Universit Paris 12 IUP SIAL Mlle ROUX 28/11/03 NOVELLO Clia TAP Julien

TP de microbiologie : ANALYSES DE LEAU

Sommaire
I. II. Introduction ........................................................................................................................ 3 Analyse dune eau contamine........................................................................................... 3 A. Prparation des dilutions ................................................................................................ 3 B. Recherche de spores de Clostridium sulfito-rducteur .................................................. 4 1. Milieu viande foie (VF) au sulfite de sodium ............................................................ 4 2. Rsultat....................................................................................................................... 4 C. Dnombrement des micro-organismes arobie 30 et 37C ......................................... 4 1. Glose trypticase soja : GTS ...................................................................................... 4 2. Dnombrement ........................................................................................................ 4 3. Rsultats ..................................................................................................................... 5 D. Technique du nombre le plus probable : NPP................................................................ 5 1. Principe....................................................................................................................... 5 2. Bactries concernes. ................................................................................................. 5 3. Milieux utilises ......................................................................................................... 6 4. Ensemencement.......................................................................................................... 6 5. Rsultats ..................................................................................................................... 6 6. Tests confirmatifs ....................................................................................................... 7 7. Milieu losine et au bleu de mthylne (EMB) ..................................................... 8 III. Analyse dune eau peu contamine ................................................................................ 8 A. Mthode de filtration sur membranes............................................................................. 8 1. Matriel ...................................................................................................................... 8 2. Mode opratoire ......................................................................................................... 9 B. Milieux utilises ............................................................................................................. 9 1. Glose lactos au TTC et Tergitol 7........................................................................... 9 2. Glose de slanetz et Bartley ....................................................................................... 9 Conclusion.................................................................................................................................. 9 Bibliographie.............................................................................................................................. 9

I. Introduction II. Analyse dune eau contamine

A. Prparation des dilutions
Avant densemencer les milieux, on effectue des dilutions en cascades de la solution 10-1 la solution 10-5 : On prlve dans un flacon 10mL de leau analyser que lon place dans un tube essai laide dune pipette strile On prlve du tube contenant la leau analyser 1mL que lon place dans un des tubes contenant les 9mL de tryptone-sel, on homognise la solution laide du vortex, puis on prlve 1mL de ce tube pour le mettre dans un troisime tube et ainsi de suite jusquau cinquime tube. (voir schma ci-dessous) 10mL deau analyser 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL

-1

-2

-3 9 mL de tryptone-sel

-4

-5

Afin de dnombrer les microorganismes contenus dans leau on suit le tableau suivant : Micro-organismes Micro-organismes arobie 30C Micro-organismes arobie 37C Coliformes Entrocoques *Spores de Clostridium sulfito-rducteur Milieux GTS GTS Bouillon lactos au bromocrsol pourpre Rothe VF + 0.5 mL sulfite de sodium (5%) + 2 gouttes dalun de fer (5%) Dilutions 1mL (-1 -5) 1mL (-1 -5) Incubation 72h/30C 24h/37C

1mL (-2 -5) 24h/30C (NPP 3 tubes) 1mL (-2 -5) 24h/30C (NPP 3 tubes) 2.5mL (-1 -5) 24h/37C

B. Recherche de spores de Clostridium sulfito-rducteur

Pour les spores il faut chauffer pralablement la suspension mre 10 minute 80C. Cette tape de chauffage permet de prparer les spores la germination. On appelle cette tape lactivation. La germination consiste en un gonflement de la spore, pertes des diffrentes rsistances, augmentation de lactivit mtabolique. De nombreux composs favorisent la germination aprs lactivation, notamment les acides-amins et les sucres. La germination est suivie de la croissance bactrienne.

