BAB I PENDAHULUAN

I.1. Latar Belakang Kromatografi lapis tipis merupakan metode yang digunakan untuk memisahkan substansi campuran menjadi komponen-

komponennya dengan menggunakan prinsip adsorpsi dan partisi. Kroamtografi lapis tipis dikembangkan oleh Izmailoff dan Schraiber pada tahun 1983. Dimana KLT merupakan bentuk dari kromatografi planar, selain kromatografi kertas dan elektroforesis. Fase diam yang digunakan berupa lapisan yang seragam (Uniform) pada bidang datar dan didukung oleh lempeng kaca, pelat aluminium atau pelat plastik. Sedangkan fase gerak yang digunakan sebagai pelarut pengembang akan bergerak sepanjang fase diam karena pengaruh kapiler pada pengembangan secara menaik (ascending) atau karena pengaruh gravitasi pada pengembangan secara menurun (discending).

Adapun variasi dalam prosedur pengembangan KLT serta adanya fase diam yang telah dikembangkan yang dimana bertujuan untuk meningkatkan resolusi, sensitifitas, kecepatan, reprodusibelitas, dan selektifitasnya, salah satunya yaitu KLT 2 arah atau dikenal dengan nama KLT 2 dimensi.

KLT 2 arah atau 2 dimensi ini bertujuan untuk meningkatkan resolusi sampel ketika komponen-komponen solute mempunyai

karakteristik kimia yang hamper sama, karenanya nilai Rf juga hamper sama sebagaimana dalam asam-asam amino. Selain itu, 2 sistem fase gerak yang sangat berbeda dapat digunakan secara beurutan pada suatu campuran tertentu sehingga memungkinkan untuk melakukan pemisahan analit yang mempunyai tingkat polaritas yang berbeda.

Multi eluen merupakan metode pemisahan yang memiliki prinsip yang sama dengan KLT 2 dimensi yaitu adsorbsi dan partisi, Pada metode multi eluen jumlah totolan berbeda yaitu berupa cuplikan yang berkesinambungan dan menghasilkan hasil elusi yang berupa pita.

I.2 Maksud dan Tujuan Percobaan

I.2.1

Maksud Percobaan

Mengetahui dan memahami teknik untuk menguji kemurnian hasil isolasi komponen kimia dari bahan alam, yaitu sampel laut dengan menggunakan metode kromatografi lapis tipis dua dimensi dan

kromatografi lapis tipis multi eluen.

I.2.2

Tujuan Percobaan

Melakukan teknik pengujian kemurnian hasil isolasi komponen kimia dari sampel laut Aaptos sp terhadap fraksi C2 dengan menggunakan metode kromatografi lapis tipis dua dimensi dan kromatografi lapis tipis multi eluen.

I.3 Prinsip Percobaan

1.Prinsip dari multi eluen yaitu adsorpsi

dan partisi dengan

menggunakan lempeng GF 254 sebagai fase diam dengan beberapa perbandingan eluen pada tingkat kepolaran tertentu untuk mempertegas adanya senyawa tunggal yang terdapat pada sampel Aaptos sp.

2. Prinsip dari KLT dua dimensi adalah adsorpsi dan partisi dengan menggunakan lempeng GF 254 sebagai fase diam dan perbandingan eluen pada profil KLT dimana akan memperpanjang lintasan noda (Rf) dengan menunjukkan senyawa tunggal yang terdapat pada sampel Aaptos sp.

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

II.1 Uraian Sampel II.1.1 Klasifikasi Domain Kingdom Filum Kelas Ordo Famili Genus Spesies : Eukariota : Animalia : Porifera : Demospongiae : Hadromerida : Tethyidae : Aaptos : Aaptos sp.

II.1.2

Kandungan Senyawa

Secara umum pada spons ditemukan kelompok senyawa pada fraksi non polar seperti senyawa terpenoid, senyawa steroid dan asam lemak.

