DETERMINACIN DE SAPONINA TOTAL EN QUINUA (Chenopodium quinua Willd) MTODO ESPECTROFOTOMTRICO. Monje C.

Yarko A1, Raffaillac Jean Pierre2 raffaill@entelnet.bo

Documento presentado en:IV Congreso Nacional de la Asociacin Boliviana de Proteccin Vegetal (ABPV) Barrientos, E., et.al. (eds.) 2006. Memoria IV Congreso Nacional de la Asociacin Boliviana de Proteccin Vegetal. Oruro, 5 al 7 de abril de 2006. C.E.A.C. Dpto. Fitotecnia-FCAPV-UTO. ABPV. Oruro, Bolivia. 217 P.

RESUMEN La quinua (Chenopodium quinua Willd) es un cultivo andino que en los ltimos 15 aos tomo una gran importancia comercial para Bolivia .Este cereal tiene una alta calidad nutricional gracias al balance de aminocidos presentes. Uno de los inconvenientes es la presencia de un factor antinutricional que es la saponina. La determinacin de la saponina se puede realizar por cromatografa de gases o espectroscopia de masas pero estas demandan equipos y tcnicas que no se encuentran a libre disposicin. El presente trabajo tiene por finalidad proponer una tcnica nueva y sencilla para la determinacin de la saponina total, de bajo costo que pueda ser aplicada por cualquier laboratorio.

El fundamento de la tcnica propuesta es la extraccin de la saponina con una mezcla de etanol al 50% V/V, filtrado al vaco. La solucin obtenida es diluida con el mismo etanol hasta que la concentracin de la saponina total se encuentre dentro de la curva de calibracin que se encuentra de 0 a 350 ppm. Para dar coloracin a la solucin de saponina total extrada se utiliza el reactivo de color que es una mezcla de anhdrido actico y cido sulfrico en una proporcin de1:5 (16.7 %). La proporcin de la muestra con el reactivo de color 1:3.5 (22.23%). La muestra ser leda a una longitud de onda de 528 nm. La presente tcnica no tiene interferencia con colores que pueda presentar la quinua y tiene la virtud de determinar el total de las saponinas presentes en el producto. INTRODUCCIN Las saponinas son sustancias con la capacidad de formar espuma cuando son extradas con agua (Koziol 1991). Las saponinas se consideran una familia de metabolitos secundarios y se lograron identificar 4 subgrupos: el primero son las saponinas triterpnicas, las segundas son las saponinas esteroidales, las terceras saponinas esteroidales alcalinas y el ltimo son

las saponinas de organismos marinos. Las saponinas del primer grupo se encuentran ampliamente distribuidas en el reino de las dicotiledones (Hostettmen and Marston, 1995). La saponina de la quinua tiene un papel de defensa contra plagas como los pjaros e insectos, a nivel de la maduracin fisiolgica de la planta. Actualmente la saponina forma parte de las sustancias que estn siendo investigadas para el tratamiento alternativo de la leshmania. Jacobsen et al (1996) reportan que el contenido de saponina en la quinua es variable y esto depende aparentemente de un grupo de unos genes en la planta. Estimados del contenido de saponina por Wahli (1990) y Koziol (1992)m arroja un rango que va desde 0.00 hasta 1.2 %. Tellera et al. (1978) demostraron que las variedades de quinua Sajama (1.7 %) y blanca (1.9 %) presentan menor concentracin de saponinas que las variedades amarilla (2.3 %) y colorada (2.8 %). Estos valores se obtuvieron despus de lavar la quinua a temperatura 50C, donde se removi un 75 a 80 % de la saponina. Segn Ruales and Fair (1992) las saponinas de la quinua son glucsidos triterpenoidales, localizadas en el pericarpio de las semillas y solubles en metanol y agua. Lock De Ugaz, O.,(1988) reporta reaccin positiva al reactivo de Lieberman-Burchad, Salkowski. Segn Zabaleta, citado por Bacigalupo y Tapia (1990), el nivel mximo aceptable de saponina en la quinua para consumo humano oscila entre 0.06 y 0.12%. Esto concuerda con los resultados de pruebas sensoriales realizadas en la Universidad de Ambato, Ecuador, en donde determin que el lmite mximo de aceptacin del contenido de saponina en el grano cocido, fue de 0.1% (Nieto y Soria, 1991).

