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Artemisa en lnea

VI. Reacciones de aglutinacin

Vicente Aguilar-Garca*

Las reacciones de aglutinacin y de precipitacin son la base de la mayor parte de las tcnicas inmunolgicas. Su principio se basa en la reaccin antgeno-anticuerpo. Para comprender lo anterior es necesario definir qu es un antgeno y un anticuerpo. Antgeno es una sustancia de alto peso molecular, con cierta rigidez estructural y que tiene la particularidad de ser parcialmente metabolizado por clulas especializadas llamadas macrfagos, por lo tanto es capaz de generar una respuesta inmune en un organismo que la detecte como un agente extrao. Mientras que un anticuerpo es una glicoprotena, producida por linfocitos B activados, llamados clulas plasmticas, como respuesta a la presencia de un antgeno en el organismo, a su vez los anticuerpos pueden ser producidos por lneas celulares in vitro, como es el caso de la produccin de anticuerpos monoclonales. Dichos anticuerpos llamados tambin inmunoglobulinas, se presentan en cinco clases principales, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, que se diferencian entre s por sus caractersticas fsicas, qumicas y biolgicas.1,2,3 La capacidad inmunognica de distintas partculas, es en orden decreciente la siguiente: protenas, glicoprotenas, polisacridos, lpidos y azcares. Las reacciones de precipitacin son medibles en cantidad y son fciles de ejecutar. Las tcnicas de aglutinacin son slo semicuantitativas y algo ms difciles. La aglutinacin de los antgenos nativos insolubles o de las partculas recubiertas por el antgeno puede evaluarse a simple vista con o sin la ayuda del microscopio. Entre las ventajas de las reacciones de aglutinacin estn su alto grado de sensibilidad y la enorme variedad de substancias identificables a travs del uso de partculas que estn recubiertas por antgeno o por anticuerpo. Segn Coombs existen 3 requerimientos principales en las pruebas de aglutinacin: 1. Disponibilidad de una suspensin estable de clulas o de partculas. 2. Presencia de uno o ms antgenos cercanos a la superficie. 3. Conocimiento de que los anticuerpos "incompletos" o no aglutinables no son localizables sin modificacin (reacciones antiglobulina).

Clasificacin de las reacciones de aglutinacin

Aglutinacin directa
Un antgeno celular o de partculas insolubles es aglutinado directamente por el anticuerpo. Un ejemplo de esto es la aglutinacin de los eritrocitos del grupo A por antisueros antiA, la aglutinacin de los eritrocitos RH positivos por el antisuero anti-D o la aglutinacin del antgeno brucelar por anticuerpos anti-Brucella. Gran cantidad de partculas como pueden ser eritrocitos, bacterias, hongos y virus pueden ser aglutinados por anticuerpos sricos, algunas veces de manera inespecfica y otras muy especfica, siendo sta ltima, respuesta a una previa inmunizacin del organismo productor de los anticuerpos sricos. Las pruebas para identificar anticuerpos especficos son llevadas a cabo titulando seriadamente antisueros en diluciones al doble en presencia de una cantidad constante de antgeno.

Aglutinacin indirecta
Se refiere a la aglutinacin de las clulas recubiertas de antgeno o a las partculas inertes que son portadoras pasivas de antgenos solubles. Se tienen ejemplos de lo anterior en la utilizacin de partculas de gelatina en la bsqueda de anticuerpos contra Treponema pallidum por aglutinacin pasiva (TPPA), la fijacin del ltex para VDRL en la sfilis y en la utilizacin de eritrocitos en la prueba de hemaglutinacin indirecta (HAI) en la bsqueda de anticuerpos contra Tripanosoma cruzi, agente causal de la enfermedad de Chagas. De manera alterna, el antgeno puede ser localizado recubriendo partculas de ltex o eritrocitos con anticuerpo purificado y practicando la llamada aglutinacin inversa.

Hemaglutinacin viral
Otra categora de aglutinacin que involucra la aglutinacin espontnea de los eritrocitos por ciertos virus, es la reaccin de hemaglutinacin viral, la cual puede inhibirse de manera especfica en presencia de anticuerpos

* Qumico frmaco-bilogo

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antivirales. Por lo tanto, la hemaglutinacin viral puede emplearse para medir la cantidad de virus o para determinar, por inhibicin homloga, el ttulo de los anticuerpos dirigidos en contra de los virus hemaglutinantes.

Capacidad de deteccin
La inhibicin de la hemaglutinacin empleando reacciones de hemaglutinacin pasiva mediante placas de microtitulacin es sensible para medir antgenos a concentraciones de 0.29 g/ml. La hemaglutinacin indirecta o pasiva con clulas sensibilizadas a las protenas puede identificar anticuerpos a concentraciones tan bajas como 0.03 g/ml. En los antisueros con ttulos muy altos de aglutinacin un fenmeno de prozona puede obscurecer los resultados. El fenmeno de prozona produce reacciones falsas negativas de aglutinacin a concentraciones elevadas de anticuerpo como resultante de la mala formacin de estructuras de enrejado molecular y por el bloqueo estrico por el exceso de anticuerpo, el uso de diluciones seriadas estndar elimina esta dificultad. Debido a que el anticuerpo IgM es aproximadamente 750 veces ms eficiente que la IgG en la aglutinacin, la presencia de altas cantidades de IgM puede influir notoriamente sobre los resultados de la prueba. En el banco de sangre la Hemaglutinacin indirecta es comunmente usada para la deteccin de anticuerpos Anti-Tripanosoma cruzi.

