Tugas Kelompok Pengantar Penelitian Biokimia

Tanggal :Kamis/01 Maret 2012 Dosen :Prof. Dr. drh. Maria Bintang M.Sc

METODE PEMECAHAN SEL

Kelompok 7 Sarah Fitriani Amar Muslim Sisca Resha Saputri M. Budi Rahmanwahid Clara Shinta A.R Puri Dermawan Muvita Diah S G84090013 G84090019 G84090041 G84090045 G84090062 G84090084 G84090085

DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012

METODE PEMECAHAN SEL DALAM PENELITIAN BIOKIMIA Pemecahan sel adalah langkah pertama dalam beberapa proses analitik untuk melepaskan dan meneliti kandungan sel. Proses tersebut sangat penting dalam percobaan fraksinasi untuk isolasi, pemurnian, dan pengujian organel subselular. Dalam proses homogenisasi, maka jaringan dipecah dan dhancurkan, sehingga melepaskan senyawa-senyawa intraselular membentuk suspense sel yang disebut homogenat. Homogenate ini dapat digunakan secara langsung untuk pengujian aktivitas enzim atau untuk mempelajari masuknya suatu senyawa metabolit atau xebobiotik yang sulit dilakukan pada jaringan tubuh. (Bintang 2010) Suhu tinggi dapat mendenaturasi sebagian besar enzim, sehingga proses pemecahan umumnya dlakukan pada 4C, dalam ruangan laboratorium berpendingin atau dalam skala kecil yang dilakukan dengan dua cara, yaitu cara mekanik dan non-mekanik. Pemecahan sel secara mekanik dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu metode solid shear (pemecahan dalam bentuk padatan) atau metode lquid shear atau pemecahan dalam cairan, sedangkan pemecahan sel secara non-mekanik dapat dilakukan dengan tiga cara, yaitu enzmatik, fisik, dan kimia. (Bintang 2010) Teknik Mekanik Ada beberapa cara mekanik yang dapat digunakan yakni, solid shear, liquid shear, high pressure disruption, dan ultrasonic oscillaton. Secara mekanis dalam bentuk cair yaitu pemecahan dengan gelembung netrasonik (sonikator), dan agitasi mekanis dengan tekanan (pompa penekan French pressure). Betuk padatnya yaitu dengan homogenisasi dan penggilingan dengan mortar/blender, dan penghancuran dengan Hammer mill. (Soedjarwo 2004). Teknik mekanik terbagi menjadi pemecahan cair dan pemecahan padat.

a. Sonikasi (ultrasonic oscillaton) Salah satu cara efektif untuk memecah sel yang dapat diterapkan pada mikroorganisme ialah dengan gelombang bunyi berfrekuensi tinggi.

Efisiensi pemecahan sel dipengaruhi oleh keluaran daya alat, durasi penggunaan, dan volume bahan yang diproses. Pendinginan dibutuhkan untuk mencegah

pemanasan berlebihan. Metode ini menggunakan alat sonikator dengan frekuensi getaran 300-30.000 kali per menit. (Bintang 2010). Penelitian yang menggunakan sonifikasi pada metode pemecahan selnya adalah pada penelitian Identifikasi Profil Protein Sarcoptes Scabiei Pada Kambing Dengan Analisis Sds-Page. Pada salah satu bagian metode dijabarkan bahwa setelah isolat dilarutkan dalam satu ml PBS dan disonikasi pada 30 kHz, diulang sebanyak 16 kali, masingmasing selama 4 menit dengan waktu istirahat 2 menit. Larutan hasil sonikasi selanjutnya disentrifus. (Lastuti 2004) Pada prosiding skripsi yang berjudul Karakterisasi Ekstrak Kasar Enzim Invertase Yang Diamobilisasi Dengan NaAlginat. Ragi roti ditimbang sebanyak 55 gram kemudian ditambah larutan NaHCO3 0,1 M sebanyak 150 ml dan diaduk. Campuran tersebut dimasukkan ke dalam tabung homogenizer kemudian diletakkan pada alat homogenizer. Pencampuran dilakukan dengan kecepatan 7000 rpm selama 5 menit. Hasil campuran yang telah homogen dimasukkan ke dalam erlemeyer lalu ditutup dengan kapas yang dilapisi kasa dan alumunium foil serta diinkubasi pada suhu 40oC selama 24 jam. Campuran yang telah diinkubasi kemudian dilakukan pemecahan sel menggunakan alat ultrasonikator dengan kuat getaran sebesar 16 rms selama 20 menit. (Hasanah dan Putra 2009)