II.1.3 Morfologi Jenis spons ini mempunyai rangka yang menyebar dengan 3 ukuran kategori seperti berbentuk kecil, berdinding tebal, atau tidak mikrosklera. Spons ini seperti kerang yang besar dengan permukaan

alasnya seperti akar yang memiliki tonjolan, reproduksinya aseksual dan teksturnya halus dan licin.

II.1.4 Kegunaan Menurut Souza et al (2007), senyawa 4-metilaaptamin yang diisolasi dari spons Aaptos aaptos dapat menghambat infeksi Herpes Simplex Virus-1 (HSV-1). Nakamura et al. (1987) menemukan 2 senyawa baru golongan alkaloid dari spons Aaptos aaptos yang berasal dari perairan Okinawa yaitu dimetilaaptamin dan dimetil(oksi) aaptamin yang memiliki aktivitas sitotoksik dan antimikrobial. Laporan lain menyebutkan bahwa isoaaptamin dari Aaptos memiliki aktivitas untuk mencegah infeksi Staphylococcus aureus dengan menghambat enzim sortase A (SrtA) (Jang et al., 2007). II.2. Teori Umum KLT dua dimensi dan multi eluen memiliki prinsip yang sama yaitu adsorbsi dan partisi, tetapi yang membedakan pada KLT dua dimensi didasarkan pada proses elusi yang bertujuan untuk memperpanjang jarak lintasan noda untuk memperoleh senyawa tunggal sedangkan pada multi eluen jumlah totolannya yang berbeda yaitu berupa cuplikan yang berkesinambungan dan menghasilkan hasil elusi berupa pita.(2) KLT dua dimensi merupakan metode pemisahan yang pada umunya cukup sering digunakan. Namun kebanyakan pemisahan dengan metode dua dimensi memakan waktu seharian untuk melakukannya dan hanya

satu sampel per lempeng yang bisa dianalisa dalam satu waktu. Hasilnya adalah suatu kromatogram seperti cetakan jari, mengidentifikasi noda dengan membandingkannya dengan standar sangat memakan waktu dan harus dilakukan terpisah pada kondisi eluen yang sama. Dalam hal ini untuk mendapatkan resolusi yang baik, penting untuk memilih dua campuran pelarut yang berbeda, meskipun dengan kekuatan pelarut yang sama.(1) KLT dua dimensi ini bertujuan untuk meningkatkan resolusi sampel ketika komponen-komponen solute mempunyai karakteristik kimia yang hampir sama, karenanya nilai Rf juga hampir sama sebagaimana dalam asam-asam amino. Selain itu, sistem dua fase gerak yang sangat berbeda dapat digunakan secara berurutan pada suatu campuran sehingga memungkinkan untuk melakukan pemisahan analit yang mempunyai tingkat polaritas.(1) Elusi dengan metode dua dimensi diidealkan dengan menggunakan sistem fase gerak yang sama untuk dua arah. Pada elusi dengan metode seperti ini sampel ditotolkan lalu dikembangkan dengan satu sistem fase gerak sehingga campuran terpisah menurut jalur yang sejajar dengan salah satu sisi. Lempeng diangkat, dikeringkan dan diputar 90C dan diletakkan kedalam chamber yang berisi fase gerak yang kedua sehingga bercak yang terpisah pada pengembangan pertama terletak dibagian bawah sepanjang lempeng lalu dikromatografi lagi. Komponen yang terpisah dapat terdapat dimana saja dalam lempeng.(1)

