2.

PREPARACION DE MATERIAL BOTNICO PARA SU ESTUDIO ANATMICO Y MORFOLGICO

OBJETIVOS: 1.2.3.Preparar material vegetal para su observacin al microscopio ptico. Conocer los instrumentos y los mtodos empleados para el anlisis de estructuras vegetales. Aprender los mtodos y las tcnicas de procesamiento del material vegetal para realizar observaciones al microscopio ptico, entre ellas: preservacin, fijacin, corte, coloracin y algunas tcnicas especiales.

CONTENIDO: Preparacin de material vegetal. Preservacin. Tratamiento de material vegetal para observacin al microscopio ptico: fijacin, corte, maceracin, coloracin y montaje. Algunas tcnicas particulares. INTRODUCCIN: El estudio anatmico y morfolgico del material vegetal requiere de su conservacin en buen estado para su posterior anlisis en el laboratorio. Se deben conservar las estructuras internas y externas de manera que sufran las menores alteraciones posibles. El mtodo a seguir depende de los estudios a realizar. La observacin de la estructura externa puede hacerse a simple vista, con lupas de mano o con microscopios estereoscpicos; para la observacin de la estructura interna se utiliza el microscopio compuesto. Para estudiar la estructura externa el material debe ser preservado, y la forma ms corriente de hacerlo es secndolo. Por ejemplo, las muestras botnicas destinadas al herbario, se preservan mediante secado en estufas.

Figura 2a. Procedimiento resumido para tomar muestras de herbario (imagen cortesa de Stephen Tillett, modificada).

Cuando se va a estudiar la estructura interna se requieren cortes del material, los cuales posteriormente pueden ser coloreados o teidos. La preparacin de los cortes se podr hacer de forma permanente o semipermanente. Se deben realizar registros de las observaciones bien sea mediante fotos o dibujos. En principio, con el material vegetal se pueden realizar cortes a mano de material fresco, sin que hayan recibido ningn tratamiento previo, para ser observados al microscopio de luz; sin embargo, a medida que se requieran ms detalles estructurales se deben utilizar tcnicas y aparatos cada vez ms complicados para la preparacin de las muestras. Las clulas vegetales son estructuras tridimensionales, pero en los cortes no pueden observarse los tres planos a la vez. Los cortes del material se hacen en varios planos, as: se denomina plano longitudinal, al plano paralelo al eje longitudinal del rgano que se corta y a su vez puede ser radial o tangencial, dependiendo de si pasa por el centro del rgano o lateralmente. El plano perpendicular al eje longitudinal del rgano se denomina transverso. En relacin a las divisiones celulares, aquellas que ocurren paralelas a la cara tangencial de la clula, se denominan periclinales y dan origen a filas radiales de clulas como en el corcho. Aquellas divisiones perpendiculares a la cara tangencial, se denominan anticlinales y originan un aumento de clulas en sentido tangencial. En un corte transversal de un rgano las divisiones periclinales se observan paralelas a la superficie del rgano, mientras que las anticlinales se observan perpendiculares a dicha superficie. PRESERVACIN DE MATERIAL VEGETAL: La preservacin permite conservar las estructuras externas e internas. Los mtodos ms comnmente utilizados son: la preservacin en hielo, la preservacin de las muestras envueltas en papel hmedo y colocadas en bolsas plsticas, y el secado. De esta manera se pueden transportar las muestras hasta el laboratorio. Por secado se pueden mantener: maderas, semillas, frutos secos, material para herbario, hongos y algas macroscpicos. TRATAMIENTO DE MATERIAL PARA MICROSCOPIO COMPUESTO: 1.- FIJACIN: La fijacin tiene como objeto matar las clulas lo ms rpidamente posible para producir el mnimo de alteraciones en las estructura. Para la fijacin del material a fijar, dependiendo de su tamao, de los estudios que se quieran realizar y del fijador, se coloca completo o cortado en fragmentos dentro del fijador, guardando una relacin de 10:1, fijador: material.

