Enumerasi adalah teknik perhitungan jumlah mikroba dalam suatu media tanpa mengidentifikasikan jenis mikroba (bakteri, jamur,

yeast), yang bertujuan untuk menentukan jumlah sel dari suatu kultur bakteri secara kuantitatif (Cappucino & Sherman, 1983). Penetapan jumlah bakteri dilakukan dengan menghitung jumlah sel bakteri yang mampu membentuk koloni di dalam media biakan atau membentuk suspensi dalam larutan biak (Schlegel & Schmidt, 1994). Analisis kuantitatif mikrobiologi pada bahan pangan ini penting dilakukan untuk mengetahui mutu bahan pangan dan menghitung proses pengawetan yang akan diterapkan pada bahan pangan tersebut (Fardiaz, 1992).

Ada beberapa macam cara untuk mengukur jumlah sel, antara lain dengan hitungan cawan (plate count), hitungan mikroskopik langsung (direct microscopic count) atau MPN (Most Probable Number) (Fardiaz, 1992). Penetapan jumlah bakteri dapat dilakukan dengan menghitung jumlah sel bakteri yang mampu membentuk koloni di dalam media biakan atau membentuk suspensi dalam larutan biak (Schlegel dan Schmidt, 1994).

Ada beberapa cara penghitungan dalam enumerasi, antara lain : perhitungan mikroskopis secara langsung perhitungan massa sel atau unsur-unsur sel pengukuran turbidimetrik untuk peningkatan massa sel metode perhitungan secara tak langsung pada cawan yang meliputi : pour plates; sampel ditaruh pada cawan petri kemudian dituangi media agar cair dan dicampur. spread plates; sampel diinkubasi pada media agar padat kemudian sampel diratakan dengan drig glass. thin layer plates; sampel dimasukkan pada tabung berisi media cair, kemudian dituang pada cawan petri berisi agar padat. layered plates; cara ini sama dengan thin layer, tetapi tambahkan 1 lapis agar steril (Capuccino & Sherman, 1983).

Keuntungan enumerasi secara langsung adalah cara penghitungan yang cepat dan diperoleh informasi tambahan tentang ukuran dan bentuk mikroba yang sedang dihitung dan jumlah sel yang diperoleh meliputi sel yang hidup dan sel yang mati. Akan tetapi enumerasi secara langsung juga memiliki kelemahan yaitu sel yang mati tidak dapat dibedakan dengan sel yang

hidup. Koloni sel yang bergerombol terkadang dapat menyulitkan dalam mengklasifikasikan jenis koloni (Schlegel & Schmidt, 1994).

Enumerasi dapat dilakukan dengan tiga teknik yaitu : 1. Direct Platting Merupakan teknik perhitungan jumlah mikroorganisme secara langsung dengan bantuan coloni counter atau alat lain. Ada dua macam yaitu secara langsung dengan alat bacterial counting chamber maupun dengan metode breed smears atau Lepowitch-weber untuk menghitung jumlah mikroba dalam susu. Atau bahkan bisa pula memanfaatkan sifat sel yang bukan konduktor sehingga tidak dapat mengalirkan listrik yang kemudian akan meningkatkan tegangan yang dicatat oleh recorder serta dapat menunjukkan jumlah total sel, dan metode ini disebut metode electronic cell chamber. 2. Dillution Platting Ada dua cara yang dapat ditempuh yaitu dengan menghitung komponen kimia di dalam sel seperti DNA atau dengan menghitung oksigen atau karbondioksida yang diserap atau dihasilkan selama respirasi atau fermentasi. Cara kedua yaitu dengan menggunakan perhitungan jumlah mikroorganisme secara tak langsung karena tidak bisa mengetahui jumlah mikroorganisme namun hanya bisa mengetahui OD atau Optical Density dengan bantuan spektrofotometer. Langkah-langkah yang harus ditempuh adalah sebagai berikut : Bahan makanan atau sumber mikroorganisme lain ditimbang sebanyak 5 gram dan diencerkan di dalam erlenmeyer dengan aquades sampai volumenya 50 ml (pengenceran 10-1). Mikroorganisme hasil pengenceran tersebut dimasukkan dalam tabung reaksi yang berisi 9 ml aquades (pengenceran 10-1). Mikroorganisme yang telah diencerkan tersebut dimasukkan ke dalam cuvet dan dimasukkan ke dalam spektrofotometer dimana di dalamnya akan disinari dan sinar-sinar tersebut akan dibiaskan oleh kumpulan mikroorganisme di dalam cuvet sehingga dengan komputasi tertentu di dalam spektrofotometer dapat diketahui OD. Kedua teknik enumerasi di atas memiliki kelemahan dan keunggulan masing-masing, maka seringkali dikombinasikan melalui pembuatan tabel yang berisi daftar OD dari perhitungan teknik dillution platting dan jumlah mikroorganisme dari hasil perhitungan teknik direct platting; kemudian tabel tersebut disusun menjadi suatu grafik dan dapat diketahui suatu model matematika yang mewakili grafik tersebut. Dengan demikian bila dilakukan lagi