Mekanisme KLT dua dimensi Uji kemurnian Kristal juga dilakukan dengan menggunakan beberapa variasi eluen yang sesuai. Penampakan bercak tunggal menandakan bahwa golongan senyawa dari Kristal yang didapat merupakan golongan komponen kimia yang tunggal. (3) Multi eluen merupakan teknik pemisahan dengan penggunaan eluen atau fase gerak yang berbeda yang memungkinkan terjadinya pemisahan analit dengan berdasarkan pada tingkat polaritas yang berbeda-beda.(1) Kromatografi lapis tipis multi eluen dilakukan terhadap isolat yang mengkristal, dengan tujuan mengetahui apakah Kristal yang diperoleh merupakan senyawa tunggal atau bukan. Eluen yang biasa digunakan untuk kromatografi lapis tipis multi eluen adalah Heksan : etil (4:1), Kloroform : etil (2:1) dan kloroform : aseton (2:1). (7)

Pemisahan komponen suatu senyawa yang dipisahkan dengan kromatografi lapis tipis tergantung pada jenis pelarut, zat penyerap dengan sifat daya serap masing-masing komponen. Komponen yang

terlarut

akan

terbawa

oleh

fase

diam

(penyerap)

dengan

membandingkannya dengan standar sangat memakan waktu dan harus dilakukan terpisah pada kondisi eluen yang sama. Dalam hal ini untuk mendapatkan resolusi yang baik, penting untuk memilih dua campuran pelarut yang berbeda, meskipun dengan kekuatan pelarut yang sama (1).

Jarak yang ditempuh senyawa terlarut Rf = Jarak yang ditempuh pelarut Jarak antara jalannya pelarut bersifat relatif. Oleh karena itu, diperlukan suatu perhitungan tertentu untuk memastikan spot yang terbentuk memiliki jarak yang sama walaupun ukuran jarak plat nya berbeda. Nilai perhitungan tersebut adalah nilai Rf, nilai ini digunakan sebagai nilai perbandingan relatif antar sampel. Nilai Rf juga menyatakan derajat retensi suatu komponen dalam fase diam sehingga nilai Rf sering juga disebut faktor retensi (5)

Semakin besar nilai Rf dari sampel maka semakin besar pula jarak bergeraknya senyawa tersebut pada plat kromatografi lapis tipis. Saat membandingkan dua sampel yang berbeda di bawah kondisi kromatografi yang sama, nilai Rf akan besar bila senyawa tersebut kurang polar dan berinteraksi dengan adsorbent polar dari plat kromatografi lapis tipis. Nilai Rf dapat dijadikan bukti dalam mengidentifikasikan senyawa. Bila identifikasi nilai Rf memiliki nilai yang sama maka senyawa tersebut dapat

dikatakan memiliki karakteristik yang sama atau mirip. Sedangkan, bila nilai Rfnya berbeda, senyawa tersebut dapat dikatakan merupakan senyawa yang berbeda. (6) Sebagai contoh, jika komponen berwarna merah bergerak 3,5 cm dari garis awal sementara pelarut berjarak 5,0 cm, sehingga nilai Rf untuk komponen berwarna merah menjadi :

Jarak yang ditempuh fase gerak

B

Garis depan Jarak yang ditempuh solut (A)

(B)
A

Garis awal penotolan Sampel yang ditotol

Jarak yang ditempuh solute (A) Rf = Jarak yang ditempuh fase gerak (B) 3,5 Rf = 5,0 = 0,7 cm

Tabel 6. Nilai Konstanta dielektrik dan parameter kelarutan Hildebrand

pelarut alkaloid gadung (Mandal dkk, 2007 ; Kang dkk, 2001)

Pelarut Air Metanol Etanol 2-propanol Aseton Kloroform Metil Eter Dietil Eter Benzen Petroleum eter

Parameter Kelarutan Hildebrand (Mpa 1/2) 48 29,7 26,1 23,8 19,7 18,7 18,6 15,4 18,6 15,8

Konstanta dielektrik 78,3 32,6 24,3 19,9 20,7 4,81 5 4,3 2,3 4,3

BAB III METODE KERJA

III.1. Alat dan Bahan III.1.1. Alat Adapun alat-alat yang digunakan antara lain, botol semprot, chamber, cawan porselin, lempeng ukuran 10 x 10 cm, gegep, gelas ukur, gunting, oven, penggaris, pensil, pipa kapiler, pipet tetes, tabung

sentrifuge, alat sentrifuge (magnetic stirrer), tabung reaksi, lampu UV 254 dan 366 nm, dan vial. III.1.2. Bahan Bahan-bahan yang digunakan antara lain, aluminium foil, etil asetat, H2SO4 10 %, heksan, kertas label, kertas saring, kloroform, lempeng KLT, metanol, sampel laut Cliona vastifika, silika kasar.