1. Milieu viande foie (VF) au sulfite de sodium

Ce milieu est constitu de : Base viande foie :Source de protine Glucose : Source de carbone Amidon soluble : Facilite la germination des spores Certains Clostridium forment de lhydrogne sulfur au cours de leur mtabolisme. Lapport de soufre se fait grce au sulfite de sodium qui joue aussi le rle dinhibiteur vis vis de certains Clostridium non sulfito-rducteurs. LH2S ainsi obtenu, va ragir avec les sels de fer provenantde lalun, pour former du sulfure de fer qui prcipite, entourant les colonies dun halo noir. Comme les colonies sont de petites taille par rapport au halo, cela donne limpression que les colonies sont noires.

2. Rsultat
Aprs une incubation de 24 heures 37C on nobserve pas de colonies noir caractristiques. Leau analyser ne contient donc pas spores de Clostridium sulfito-rducteur.

C. Dnombrement des micro-organismes arobie 30 et 37C

1. Glose trypticase soja : GTS
Cette glose permet la croissance abondante de la plupart des bactries arobies et anarobies, sans adjonction de substances nutritives.

2. Dnombrement
Le dnombrement des colonies caractristiques dans les diffrentes boites nous donne le tableau suivant : Boites incubes 30C Dilutions -1 -2 -3 -4 -5 Nombre de >15 263 41 >15 >15 colonies Boites incubes 37C Dilutions -1 Nombre de 295 colonies -2 37 -3 >15 -4 >15 -5 >15

3. Rsultats
Afin de dnombrer les bactries partir des diffrentes dilutions, on utilise la formule Colonies suivante : V (n1 *1 + n2 * 0,1) * d Pour les micro-organismes arobie 30C : 263 + 37 = 2763 1.1 * 10 1 Il y a donc 2763 micro-organismes arobie 30C dans 1mL deau

Pour les micro-organismes arobie 37C : 295 + 37 = 3018 1.1 *10 1 Il y a donc 2763 micro-organismes arobie 30C dans 1mL deau

D. Technique du nombre le plus probable : NPP

1. Principe
La technique du NPP fait appel la mthode de fermentation en tubes multiples, au cours de laquelle au moins trois dilutions dcimales de l'chantillon sont ensemences dans des prouvettes de bouillon et incubes une temprature prcise, pendant une priode donne. La mthode du NPP, drive des tudes de Mac Grady, consiste interprter les rsultats en comparant les trois essais et leur rsultats. Il sagit dune interprtation probabiliste.

2. Bactries concernes.

a) Coliformes
Les coliformes sont des entrobactries fermentant le lactose (avec dgagement gazeux) 30C . Les bactries correspondantes appartiennent aux genres Escherichia, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter.

b) Streptocoques fcaux
Les Streptocoques fcaux (Enterococcus ou Streptocoques D) sont des commensaux de lintestin. Le nombre de Streptocoques tant en gnral peu lev, on utilise dans un premier temps un milieu denrichissement relativement slectif, le milieu de Rothe. Un trouble microbien permet de conclure que dans les tubes correspondants a cultiv au moins un Streptocoque fcal prsum provenant e linoculum. On doit donc vrifier dans un deuxime temps si les bactries qui ont cultivs sont bien des streptocoques. On utilise laction de deux agents slectif en repiquant une anse des milieux positifs dans le milieu de Litsky.

3. Milieux utilises

a) Bouillon lactos au bromocrsol pourpre : BCP

La glose BCP est employe pour la recherche et le dnombrement de coliformes. Ces derniers, en fermentant le lactose, provoquent le virage de lindicateur colore et la production de gaz dans la cloche. En effet la fermentation du lactose se manifeste par la une production dacide qui provoque le virage du bromocrsol pourpre au jaune. Ce milieu ne contient pas dagent slectif (hormis le lactose), cette mthode nest donc pas spcifique ; elle est dite prsomptive. Tous les tubes prsentant fermentation du lactose avec gaz, sont susceptibles de contenir des coliformes. Ils doivent tre retenus pour les tests confirmatifs de lanalyse.