MATERIAL Y EQUIPOS - Espectrofotmetro UV-VIS (Cintra 5) - Rota evaporador Re 210 (Yamato) - Material bsico de laboratorio - Etanol al 50 % V/V - cido Sulfrico Marca BIOPACK Pureza 95-98 % H2SO4 (D=1.84 g/cc) - Anhdrido Actico Marca CICARELLI Pureza > 97% (CH3-CO)2O - 10 variedades de quinuas del programa Proyecto quinua IRD- UR- CLIFA

MTODO Determinacin del solvente La bibliografa recomienda la extraccin de saponina en agua, no obstante esta tcnica presenta dificultades en el filtrado debido a la formacin abundante de espuma, que

perjudica el pipeteo y aforado de la solucin, llevando a determinaciones errneas. Este problema fue subsanado con la adicin paulatina de alcohol a diferentes concentraciones con la finalidad de romper la emulsin que se ha formado. La determinacin de la mejor concentracin, fue tomada de la quinua a la que se le extrajo la saponina a diferentes concentraciones 8, 23, 48, 52, 56, 60 y 80% V/V. El resultado se muestra en la figura 1.

Extraccin del patrn de saponina Se utiliz polvo de saponina (polvillo escarificado purificado de grano) extrado del grano por un proceso mecnico abrasivo. A partir de este polvillo se realiz la extraccin con etanol al 80% V/V y se filtro al vaco. Una vez obtenida la solucin se llev a un rota evaporador hasta que se redujo. Esta solucin se evapora hasta eliminar el total de agua y conseguir peso constante de la muestra (ver Fig. 2).

Curva de calibracin

A partir del extracto de saponina obtenida se prepar una solucin estndar disolviendo en etanol al 80% V/V.

De esta solucin de concentracin conocida se realizaron las diluciones para la curva de calibracin (tabla 1).

De los datos obtenidos se forma la grafica y se observa la relacin entre concentracin y absorbancia de la solucin

Fig. 3: Relacin de saponina con la absorbancia determinada a 528 nm

Antes de graficar se tiene que restar el blanco de los datos (ver Fig. 3) Con estos datos se determina la ecuacin del sistema : Saponina = (Absorbancia + 0.001508) / 0.05164 Con coeficiente de correlacin de r = 0.998 y un r2 = 0.996

Reactivo de color El reactivo color consiste en una mezcla de cido sulfrico y anhdrido actico en proporciones de 5:1 (16.66%) recientemente preparado. Esta mezcla tiene un color amarillo suave.

Fig. 4: Barrido de la longitud de onda La longitud de mxima absorcin se determina mediante un barrido espectral entre 400 y 600 nm a una velocidad de 1 nm/seg. La mxima absorcin se present a una longitud de 528 nm (color vino tinto diluido) (ver Fig. 4). El color de la muestra puede ser entendido como la suma de tres colores: Color ledo = (color de la reaccin de saponina) + (color de la muestra de quinua) + (color del reactivo de color) Extraccin saponina

Se pes 2.5 g de quinua y se disolvi en 25 ml de etanol al 50% V/V, esta preparacin se dej en contacto durante 30 min. Pasado el tiempo se filtr al vaco. La solucin obtenida se afora a 25 ml con el mismo etanol.

La relacin muestra-reactivo de color es de 1:3.5 es decir al 22.22 %. La muestra tiene que ser leda entre 30 y 50 minutos despus de la adicin del reactivo de color ya que en este tiempo el color es estable y permanente.

Se tiene que tener cuidado al momento de mezclar el reactivo de color con la muestra ya que esta reaccin es exotrmica. Otro punto a considerar es que la mezcla tiene una viscosidad alta y es necesario utilizar un bortex o algn equipo similar para realizar la mezcla antes de dejar el tiempo recomendado para que ocurra la reaccin.

Anlisis de muestras Las muestras de quinua analizadas son de la red agronmica quinua del programa del IRDCLIFA en colaboracin con la Facultad de Agronoma de La Paz (UMSA) y la Facultad de Agronoma de Oruro (FCAPV-UTO). Las muestras provienen de la Estacin Experimental de Beln (cosecha en mayo 2004) la cual se encuentra en el departamento de La Paz Bolivia con coordenadas geogrfica: latitud 17 10, longitud 68 25. Estas muestras se las codific con la numeracin correlativa de 1 a 10 respectivamente. Las 10 variedades estudiadas presentan distintos colores tales como rojo, naranja, amarillo y crema (ver fig. 5). En esta figura se ve la diferencia de colores que tienen los granos antes y despus de la extraccin de la saponina.

En la tabla 2 se detalla algunas caractersticas morfolgicas y fisiolgicas de las variedades estudiadas.

De cada una de las muestras se analiz por triplicado y se determin el contenido de saponina total promedio.

Fig. 6: Contenido porcentual de saponina total en las muestras analizadas

Limite de cuantificacin Debido a que las lecturas se realizaron a bajas concentraciones la misma curva puede utilizarse para determinar el lmite de cuantificacin de la tcnica aplicando la siguiente formula: 3Xa/b Donde a = es el cruce de la recta con el eje y b = pendiente de la ecuacin

Con estos datos se calcula el lmite de cuantificacin y es de: 8.75 X 10-3 expresada en ppm RESULTADOS Y DISCUSION Se prepar un estndar de saponina total del cual se determin su concentracin Se logr determinar el etanol como solvente ms apropiado para la extraccin de la saponina en una concentracin que puede variar desde 32 hasta el 58 % v/v.