III.2. Cara Kerja 1. Multi Eluen Disiapkan alat dan bahan Dari hasil kerukan KLTP direndam dengan metanol dan kloroform PA selama 5 menit, kemudian disentrifuge selama 15 menit. Dari hasil sentrifuge dipindahkan kedalam vial dan diuapkan Dilarutkan kembali dengan kloroform (1 vial) setelah menguapkan Siapkan 3 lempeng yang telah diaktifkan

Hasil sentrifuge ditotolkan pada lempeng Disiapkan perbandingan eluen dari non polar hingga polar Setelah dielusi dengan tiga eluen yang berbeda, dilihat

penampakan noda pada lampu UV 254 nm dan 366 nm 2. KLT Dua dimensi Disiapkan alat dan bahan Ditotolkan isolate pada salah satu sisi lempeng dengan ukuran 20 x 20 atau 10 x 10. Masukkan kedalam chamber yang telah dijenuhkan dengan eluen pertama. Biarkan lempeng terelusi sempurna kemudian angkat dan keringkan. Putar lempeng 90C kemudian masukkan kembali ke dalam chamber yang berisi eluen kedua. Biarkan lempeng terelusi sempurna kemudian angkat dan keringkan. Amati noda yang muncul dengan sinar UV 254/366 nm dan H2SO4.

BAB IV HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

IV.1. Hasil Pengamatan

IV.2. Pembahasan Kromatografi dua dimensi dan multi eluen merupakan metode pemisahan dengan prinsip yang sama yaitu adsorbsi dan partisi, tetapi yang membedakan pada KLT dua dimensi didasarkan pada proses elusi yang bertujuan untuk memperpanjang jarak lintasan noda untuk memperoleh senyawa tunggal sedangkan pada multi eluen jumlah totolannya yang berbeda yaitu berupa cuplikan yang berkesinambungan dan menghasilkan hasil elusi berupa pita. Pada praktikum dilakukan proses dua dimensi dengan menggunakan sampel dari hasil kerokan KLTP. Mula-mula hasil kerokan dari lempeng KLTP direndam dengan metanol dan kloroform PA dengan perbandingan 1 : 1 selama 5 menit, setelah itu disentrifuge selama 15 menit dan hasil dari sentrifuge ditampung dalam vial dan diuapkan. Setelah disentrifus dengan

menggunakan pelarut metanol, hasil sentrifius kemudian dipisahkan dan ditampung dalam vial kemudian diuapkan. Untuk pengerjaan multi eluen, ekstrak yang telah disentrifius dilarutkan dengan kloroform. Digunakan kloroform karena pelarut tersebut baik untuk penotolan pada lempeng sebab memenuhi syarat pelarut yang bisa digunakan untuk melarutkan ekstrak dan mudah menguap. Setelah ekstrak dilarutkan dengan kloroform totol pada lempeng yang telah disiapkan dengan menggunakan perbandingan eluen yang berbeda dari perbandingan eluen yang non polar hingga perbandingan eluen polar,

namun perbedaan tingkat kepolaran hanya sedikit antara satu dengan yang lainnya .