b. Solid Shear Metode pemecahan sel(tanaman, yeast, dan bakteri) ini dapat dilakukan dengan cara menggerus bersama pasir kuarsa steril atau nitrogen cair di dalam mortar. (Bintang 2010). Pada jurnal yang berjudul Spesifitas Dan Sensitifitas Antibodi Anti Erf3 Ragi Saccharomyces Cerevisia.Dalam metode penelitannya tercantum penggunaan glass bead, yakni pada bagian isolasi enzim, satu koloni tunggal ragi ditumbuhkan dalam media cair YEPD dan diinkubasi pada suhu 30oC dengan pengocokan 150 rpm sampai mencapai OD600 : 0.5. Biakan dipindahkan ke dalam 50mL media produksi dan diinkubasi kembali hingga OD600 :1.5-2. Suspensi sel disentrifugasi dengan kecepatan 2300g selama 10 menit, pellet sel dicuci dengan buffer lisis dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 2300g selama 15 menit. Pelet sel diresuspensi dengan buffer lisis + PMSF dan dimasukkan ke dalam tabung sorval. Kedalam suspense ditambahkan

glass bead sampai batas miniskus bawah dan di vortex selama 10 menit. (Hermanto 2010)

c.Liquid Share Pemecahan cair, menggunakan blender dengan kecepatan tinggi atau dapat juga menggunakan alat pelumat(homogenizer), tetapi biasanya hanya dilakukan beberapa detik saja untuk menghancurkan sel mikroorganisme karena mikroorganisme memiliki sel yang kecil. Misalnya terdapat dalam metode penelitian sebuah jurnal yang berjudul Seleksi Dan Pengujian Aktivitas Enzim LHistidine Decarboxylase Dari Bakteri Pembentuk Histamin. Isolasi enzim dilakukan dengan menumbuhkan isolate bakteri pembentuk kadar histamin tertinggi dan Morganella morganii (sebagai kontrol) dalam media sintetik. Sebanyak 2 ml inokulum (8,7 x 109 sel/ml), ditambahkan pada Erlenmeyer 100 ml berisi 20 ml medium sintetik, kemudian diinkubasi selama 18 jam dalam shaker dengan kecepatan 125 g pada 37C. Pemisahan hasil fermentasi dilakukan dengan sentrifugasi pada kecepatan 15.000 g selama 15 menit, kemudian dicuci dengan bufer fosfat pH 6,8. Pasta sel yang diperoleh disuspensikan dengan bufer fosfat pH 6,8 (5 ml/g berat basah sel). Pemecahan dinding sel dilakukan dengan tissue homogenizer selama 5 menit dengan kecepatan 11.000 g. Ekstrak enzim kasar dipisahkan dari sel dengan sentrifugasi pada kecepatan 15.000 g selama 15 menit. (Mangunwardoyo 2007)

d. High Pressure Disruption Merupakan teknik pemecahan sel dengan menggunakan tekanan tinggi. Metode ini digunakan untuk memecah sel mikroorganisme. Selain itu metode ini juga digunakan untuk pemecahan sel hewan (1000 psi) dan bakteri (1000-2000 psi). (Bintang 2010).

e. Agitasi dan Abrasi Pasta ditempatkan pada wadah yang megandung butir-butir gelas dan digetakan dengan cepat. timbulnya gaya gesek akibat gradien kecepatan oleh tumbukan antar butiran dan antara butiran dengan mikroorganisme menyebakan pecahnya sel.