perhitungan semua species yang sama dengan medium yang sama, hanya tinggal meggunakan model matematika tersebut untuk mengetahui jumlah mikroorganisme bila diketahui OD atau sebaliknya. 3. Perhitungan Jumlah sel hidup Berbeda dengan cara sebelumnya yang dapat untuk menghitung sel mati dan sel hidup, cara ini khusus ingin diketahui jumlah sel hidupnya saja. Jumlah sel hidup khususnya sangat perlu diketahui karena dapat mempengaruhi kualitas produk dan tata guna sumber daya atau dengan kata lain penggunaan sumber daya harus memperhatikan jumlah mikroba di dalam sumber daya tersebut, seperti misalnya sumber daya air dan tanah. Langkah-langkah yang harus ditempuh untuk mengkondisikan pertumbuhan mikroorganisme agar tumbuh tidak bergerombol atau tiap koloni harus saling terpisah, yaitu : Bahan makanan atau sumber mikroorganisme lain ditimbang sebanyak 5 gram dan diencerkan di dalam erlenmeyer dengan aquades sampai volumenya 50 ml (pengenceran 10-1). Mikroorganisme hasil pengenceran tersebut dimasukkan ke dalam petridish dan diinkubasi lalu dihitung dengan coloni counter. Bila masih banyak koloni yang menggerombol, maka mikroorganisme yang sudah diencerkan tadi perlu diencerkan lagi sampai pengenceran 10n, sampai jumlah koloni dapat dihitung sebanyak 30 sampai 300 koloni dengan memakai coloni counter. Setelah diketahui jumlah pengenceran adalah antara 30 sampai 300 koloni maka jumlah mikroorganisme dapat diketahui sebanyak jumlah koloni dikalikan satu per 10n, dimana 10n adalah faktor pengenceran (Trihendrokesowo, 1989).

Prinsip dari metode hitungan cawan adalah bila sel mikrobia yang masih hidup ditumbuhkan pada medium agar, maka mikrobia tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dan dihitung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop. Metode ini merupakan cara yang paling sensitif untuk menentukan jumlah mikrobia, dengan alasan : Hanya sel mikrobia hidup yang dapat dihitung Beberapa mikrobia dapat dihitung sekaligus

Dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikrobia, karena koloni yang terbentuk mungkin berasal dari mikrobia yang mempunyai penampakkan spesifik (Waluyo, 2004).

Kelemahan metode hitungan cawan adalah hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel yang sebenarnya karena beberapa sel yang berdekatan mungkin membentuk 1 koloni, medium dan kondisi inkubasi yang berbeda mungkin menghasilkan nilai yang berbeda, jasad renik yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada medium padat dan membentuk koloni yang kompak dan jelas, tidak menyebar, serta memerlukan persiapan dan waktu inkubasi yang cukup lama sehingga pertumbuhan koloni dapat dihitung. Sedangkan kelebihan metode hitungan cawan adalah hanya sel hidup yang dihitung, kita dapat langsung menghitung jumlah koloni yang terdapat dalam cawan petridish secara langsung dengan mata kita, beberapa jenis jasad renik dapat dihitung sekaligus, dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi jasad renik karena koloni yang terbentuk mungkin berasal dari suatu jasad renik yang mempunyai penampakan pertumbuhan spesifik (Fardiaz, 1992).