Existen diferente tipos de fijadores, de los cuales los ms comnmente utilizados para las plantas superiores son el alcohol 70% y el FAA, que es una mezcla de 90 ml de alcohol 70%, 5 ml de cido actico y 5 ml de formol al 4%. Para las algas se utiliza como fijador una mezcla de agua de mar y formol al 5 %; para los hongos se utiliza una solucin acuosa de glicerina al 10% a la que se le aaden unas gotas de fenol. El tiempo de fijacin depende del material y del fijador, aunque, por lo general, se recomienda un mnimo de 24 horas. El uso de material de herbario para estudios anatmicos amerita su rehidratacin, para que recupere su forma y turgidez. La rehidratacin puede lograrse calentando el material en agua o utilizando una serie de alcoholes en concentraciones descendentes, esto es, desde alcohol 100% hasta agua. 2.- CORTES: Los cortes de material fresco o fijado pueden ser hechos a mano o con la ayuda de un instrumento especial denominado micrtomo. Si se usa material fijado hay que lavarlo previamente para eliminar el fijador y pasarlo a alcohol al 50% donde debe ser mantenido. Si el material fijado no tiene suficiente consistencia, debe ser incluido dentro de algn material auxiliar rgido que facilite hacer los cortes. Este material auxiliar puede ser: anime, parafina o resinas epxicas, dependiendo del mtodo y los objetivos del estudio realizar. Las inclusiones en parafina o resinas requieren de procesos laboriosos. Cuando se necesitan cortes rpidos, a mano o con micrtomo, de materiales fijados o sin fijar, el anime resulta un material de inclusin o soporte muy til. Debido a las caractersticas del material vegetal, si se quiere estudiar solamente los tipos de tejidos, se pueden preparar los denominados cortes esquelticos, en los que se preservan solamente las estructuras de las paredes y se destruyen los contenidos celulares. Para ello, una vez realizados los cortes, se transfieren a una solucin de cloro comercial o leja durante 10-15 minutos y posteriormente se lavan para eliminar el cloro. 3.- MACERADOS: Para estudiar las clulas completas se recurre a los mtodos de maceracin que disuelven las lminas que mantiene unidad las clulas y las dejan ms o menos libres. Para ello se utilizan soluciones de enzimas degradativas o cidos minerales fuertes en solucin. 4.- COLORACIN: Para la buena observacin del material se requiere teirlo o colorearlo. Los colorantes utilizados son muy variados y pueden ser preparados en solucin acuosa o alcohlica, y empleados como colorantes simples o como mezclas de colorantes. La coloracin obtenida puede ser monocromtica, cuando se tie todo de un solo color, o metacromtica, cuando empleado un solo colorante, los tejidos se tien de diferentes colores, dependiendo de la reaccin de cada tejido con el colorante.

Los colorantes pueden ser: generales, cuando tien todos los tejidos sin distincin, o especficos, cuando tien un determinado tejido dependiendo de la reaccin qumica que ocurre entre el colorante y el tejido. 5.- MONTAJE: Una vez teido el material se debe colocar en una lmina portaobjetos y protegerlo con un cubreobjetos, para poder ser observado con el microscopio. El montaje puede ser permanente, obtenindose lminas que tienen una duracin indefinida o, semipermanente, cuando se preparan lminas de corta duracin. Una lmina terminada debe ser debidamente identificada, para ello se coloca una etiqueta en la cual se indica: el nombre de la planta, el rgano, el tipo de corte, la coloracin empleada, el nombre de quien la realiz y la fecha. TCNICA PARA CORTAR A MANO SECCIONES TRANSVERSALES (C.T.) Y LONGITUDINALES (C.L.) DE MATERIAL FRESCO Y FIJADO: 1. Prepare una hojilla de afeitar, partindola por la mitad y limpindole toda la grasa. Tome una cpsula de petri con un poco de agua. Tenga a mano sus pinzas o agujas de diseccin y las lminas (portaobjetos y cubreobjetos) que va a necesitar. 2. Seleccione el material a cortar, seprelo y mantngalo hmedo. 3. Si se trata de hojas o material laminar, puede ser doblado para darle consistencia. Si se trata de tallos puede ser cortado completo o en secciones. 4. Si el material es blando o sin consistencia, proceda de la siguiente manera: a. b. c. corte dos tiras (1x3 cm) de una lmina de anime de aproximadamente 3 mm de espesor. coloque el material a cortar orientado adecuadamente entre los dos pedazos de anime y humedzcalo con agua. agarre firmemente el material con una mano y entre los dedos ndice y pulgar, y con la otra mano tome la hojilla (sus manos funcionarn como un micrtomo). Realice los cortes deslizando la hojilla sobre el material en forma horizontal. coloque los cortes en un recipiente con agua, y con la ayuda de un pincel, pinza o palitos de bamb o de naranja, elimine los pedazos de anime. Si los cortes no son utilizados de inmediato transfiralos a un frasco con alcohol de 70%.

d.