b) Rothe
Le milieu de Rothe est utilis pour la recherche et le dnombrement des Streptocoques fcaux. Il est constitu de Azide de sodium :Slectif des Streptocoques. Hydrolisat trypsique de casine : Source dazote. Peptone bactriologique : Source dazote. Glucose : Source de carbone. NaCl : pression osmotique Phosphate dipotassique et Phosphate monopotassique :dtermine le pH. Les tubes prsentant un trouble bactrien aprs incubation seront considre comme pouvant contenir des Streptocoques fcaux. Il seront obligatoirement soumis au test confirmatif laide du bouillon Litsky.

4. Ensemencement
Avant densemencer les tubes, il faut vrifier quil ny a pas de bulles dair sous la cloche, pour viter de fausser les rsultats. On prlve 1mL de chacune des dilutions que lon introduit dans chaque tube. Il faut agiter pour que linoculum soit rparti, y compris sous la cloche. On met les tubes incuber pendant 24 heures 30C.

5. Rsultats

a) Coliformes
Dnombrement des coliformes Dilutions 10-2 10-3 10-4 Groupements des +++ +++-rsultats Nombre 3 2 1 correspondant On choisi le chiffre321. Daprs la table de Mac Grady n=15 Nombre de bactries = n valeur de la dilution correspondant au premier chiffre Donc la solution initiale contient 1500 bactries environs. 10-5 --0

b) Entrocoques
Dnombrement 6

des coliformes Dilutions 10-2 10-3 Groupements des +++ +++ rsultats Nombre 3 3 correspondant On choisi le chiffre310. Daprs la table de Mac Grady n=4 Donc la solution initiale contient 400 bactries environs.

10-4 +-1

10-5 --0

6. Tests confirmatifs

a) Milieux utilises
(1) Bouillon de Litsky
Ce milieu est constitu de : Peptone : Source de carbone Glucose : Source de carbone. NaCl : pression osmotique Phosphate dipotassique et Phosphate monopotassique :dtermine le pH. Azothydrate de sodium : agent slectif Ethyl-violet : agent slectif Le milieu de Litsky nest quun milieu de Rothe additionn dthyl-violet. La prsence de streptocoques sy traduit par un trouble plus ou moins important et la formation dune pastille violette au fond du tube. Il est vivement souhaitable didentifier les streptocoques fcaux obtenus apr

(2) BLBVB
Ce milieu est utilis pour confirmer la prsence des coliformes en inhibant la plupart des autres germes. Lapparition de gaz en moins de 24 heures peut tre considre comme la preuve de la fermentation du lactose par les coliformes. Ce milieu est constitu de : Bile de buf : inhibe les bacilles Gram Vert brillant : agent slectif Lactose : Source de carbone (slectif) Peptone : Source de carbone Il ny a pas dindicateur de pH. La production de gaz ne se faisant pas partir des peptones, elle sera due la fermentation du lactose.

b) Rsultats
7. Isolement
Il est vivement recommand didentifier les bactries obtenues partir des milieux de Litsky et BLBVB. Nous allons donc effectuer un isolement sur une glose EMB partir du milieu BLBVB et une glose BEA partir du Bouillon Litsky. Lensemencement se fait daprs la mthode des cadrans. Lincubation des milieux slectifs se fait 37C pendant 24h.

a) Milieu losine et au bleu de mthylne (EMB)

Les colorants contenus dans le milieu (bleu de mthylne et eosine jauntre) inhibent la majeur partie de la flore Gram-positive ; bien que les entrobactries lactose-ngative puissent sy dvelopper, la culture des entrobactries lactose-positives y est nettement favorise, le reprage et la diffrenciation de leurs colonies y sont facilits. En effet les colonies de bactries lactose-positives sont violet fonc. Les colonies des bactries faiblement lactose-positives peuvent apparatre violet ple avec un centre plus ou moins marqu. Les colonies de bactries lactose- ngative sont des colonies gristres.