Metode hitungan cawan didasarkan pada setiap sel dapat hidup akan berkembang menjadi satu koloni. Jadi jumlah koloni yang muncul pada cawan merupakan suatu indeks bagi jumlah organisme yang dapat hidup yang terkandung dalam sampel (Hadioetomo, 1985). Teknik yang harus dikuasai adalah mengencerkan sampel dan mencawankan hasil pengenceran tersebut. Setelah inkubasi, jumlah koloni cawan diamati. Cawan yang dipilih untuk penghitungan koloni adalah yang mengandung 30-300 koloni. Jumlah organisme yang terdapat pada sampel asal ditentukan dengan mengalikan jumlah koloni yang terbentuk dengan faktor pengenceran pada cawan yang bersangkutan (Hadioetomo, 1993). Jika bakteri ditumbuhkan pada media dan lingkungan yang sesuai maka kelompok bakteri ini akan menghasilkan satu koloni bakteri (Lay, 1994).

Perhitungan dengan metode hitungan cawan adalah jumlah minimum mikroorganisme. Hal ini disebabkan koloni yang tumbuh pada lempengan agar merupakan gambaran mikroorganisme yang dapat tumbuh dan berbiak dalam media dan suhu inkubasi tertentu. Koloni yang tumbuh tidak selalu berasal dari satu sel mikroorganisme, dimana beberapa mikroba tertentu cenderung untuk berkelompok. Bila ditumbuhkan pada media dan lingkungan yang sesuai kelompok bakteri ini hanya akan menghasilkan 1 koloni bakteri. Sebaiknya hanya lempengan yang mengandung 30 300 koloni saja yang digunakan dalam perhitungan. Lempengan dengan jumlah koloni yang tinggi (> 300 koloni) sulit untuk dihitung sehingga kemungkinan kesalahan perhitungan sangat besar. Pengenceran sampel membantu untuk memperoleh perhitungan jumlah yang benar, namun pengenceran yang

terlalu tinggi akan menghasilkan lempengan agar dengan jumlah koloni yang rendah (<30 koloni) (Lay, 1994). Pada metode hitungan cawan ini perlu diperhatikan saat pengenceran kultur, sebab jika pengencerannya dengan menggunakan aquades yang tidak steril dapat menyebabkan terjadinya kontaminasi pada media dari mikrobia yang terdapat dalam aquades yang tidak steril (Hadioetomo, 1993 ).

Cara pemupukan dalam metode hitungan cawan dapat dibedakan atas dua cara yaitu metode tuang (Pour plate) dan metode permukaan (spread / surface plate). Pada prinsipnya dalam metode tuang, sejumlah sampel dari pengenceran yang dikehendaki dimasukkan ke dalam cawan petri, kemudian ditambah agar cair steril yang sudah didinginkan (47-500C) dan digoyangkan supaya sampelnya menyebar secara merata. Sedangkan pada pemupukan dengan metode permukaan, terlebih dahulu dibuat agar cawan kemudian sampel yang telah diencerkan dipipet pada permukaan agar tersebut. Kemudian diratakan dengan batang gelas melengkung yang steril (Fardiaz, 1992).

Metode pour plate dilakukan dengan menginokulasikan biakan ke dalam tabung reaksi yang berisi media agar cair yang sudah agak dingin, lalu diaduk dengan vortex hingga tercampur rata, kemudian campuran tersebut dituang ke dalam cawan petri steril, diratakan, dan dibiarkan memadat. Sel-sel mikrobia akan tumbuh menjadi koloni yang terpisah dalam medium padat, sehingga pada akhirnya dapat dihitung jumlah koloni yang terbentuk. Sedangkan metode spread plate, media agar cair dituangkan dalam cawan petri steril lalu dibiarkan sampai memadat. Kemudian dengan menggunakan ose dilakukan penginokulasian goresan di atas permukaan agar. Setelah diinkubasi, pada akhir goresan akan tertinggal bakteri individual yang terpisah dengan yang lainnya, kemudian jumlah koloni bakteri dapat dihitung (Volk & Wheeler, 1993).

Jumlah koloni dalam sampel dapat dihitung sebagai berikut : Koloni per ml atau per gram = jumlah koloni per cawan x 2004).
1 (Waluyo, faktor pengenceran

Untuk melaporkan hasil analisa mikrobiologi dengan cara hitungan cawan digunakan suatu standar yang disebut Standard Plate Counts (SPC) sebagai berikut :

Cawan yang dipilih dan dihitung adalah yang mengandung jumlah koloni antara 30 sampai 300 Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan satu kumpulan koloni yang besar di mana jumlah koloninya diragukan dapat dihitung sebagai satu koloni

Satu deretan rantai koloni yang terlihat sebagai suatu garis tebal dihitung sebagai satu koloni (Fardiaz, 1992).