f. Peralatan Pemecahan Sel Secara Mekanik 1. Alu penghomogen Alu penghomogen dapat digunakan untuk menghancurkan sel hewan dengan efektif namun lembut. Teknik ini merusak seluruh sel kecuali organelnya. Ada dua macam alu penghomogen, yaitu penghomogen Dounce dan PotterElvehjem. Penghomogen Dounce terdiri dari sebuah tabung gelas, tertutup pada salah satu ujungnya, dan dua buah alu (piston) yang dapat masuk ke dalam tabung tersebut namun berbeda keketatannya. Jaringan sampel dipotong kecil-kecil dan

dimasukkan ke dalam tabung penghomogen bersama larutan penyangga, lalu alu "L" (loose, longgar) digunakan terlebih dahulu untuk menghancurkan jaringan tersebut menjadi campuran cair. Alu "T" (tight, ketat) lalu digunakan untuk menghancurkan sel dan mengeluarkan isinya. Umumnya homogenisasi dilakukan dalam jumlah tertentu gerakan alu naik dan turun di dalam tabung.Penghomogen PotterElvehjem bekerja dengan cara sama, namun alu-nya berbentuk lebih tabung sehingga gaya pemecahnya dapat disebar ke permukaan yang lebih luas. Penghomogen tipe ini juga tersedia dalam versi automatis dan bermotor. 2. Blendor Waring Blendor Waring merupakan sejenis blender yang terdiri dari rotor berkecepatan tinggi dengan bilah pemotong yang dipasang di dalam wadah kaca. Seberapa hancurnya sel bergantung pada kecepatan putaran bilah. Pada kecepatan tinggi, alat ini dapat merusak Alat mitokondria ini paling dan nukleus serta banyak digunakan bahkan untuk

mendenaturasi protein.

jaringan tumbuhan dan hewan, namun kurang efektif untuk mikroorganisme. 3. Penggerusan Beberapa jenis alat dapat digunakan untuk menggerus sel. Dengan alat yang disebut disintegrator Edmund-Bhler, sel bakteri digetarkan bersama manikmanik kaca di dalam wadah berpembungkus. Sel pecah akibat tumbukan, sobekan, dan gesekan antarpermukaan keras. Agar tidak memanas, cairan pendingin dialirkan melalui pembungkus. 4. Bom Parr

Dengan

alat

yang

disebut

bom

Parr,

sampel

diberi

gas nitrogen dengan tekanan sangat tinggi sehingga nitrogen memasuki cairan sel. Ketika tekanannya dihilangkan, gelembung-gelembung nitrogen meledak keluar dan merusak sel, namun tidak terlalu merusak organel. 5. Ekstrusi dalam tekanan tinggi Dengan menggunakan alat seperti sel tekanan French, sel dipecah dengan ekstrusi melalui lubang sempit dalam tekanan sampai 8.000 psi

Teknik Non-Mekanik Beberapa cara non-mekanik yang dapat digunakan, yaitu teknik enzimatik, teknik fisik, dan teknik kmiawi. a. Teknik Enzimatik Pemecahan sel secara sederhana dapat dilakukan oleh enzim, karena enzim dapat mencerna membrane sel hewan, dinding sel tumbuhan , dan mikroba. Sebagai contoh, kombinasi antara pektinase dan selulase yang mencerna selulosa dan pectin pada dinding sel tanaman; kitinase pada dinding sel fungi dan serangga; lisozim pada dinding sel bakteri yang mengandung peptidoglikan; serta koagulase dan tripsin yang mencerna protein sel hewan. (Bintang 2010). Pemecahan dinding sel dengan cara ini merupakan cara paling efektif. Enzim litik yang umum digunakan adalah lisozim yang diperoleh dari putih telur enzim ini memecah ikatan b-1,4 glikosida dari polisakarida (asam muramat) penyusun dinding sel. Dinding sel bakteri gram positif lebih banyak mengandung polisakarida dibandingkan dengan bakteri gram negatif, sehinggan penggunaan enzim litik lebih efektif untuk memecah dinding sel bakteri gram positif. EDTA perlu ditambahkan pada media sebelum enzim ini digunakan untuk memecah dinding sel bakteri gram negatif, untuk mengikat ion-ion divalen yang dapat menginaktifkan enzim ini. Enzim lisozim dapat digunakan secara komersial pada ekstraksi enzim glukosa isomerase dari streptomyces sp. Nasran et all 2003, dalam jurnal yang berjudul Produksi Kitinase Dan Kitin Deasetilase Dari Vibrio Harveyi menyatakan proses konversi kitin secara kimiawi dapat dilakukan menggunakan larutan NaOH pada kadar dan suhu tinggi. Teknologinya relatif mudah, tetapi mutu kitosan yang dihasilkan dengan cara ini

