silica gel karena hampir semua zat dapat dipisahkan oleh jenis adsorban ini. Sifat sifat umum dari penyerapan-penyerap untuk kromatografi lapis tipis ini adalah mirip dengan sifat-sifat penyerap untuk kromatografi kolom. Dua sifat yang penting dari penyerap adalah besar partikel dan homogenitasnya, karena adhesi terhadap penyokong sangat bergantung pada mereka. Fase gerak ialah medium angkut dan terdiri atas satu atau beberapa pelarut. Ia bergerak dalam di dalam fase diam, yaitu suatu lapisan berpori , karena ada gaya kapiler. Jika fase gerak dan fase diam telah dipilih dengan tepat, bercak cuplikan awal dipisahkan menjadi sederet bercak, masing-masing bercak diharapkan merupakan komponen tunggal dari campuran. Perbedaan migrasi merupakan dasar pemisahan kromatografi, tanpa perbedaan dalam kecepatan migrasi dari senyawa,tidak mungkin terjadi pemisahan. c. Terasi

Terasi adalah bumbu masak yang dibuat dari ikan dan atau udang yang di fermentasikan, berbentuk seperti pasta dan berwarna hitam-coklat, kadang ditambahi bahan pewarna sehingga menjadi kemerahan. Terasi memiliki bau yang tajam dan biasanya digunakan untuk membuat sambal terasi, tapi juga ditemukan dalam berbagai resep tradisional Indonesia. Beberapa produsen menambahkan rhodamin B pada terasi untuk memberi warna merah segar pada terasinya.

Metodelogi P e m e rik s aan Ku alitatif Kurva Serapan Metode spektofotometri sinar tampak berdasarkan prosedur dari BBPOM 2006.6 Masingmasing sampel ditimbang dan pewarna dari masing-masing zat makanan diekstraksi dengan teknik standar menggunakan larutan NaOH lOVo, dietll eter, NaOH 0, 5 %, as am klorida 0, 1 N. B aku pembanding dan sampel diukur dengan menggunakan spektofotometer sinar tampak pada panjang gelombang 450- 750 nm.6 Kurva serapan dari bahan baku dibandingkan dengan kurva serapan dari ekstrak sampel. Kromatografi Lapis Tipis Metode Kromatografi Lapis Tipis (KIIT) dilakukan berdasarkan prosedur dari Ditjen POM (2000).8 Sampel yang digunakanmasing-masing 30 gram. Baku pembanding dibuat dengan cara melarutkan 50 mg rhodamin B dengan 100 mL akuades. Campuran sampel dan baku pembanding dibuat dengan cara melarutkan 30 mg dari masing-masing sampe dalam 50 mL akuades, ditambahkan 50 mg dari rhodamin B dalam masing-masing larutan sampel, dicampur homogen, ditam-bahkan asam asetat 6Vo,kemtdian dibuat perlakuan yang sama dengan pembuatan larutan sampel.s plat KLT berukuran 20 x2O cm diaktifkan dengan cara dipanaskan di dalam oven pada suhu 100"C selama 30 menit. Masingmasing larutan sampel, baku pembanding, campuran sampel dan baku pembanding, ditotolkan pada plat dengan menggunakan pipa kapiler p ada jarck2 cmdari bagian bawah plat sertajarak antar toda2 cm kemudian dibiarkan beberapa saat hingga mengering. Plat KLT yang telah mengandung cuplikan dimasukkan ke dalart chamber yang terlebih dahulu telah dijenuhkan dengan fase gerak yaitu n-butanol, asam asetat glasial, dan akuades (40:IO:24), dibiarkan fasa bergerak naik sampai hampir mendekati batas atas plat. plat KLT lalu diangkat dan dipisah serta dibiarkan kering di udara. Noda yang terjadi diamati secara visual kemudian dihitung nilai Rf-nya di bawah sinar UV. Jika secara visual noda berwarna merah jambu dan di bawah sinar UV 254 nm berfluoresensi kuning dengan Rf yang sama, hal tersebut menunjukkan adanya rhodamin B.8 Penetapan Kadar Kurva Absorbansi dan Kalibrasi larutan Baku Rhodamin B Larutan induk baku I (LIB I) dan larutan induk baku II (LIB II dengan konsentrasi 50 mcg/ml) dibuat sesuai prosedur BPPOM 2006. Larutan induk baku II diencerkan sehinggamemilikikonsentras2i mcg/ml dand iukur serapan maksimum pada panjang gelombang 450-j5O nm. Sebagai blanko digunakan HCI 0,1N. Kurva kalibrasi dibuat denganlarutan baku (konsentrasi 1; 1,5;2;2,5; dan 3 mcg/rnl),

Penetuan kadar rhodamin B di dalam Sampel Sampel yang sudah ditimbang diekstraksi dengan prosedur standar sehingga menjadi larutan yang dapat diukur serapannya. Serapan larutan diukur pada panjang gelombang 557 nm. Larutan HCI 0,lN digunakan sebagai blanko.6 Rumus Perhitungan kadar rhodamin B adalah sebagai berikut:

K=
K = Kadar total rhodamin B dalam sampel (mcg/g) X = kadar rhodamin B sesudah pengenceran (mcg/g) V=Volumesampel(mL) Fp = Falctor Pengenceran BS = Berat sampel

Uji Validasi Metode Analisis Validasi dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis yang dilakukan akurat, spesifik, dapat di ulang dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis. Uji validasi yang digunakan yaitu uji akurasi dengan parameter uji perolehan kembali, batas deteksi, batas kuantitasi.e Uji perolehan kembali dilakukan dngan menambahkan larutan baku Rhodamin B konsentrasi 50 mcg/ml sebanyak 1 ml kedalam sampelkemudian dianalisis denganperlakuan yang sama pada sampel. Perolehan kembali dapat dihitung menurut rumus sebasai berikut: % Perolehan Kembali = Keterangan: Cp = konsentrasi sampel yang diperoleh setelah penambahan laruta baku (mcg/ml) Cn = konsentrasi sampel sebelum panambahan baku (mcg/ml) = konsentrasi larutan baku yang ditambahkan (mcg/ml) x 100 %