Digunakan tiga eluen yang perbedaan tingkat kepolarannya berbeda sedikit ini agar bisa dilihat pergerakan noda atau hasil dari elusinya, apakah noda yang ingin dibuktikan tunggal atau tidak bisa dilihat kenaikannya sedikit demi sedikit sehingga jelas hasilnya, Karena itu dipilih perbandingan eluen non polar ke polar. Eluen yang dipilih tidak boleh memiliki tingkat kepolaran yang jauh apa lagi kalau eluen kedua atau ketiga melebihi kepolaran yang digunakan pada KLTP. Eluen-eluen tersebut tidak boleh memiliki kepolaran yang lebih tinggi dari KLTP, harus berdekatan sehingga noda pun terlihat jelas. Setelah terelusi dengan menggunakan ketiga eluen dari non polar hingga polar, dilihat

penampakan nodanya pada UV 254 dan 366, noda yang telah ditotol berada ditengah.

Untuk KLT dua dimensi, disiapkan alat dan bahannya, dilarutkan ekstrak dengan kloroform, lalu ditotolkan pada lempeng yang sudah diaktifkan dibuat perbandingan eluen. Kemudian dielusi hingga batas atas, setelah mencapai batas atas keluarkan dan keringkan. Setelah itu putar 90 dan masukkan kembali lempeng kedalam chamber dengan

menggunakan perbandingan eluen kedua, setelah mencapai batas atas keluarkan dan keringkan. Lihat noda yang tampak pada UV 254 dan 366.

Fungsi dari diputarnya 90 agar pita pemisahan dari hasil elusi pertama terletak pada bagian bawah lempeng dengan tujuan agar pada saat elusi yang kedua diperoleh pemisahan pita dengan arah yang berbeda dari pemisahan pertama. Fungsi lain dari diputarnya 90 agar hasil elusi yang pertama menjadi titik awal pengelusian untuk yang kedua. Jika pada pengamatan menunjukkan dari kedua kali proses elusi yang dilakukan terdapat satu bercak tunggal, maka dapat dikatakan bahwa bercak tersebut merupakan senyawa tunggal.

Pada dasarnya sentrifuge dilakukan untuk memisahkan senyawa yang terkandung dalam ekstrak, sentrifuge juga dilakukan untuk memisahkan senyawa-senyawa dari bahan-bahan pencamar yang

terdapat dalam sampel yang dapat mempengaruhi hasil elusi.

Untuk tahap pemurnian seperti yang telah diketahui digunakan pelarut metanol PA dan kloroform PA karena kedua pelarut ini merupakan pelarut yang murni bebas dari pengotor. Untuk menentukan senyawa tunggal pada metode dua dimensi harus menggunakan pelarut dengan kemurnian tinggi dan bebas dari pengotor yang dapat mempengaruhi hasil elusi, dan kedua pelarut ini lebih sering digunakan untuk penelitian.

BAB V PENUTUP

V.1. Kesimpulan Penggunaan kromatografi lapis tipis multi eluen dan kromatografi lapis tipis dua dimensi digunakan untuk pemisahan beberapa senyawa dengan karakteristik kimia dan nilai Rf yang hampir sama dengan pemisahan analit berdasarkan perbedaan polaritas masing-masing.

V.2. Saran

Alat dan bahan dilengkapkan

DAFTAR PUSTAKA 1. Ibnu Gholib Gandjar. Abdul Rahman.2008. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar : Yogyakarta. 2. Thin-Layer Chromatography. E-book. 3. isjd.pdii.lipi.go.id/admin/jurnal/91094854.pdf/ diakses 24 november 2011 4. rgmaisyah.files.wordpress.com/2009/10/jurnal KLT-fito.pdf/diakses 10 november 2009 5. Feist P. 2010. TLC - Retention Factor (Rf). [terhubung berkala] http://orgchem.colorado.edu/hndbksupport/TLC/TLCrf.html 2010]. 6. Lipsy P. 2010. Thin Layer Chromatography Characterization of the Active Ingredients in Excedrin and Anacin. USA: Department of Chemistry and Chemical Biology, Stevens Institute of Technology. 7. Jurnal penelitian isolasi dan identifikasi komponen kimia, pdf. Diakses maret 2008. [15 Mei