TCNICAS DE TINCION Y MONTAJE SEMIPERMANENTE: COLORANTES: Azul de toluidina o azul de metileno al 1% en solucin acuosa. MEDIO DE MONTAJE: Glicerina al 30% en solucin acuosa. Mtodo: 1. En un vidrio de reloj, una piedra de toque o directamente sobre la lmina portaobjetos, coloque una gota de colorante. 2. Con la ayuda de un pincel o un palito coloque los cortes en el colorante y djelos durante un minuto. 3. Lave los cortes para eliminar el exceso de colorante. 4. En la lmina limpia, coloque una gota de glicerina fenolada y encima los cortes cuidando que no se doblen. 5. Cubra con una lmina cubreobjetos, teniendo cuidado que no entre aire. 6. Elimine con la ayuda de un papel secante el exceso de glicerina. 7. Selle los bordes con pintura de uas transparente. 8. Identifique la lmina. COLORACIN Y MONTAJE PERMANENTE: COLORANTES: Azul de toluidina y azul de metileno al 1% en solucin alcohlica al 70%. MEDIOS DE MONTAJE: Blsamo de Canad, Permount, Merckoglass o cualquiera de las resinas que se utilizan para este fin. Estas resinas no son miscibles con el agua, ni con el alcohol, slo en solventes como el xilol. Mtodo: Para realizar montajes permanentes los cortes deben estar completamente deshidratados utilizando para ello una serie o batera de alcohol ascendente, posteriormente ser clarificados en xilol. 1. Una vez realizados los cortes y limpios de los restos del material de soporte, transfiralos a una solucin de alcohol 70%. 2. En una piedra de toque o vidrio de reloj, ponga unas gotas de colorante. (punto informativo)

3. Coloque los cortes en el colorante durante unos dos minutos. 4. Deshidrate los cortes, pasndolos sucesivamente por alcohol de 80, 90, 95 y 100%, realizando 3 cambio para el alcohol de 100%. 5. Transfiera luego los cortes a una mezcla de alcohol-xilol, 1:1, y seguidamente realice tres cambios con xilol puro. 6. Sobre un portaobjetos limpio y seco coloque una gota de xilol, y ponga los cortes en ella. 7. Ponga una gota del medio del montaje sobre el corte. No permita en ningn momento que el corte se seque. 8. Coloque la laminilla cubreobjetos sobre la preparacin sin que entre aire. 9. Presione la laminilla y deje secar la preparacin. 10. Limpie la preparacin utilizando xilol e identifquela. BIBLIOGRAFA: AGOSTINI, G. y C. BLANCO. 1974. Coleccin de muestras botnicas. Acta Bot. Venezuelica 9 (1-4): 133-139 JENSEN, W.A. 1962. Botanical histochemistry. Freeman, San Francisco. ROTH, I. 1964. Microtcnica Vegetal. Ediciones de la Biblioteca, U.C.V., Caracas. LINDORF, H., L. PARISCA y P. RODRGUEZ. 1975. Biologa Vegetal. Natura, Caracas. Cap. 13.

Revisado GOV 2006

Gua-Informe Prctica de Preparacin de Material Botnico

NOMBRE:

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CEDULA: __________ Fecha: ___________

OBSERVACIONES: Escoja los mejores cortes de tallos (tres diferentes) y hojas (al menos una), identifquelos (nombre comn y cientfico), haga un esquema y describa brevemente

Tallo 1 Nombres: _________________ _________________

Aumento: _________________

Descripcin: _________________ _________________ _________________ _________________ _________________

Tallo 2 Nombres: _________________ _________________

Aumento: _________________

Descripcin: _________________ _________________ _________________ _________________

Tallo 3 Nombres: _________________ _________________

Aumento: _________________

Descripcin: _________________ _________________ _________________ _________________

Hoja 1 Nombres: _________________ _________________

Aumento: _________________

Descripcin: _________________ _________________ _________________ _________________

Observaciones generales: __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________ __________________________________________________________________

GOV 2006