kurang seragam, meskipun telah dibantu dengan pengadukan. Hal ini lebih disebabkan karena hidrolisis secara kimiawi bersifat acak/tidak spesifik pada ikatan/gugus tertentu seperti hidrolisis oleh enzim. Teknologi alternatif adalah menggunakan enzim kitinase dan kitin deasetilase. Kedua jenis enzim ini terdapat secara ekstraseluler dalam lapisan lender lambung dan usus serta darah beberapa jenis ikan.

b. Teknik Fisik Pemecahan sel dengan cara ini dapat dilakukan melalui dua metode, yaitu osmotic shock dan freezing-thawing. Contoh metode osmotic shock adalah sel darah merah yang dimasukkan ke dalam aquades(larutan hipotonik), sehingga sel darah pecah. (Bintang 2010). Bakteri gram negatif lebih rentan terhadap perubahan tekanan osmosa yang besar dibandingkan bakteri gram positif. Bila bakteri diletakkan dalam media dengan tekanan osmosis tinggi (mis. larutan sukrosa 20%) sampai dicapai keadaan setimbang, kemudain dipindahkan ke dalam air, maka akan timbul aliran air dari media ke dalam sel, sehingga akan menyebabkan pecahnya dinding sel. Pada artikel ilmiah yang berjudul Keutuhan Membran Spermatozoa Sapi Friesian Holstein (Fh) Dalam Bahan Pengencer Skim Kuning Telur, Tris Kuning Telur Dan Andromed Setelah Proses Pembekuan digunakan metode freezing-thawing dalam prosedurnya, yakni straw yang telah dikemas atau diatur di atas rak straw, kemudian diletakkan di atas Nitrogen cair 1 cm di atas permukaan Nitrogen cair, processing dalam container sampai suhunya mencapai -140C. Freezing dilanjutkan setelah pre freezing yaitu straw direndam dalam Nitrogen cair yang suhunya -196C. (Yunita 2011)

c. Teknik Kimia Dengan menggunakan pelarut organic seperti etil asetat atau toluene, dan menggunakan detergen sepesrti SDS, Triton X-100, dan Tweeen 80. Detergentdetergent anionik, kationik, dan non-ionik cukup efektif untuk merusak membran sel. Contoh detergent yang sering digunakan untuk isolasi enzim antara lain: setiltrimetil amonium bromida (kationik), natrium lauril sulfat (anionik), tweens, spans dan triton (non-ionik).Pada kondisi pH dan kekuatan ion yang sesuai,