Data yang dilaporkan sebagai Standard Plate Counts (SPC) harus mengikuti peraturanperaturan sebagai berikut : 1. Hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari dua angka, yaitu angka pertama dan kedua. Jika angka ketiga sama dengan atu lebih besar dari 5, maka harus dibulatkan satu angka lebih tinggi pada angka yang kedua. 2. Jika semua pengenceran yang dibuat untuk pemupukan menghasilkan kurang dari 30 koloni pada cawan petri (<30), hanya jumlah koloni pada pengenceran yang terendah yang dihitung. Hasilnya dilaporkan sebagai kurang dari 30 dikalikan dengan besarnya pengenceran, tetapi jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan dalam tanda kurung. 3. Jika semua pengenceran yang dibuat untuk pemupukan menghasilkan lebih dari 300 koloni pada cawan petri (>300), hanya jumlah koloni pada pengenceran yang tertinggi yang dihitung, misalnya dengan cara menghitung jumlahnya pada bagian cawan petri, kemudian hasilnya dikalikan 4. Hasilnya dilaporkan sebagai lebih dari 300 dikalikan dengan besarnya pengenceran, tetapi jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan dalam tanda kurung. 4. Jika cawan dari dua tingkat pengenceran menghasilkan koloni dengan jumlah antara 30 dan 300, dan perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah dari kedua pengenceran tersebut lebih kecil atau sama dengan 2, tentukan rata-rata dari kedua nilai tersebut dengan memperhitungkan pengencerannya. Jika perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah lebih besar dari 2, yang dilaporkan hanya hasil yang terkecil. 5. Jika digunakan dua cawan petri (duplo) per pengenceran, data yang diambil harus dari kedua cawan tersebut, tidak boleh diambil salah satu.

Berbeda dengan metode hitungan cawan di mana digunakan medium padat, dalam metode MPN digunakan medium cair di dalam tabung reaksi, di mana perhitungan dilakukan berdasarkan jumlah tabung yang positif yaitu yang ditumbuhi jasad renik setelah inkubasi

pada waktu dan suhu tertentu. Pengamatan tabung yang positif dapat dilihat dengan mengamati timbulnya kekeruhan, atau terbentuknya gas di dalam tabung kecil (tabung Durham) yang diletakkan pada posisi terbalik, yaitu untuk jasad renik pembentuk gas. Dalam metode MPN, dari setiap pengenceran dimasukkan 1 ml masing-masing ke dalam tabung yang berisi medium, di mana untuk setiap kali pengenceran digunakan tiga atau lima seri tabung. Setelah inkubasi, dihitung jumlah tabung yang positif dan kombinasi tabung positif tersebut dicocokkan dengan tabel MPN, dan nilai MPN sampel dihitung dengan rumus: MPN sampel (Fardiaz, 1992). = Nilai MPN dari tabel x
1 pengenceran tabung tengah

Metode MPN biasanya digunakan untuk menghitung jumlah jasad renik di dalam contoh yang berbentuk cair. Meskipun dapat pula digunakan untuk contoh yang berbentuk padat dengan terlebih dahulu membuat suspensi 1:10 dari contoh tersebut. Grup jasad renik yang dapat dihitung bervariasi tergantung dari medium yang digunakan untuk pertumbuhan. Selain itu, metode MPN juga dapat digunakan untuk menghitung jumlah jasad renik tertentu yang terdapat diantara jasad renik lainnya (Waluyo, 2004).

Sebagai petunjuk pertama bahwa bakteri adalah pembentuk gas. Terbukti dengan produksi gas ketika suatu labu ditanami dengan E.coli dan kemudian diinkubasi pada 370C. Maka E.coli akan membentuk gas hydrogen dan karbondioksida dalam perbandingan kurang lebih 1:1. Penetapan jumlah bakteri dilakukan dengan menghitung jumlah sel bakteri yang mampu membentuk koloni di dalam media biakan atau membentuk suspensi dalam larutan biak (Schlegel dan Schmidt, 1994).