Inhibicin de la aglutinacin
La inhibicin de la aglutinacin, si se arregla de manera cuidadosa con antgenos altamente purificados, puede ser usada como un indicador sensible de la cantidad del antgeno en diversos lquidos de los tejidos.

Hemaglutinacin indirecta (pasiva)

Este tipo de aglutinacin se lleva a cabo utilizando eritrocitos recubiertos de antgenos, o anticuerpos acoplados de manera espontnea (adsorcin pasiva) o mediante un acoplamiento qumico, utilizando diversas sustancias para este fin, tales como Acido tnico Bencidina bisdiazoada (BDB), Cloruro crmico (CrCIs), Glutaraldehdo, clorurocianrico entre otros. Algunas de las substancias que se absorben para la hemaglutinacin: Antgenos de Escherichia coli. Antgenos de Yersinia. Lipopolisacridos de Neisseria meningitidis. Antgenos de Toxoplasma. Derivado proteico purificado (DPP). Endotoxina de especies de Micoplasma. Virus. Antibiticos, especialmente penicilina. Ovalbmina. Albmina srica bovina. Haptenos. Antgenos de polen. Gonadotrofina corinica. Al realizar esta tcnica se debe poner especial atencin en la posible interferencia de anticuerpos heterfilos, los cuales pueden aglutinar inespecficamente a los eritrocitos. Estos son anticuerpos naturales, no adquiridos por inmunizacin a los glbulos rojos utilizados, pero capaces de aglutinarlos. Generalmente son del tipo IgM. Cuando dicha interferencia se presenta, se deben absorber las muestras de suero a menudo con eritrocitos lavados no cubiertos por antgeno, para eliminar los anticuerpos heterfilos o ser tratados con 2-Mercaptoetanol, el cual acta sobre la cadena J de las IgM inactivndolas. Las ventajas de emplear eritrocitos para recubrirlos con antgeno son su disponibilidad inmediata, la sensibilidad como indicadores y la posibilidad de almacenamiento prolongado a 4C. Gac Md Mx Vol. 140, Suplemento No. 3, 2004

Inhibicin de la hemaglutinacin
La inhibicin de la aglutinacin de los eritrocitos recubiertos con antgeno por el antgeno homlogo es un mtodo sensible y especfico para la identificacin de pequeas cantidades de antgeno soluble en la sangre o en otros lquidos de los tejidos. El principio de este anlisis es que, el anticuerpo incubado previamente con antgenos homlogos solubles o de reaccin cruzada, es inactivada cuando se incuba con eritrocitos recubiertos de antgeno. Este mtodo de inhibicin de la hemaglutinacin ha resultado muy til para la identificacin de HBsAg en la hepatitis y para la identificacin del antgeno factor VIII en la hemofilia y trastornos afines de la coagulacin.

Prueba de ELISA La prueba de ELISA (enzyme linked imunosorbent assay) se describi en 1971 por Engvall y Perlman, se fundamenta en la reaccin antgeno anticuerpo, utilizando una superficie o fase slida que pueden ser micropozos o esferas, sobre las cuales se encuentran fijos antgenos o anticuerpos, contra los que acta un anticuerpo conjugado a una enzima, la cual es capaz de catalizar una reaccin con un sustrato que en presencia de un indicador de oxido-reduccin se transforma en un producto colorido, para la deteccin de anticuerpos o antgenos correspondientemente. Existe una amplia variedad de pruebas de ELISA, como son: pruebas directas, indirectas, inhibitorias, y a su vez, las empresas S 51

dedicadas a la fabricacin e investigacin de reactivos serolgicos para bancos de sangre, innovan constantemente en la bsqueda de reactivos ms sensibles y especficos, por lo que a cada cambio significativo en los reactivos, que coadyuva a la deteccin ms temprana de los anticuerpos o antgenos buscados se le conoce como una nueva generacin de los mismos, de tal manera que existen pruebas de ELISA de primera, segunda, tercera y cuarta generacin actualmente.4,5,6 En banco de sangre en Mxico, las pruebas de ELISA se utilizan comnmente para la deteccin de anticuerpos contra el Virus de la Inmunodeficiencia Humana, el Virus de la Hepatitis C, Tripanosoma cruzi, protozoario causante de la enfermedad de Chagas, de antgeno de superficie del Virus de la Hepatitis B.

Referencias

1. 2. 3. 4.

5. 6.

Inmunologa Bsica y Clnica, autor Daniel p: Stites y H. Hugh Fuden 9 Edicin 1998. Engvall E, Perlmann, P. (1971). Immunochemistry 8:871 The antiglobulin test. Technical manual. 12. Ed. AABB. cap. 11. US. 1996. Raichle TL, Paranto ME. Compatibility testing. En: Hardening MD. Modern blood bancking and transfusin practices. Philadelphia:FA Davis; 1994.p.256-75. Radillo Gonzlez A. Medicina Transfusional. Editorial Prado. Mxico.1999. Norma Oficial Mexicana NOM-003-SSA-1993, Para la disposicin de sangre humana y sus compenentes con fines teraputicos. Mxico: Secretara de Salud1994.p.1-75.

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