b) Glose Bile-Esculine-Azide :BEA

Ce milieu est constitu de : Pastone et peptone :Source dazote Extrait de levure : apport nutritif (acides amins) Bile de buf : inhibe les bacilles Gram Azide de sodium : inhibe les bacilles Gram NaCl : pression osmotique Citrate de sodium :??? Lesculine, celle-ci est hydrolyse en glucose et escultine. Ce dernier formant un complexe noir en prsence des ions ferriques apports par le citrate de fer ammoniacal. On observe :

III.Analyse dune eau peu contamine

Certains micro-organismes tant une concentration trs faible dans leau, il est logique denvisager que par filtration dun volume important deau, on puisse arrter sur le filtre toutes les bactries prsentes. Les pores du filtre doivent tre, bien sr, de dimensions infrieures celles des bactries. Une fois les micro-organismes recueillis, toute analyse peuttre faite en reportant le filtre sur un milieu adquat On a adopt la technique de filtration sur membrane (FM) pour l'analyse bactriologique de l'eau en 1951 aprs que l'on ait dmontr qu'elle pouvait donner des rsultats comparables ceux de la technique de fermentation multitube.

A. Mthode de filtration sur membranes

1. Matriel
Lappareil est un simple systme de filtration sous pression rduite (trompe eau). Il contient un support filtre qui reoit, sur une partie larges pores, la membrane de filtration. Le godet permet de recevoir leau analyser. Les deus partie doivent sassembler de manire solide par aimants, par caoutchoucs. Enfin, lensemble doit tre strilisable. Les membranes utilises (en ester de cellulose) sont quadrilles, et les pores ont un diamtre de 0.45 m.

2. Mode opratoire
Lensemble de lappareillage doit tre plac prs dun bec benzne, de manire mnager une zone de travail strile, et pouvoir striliser le matriel. Flamber lensemble du systme de filtration laide dthanol. Flamber une pince bout plat permettant de saisir les membranes sans les altrer. A laide de cette pince, on saisi la membrane dlicatement que lon va placer sur le support de filtre. Verse doucement 100mL de leau analyser. Faire le vide sans brutalit pour ne pas briser la membrane. Rincer, avec de leau strile, lensemble de lappareil, en particuliers les bords internes du godet. Scher la membrane. Dbrancher le tuyau vide avant le fermer le robinet. Retirer la membrane, laide de la pince. Poser la membrane sur le milieu en la roulant, de manire ne pas emprisonner de bulles d'air Incuber la temprature choisie

B. Milieux utilises
1. Glose lactos au TTC et Tergitol 7
Ce milieu permet la recherche et le dnombrement des coliformes, il est plus particulirement utilis pour la colimtrie des eaux, par la mthode des membranes filtrantes. Les coliformes donnent des colonies jaunes entoures dun halo jaune.

2. Glose de slanetz et Bartley

Ce milieu contient de lazide de sodium, agent slectif, et du chlorure de triphnylttrazolium dont la rduction se traduit par une coloration rouge des colonies de Streptococcus D faecalis. Primitivement utilis pour le contrle des eaux par la mthode des membranes filtrantes, ses applications se sont diversifie en bactriologie alimentaire. Lorsque le procd de filtration nest pas applicable, les mthodes classiques disolement permettent dobtenir de bons rsultats. Toutes les colonies rose ou rouge fonc (parfois presque marron) sont considres comme des colonies de streptocoques fcaux. La recherche est pratiquement toujours quantitative.

Conclusion Bibliographie
N. Marchal, J.L. Bourdon, Cl. Richard, Les milieux de culture pour lisolement et lidentification biochimique des bactries. Biologie applique, 1991, nouvelle dition, p.200, 206, 239. [2]C. Joffin, J-N Joffin, Microbiologie alimentaire. Collection Biologie technique, 1999, 5me dition, p.117, 185