Con la presente tcnica no se observ interferencia con los colores particulares de las muestras por que son restados antes de determinar el contenidos de saponina total. Los extractos de las quinuas con colores pierden su color en funcin del tiempo, esto podra ser que los pigmentos presentes en el pericarpio se descomponen en presencia de luz visible, Pero esto no afecta al contenido de saponina total de las muestra. Se logr determinar que la mxima absorcin de la mezcla se presenta a los 528 nm. Se logr determinar concentraciones de saponina en las muestras analizadas las cuales van desde 0.18 % en la variedad 2 hasta 5.01 % en la variedad 8. Las 10 muestras analizadas dan como resultado niveles de saponina mucho ms alto de lo que es aceptado por los consumidores. En las muestras analizadas se puede ver grupos de

variedades las cuales pueden se asociadas fcilmente en 3 grupos acudiendo al contenido de saponina. En la fotografa 2 se puede observa una interfase que se forma en medio de la solucin. Al momento de realizar la extraccin de la muestra y previa a la evaporacin no se presentaba ninguna opalescencia la cual pueda llevar a pensar que contaminacin de la muestra. La saponina es una mezcla de 3 estructuras principales las cuales se encuentran es distintas proporciones en el grano de quinua, es posible de que alguna des estas estructuras tenga una menor solubilidad en la solucin frente a las otras dos y esta es interfase que se presenta en la solucin patrn. De la misma forma se podra pensar que al momento de aumentar del porcentaje de etanol por encima de 58 % v/v las estructuras de la saponina toman una conformacin la cual reduce la solubilidad de la saponina total.

CONCLUSIONES Esta tcnica puede ser usada sin ningn problema para determinar saponina en quinuas con distintos colores de pericarpio. La curva tiene una proporcionalidad adecuada entre el intervalo de 0 a 350 ppm. con un r = 0.9978 y un r2 = 0.9956

RECOMENDACIONES La presente tcnica puede ser aplicada a otros alimentos que presentan una cierta concentracin de saponinas como en el caso del tarwi o la avena. Se recomienda evaluar la interferencia que pueda causar las sustancias que no son saponinas pero pueden dar color a la longitud de onda de trabajo.

Notas de pie 1 Programa de Maestra en Ciencias Biolgicas y Biomdicas, UMSA, La Paz, INLASA Instituto de Laboratorios de Salud Nstor Morales Villazon, Laboratorio de Nutricin y Anlisis Sensorial, IIFB Instituto de Investigaciones Frmaco Bioqumicas 2 Proyecto quinua IRD, UR-CLIFA, CP 9214, La Paz, Bolivia

REFERENCIAS KOZIOL M.J., 1992. Chemical Composition and nutritional evaluation of quinoa (Chenopodium quinua Willd). J. Food Comp. Anal., 5, 35-68.

HOSTETTMAN K.A. & A. Marston, 1995. in the Chemistry and Pharmacology of Natural Products,. Saponin, Cambridge University Press, Cambridge.

JACOBSEN S.E., Hill J. & O. Stolen, 1996. Stability of quantitative traits in quinoa (Chenopodium quinua). Teor. Appl. Genet., 93, 110-226.

WAHLI C., 1990. Quinua. Hacia un cultivo comercial. Latinreco, Quito, 206 pp.

TELLERA M.L., SGARBIERI V.C. & J. AMAYA, 1978. Evaluacin qumica y biolgica de la quinoa (Chenopodium quinoa Willd ), Influencia de la extraccin de las saponinas por tratamiento trmico". Arch. Latinoamer. Nutr. 28: 253.

RUALES J. & B.M. FAIR, 1992. Quinoa (Chenopodium quinoa Willd). An important andean food crop. Department of Applied Nutrition, University of Lund, Sweeden. Instituto de Investigaciones Tecnolgicas, Escuela Politcnica Nacional. Quito, Ecuador. 26 p.

BACIGALUPO A. & M. TAPIA, 1990. Potencial agroindustrial de los cultivos andinos subexplotados. En: Tapia M. (ed.). Cultivos Andinos subexplotados y su aporte a la alimentacin. FAO. Ediciones Gegra S.A. Santiago, Chile. pp. 136-163.

NIETO C. & M. Soria, 1991. Procesamiento de quinua en Ecuador. Proyecto 3P-85-0213. Informe final de labores. INIAP-UTA-CIID. Quito, Ecuador. 94 p.

LOCK DE UGAZ O., 1988. Investigacin fitoqumica. Mtodos en el estudio de Productos Naturales. Pontifica Universidad Catlica del Per, Fondo Editorial, Lima, Per.