detergent akan berinteraksi dengan lipoprotein untuk membentuk misel. akibatnya lipoprotein yang merupakan konstituen membran dapat larut dan enzim dapat dikeluarkan. Pemilihan dan penggunaan detergent ini harus cukup selektif, karena beberapa enzim dapat menjadi tak aktif akibat denaturasi protein dan pengendapan oleh detergent. Umumnya detergent harus segera dipisahkan sebelum enzim hasil isolasi digunakan. Pada jurnal yang berjudul PCR Tanpa Isolasi DNA dari Sel Epitel Rongga Mulut, salah satu prosedurnya menggunakan teknik kimia dalam pemecahan sel, yakni penggunaan Tween 20 yakni, lisis sel epitel untuk memperoleh DNA mitokondria dilakukan dengan cara menginkubasi 10 L sampel dalam 200 L campuran reaksi yang terdiri dari bufer lisis (50 mM Tris-HCl pH 8,5; 1 mM EDTA pH 8,0; 0,5 % Tween-20) dan proteinase-K 200 (g/mL. Inkubasi dilakukan pada suhu 50 oC selama 1 jam disusul dengan 95 oC selama 3 menit6) dalam mesin Mastercycler 5330 (Eppendorf). (Gustiananda dan Noer 2000) Teknik pemecahan sel dalam metode kimiawi lebih banyak digunakan untuk preparasi DNA. Sel diperlakukan dengan pemaparan senyawa kimia yang mempengaruhi dinding sel. Dinding sel E.coli dan bakteri sejenis dilemahkan oleh lisozim, EDTA, atau campuran keduanya. Lisozim memotong senyawa polimer dinding sel, sedangkan EDTA mengikat ion magnesium yang menjaga struktur dinding sel dan juga menghambat enzim yang akan memotong DNA. Dengan cara ini, cukup untuk memecahkan sel, tetapi biasanya ditambah detergen, seperti natrium dedosil sulfat (SDS). Detergen ini membantu proses lisis dengan menghilangkan lipid pada dinding sel. Pada preparasi DNA plasmid lisis dilakukan pada suasana alkali pH 12. Keadaan ini, molekul DNA kromosom terfragmentasi dan terdenaturasi. Sedangkan DNA plasmid terdenaturasi tetapi masih saling terpaut antara masing-masing untai dan tidak terpotong karena ukurannya kecil. Jika campuran kalium asetat dan asam asetat ditambahkan sampai netral, fragmen DNA akan membentuk gumpalan kusut bersama dengan sebagian besar protein dan RNA. DNA plasmid kembali renaturasi menjadi untai ganda dan terlarut. Setelah sel lisis, partikel yang tidak larut seperti dinding sel, dihilangkan dengan sentrifugasi. Buffer 7.8 digunakan dalam isolasi DNA kromosom yang mengandung lisozim untuk menghasilkan speroplas. Penambahan

detergen yang lebih lemah misalnya sarkosil dimaksudkan untuk memecah speroplas. Protein sel dipecah dengan proteinase K semalam. Dengan cara ini DNA kromosom tidak terfragmentasi dan jumlah protein menjadi tinggal sedikit (Sudjadi 2008).

Metode Isolasi DNA dan Pemecahan Sel Bakteri

Pemecahan dinding sel-sel atau jaringan yang akan diisolasi DNA-nya, seperti sel-sel darah merah, kultur sel bakteri, dan jaringan hewan atau tanaman. Sel-sel dari kultur sel atau bakteri disentrifugasi dengan kecepatan 8.000-10.000 rpm selama 10 menit. 1. 2. 3. 4. Debris sel dipisahkan dari larutan DNA. Presipitasi RNA dan protein agar diperoleh DNA yang murni. Presipitasi DNA dengan ethanol dingin Pemurnian DNA dari ekstrak sel dengan menggunakan salah satu

kemikalia seperti berikut ini: Fenol, Fenol : kloroform, Isopropanol, Fenol:kloroform:isoamylalkohol. 5. Selain itu untuk pemurnian DNA dari kontaminan protein digunakan

enzim protease yaitu Pronase atau Proteinase-K, dan kontaminan RNA dengan menggunakan RNase. 6. Pemisahan DNA dari molekul RNA dan protein dapat dilakukan dengan

menggunakan densitas gradien sentrifugasi Cesium Chlorida (CsCl), dengan cara ini DNA akan terpisah pada band yang berbeda dengan protein dan RNA bahkan antara linier DNA dan sirkuler DNA. Selain itu, dengan menggunakan garam dengan konsentrasi tinggi, seperti 0,25 M sodium acetate atau 0,1 M sodium chlorida. 7. Presipitasi akhir DNA dapat dilakukan dengan menggunakan ethanol yang

dingin dibawah kondisi ionik yang kuat. Dan dicuci dengan EtOH 70%. 8. Pellet DNA dilarutkan dengan buffer TE atau ddH2O steril. Pemecahan dinding bakteri dapat dilakukan dengan 2 cara, yaitu: (1) Secara fisik: sel dipecah dengan kekuatan mekanik atau resonansi (2) Secara kimiawi : sel dirusak dengan buffer lisis berisi senyawa kimia yang

dapat merusak intregitas barrier dinding sel, senyawa kimia yang dipakai biasanya, al.: lisosim, EDTA (etilen diamin tetra asetat), Tris-Cl, atau deterjen, SDS (sodium dodecyle sulphate).