Perkembangan Teknologi Kultur Sel Perkembangan awal adalah dipakainya antibiotik untuk menghambat pertumbuhan kontaminan Penggunaan tripsin

in untuk menghilangkan perlekatan sel pada subkultur Penggunaan zat kimia yang disebut medium kultur.

Apa manfaat kultur sel? Bidang ilmu dimana teknologi kultur sel memiliki peran utama. Sistem model untuk

Mempelajari dasar biologi sel, interaksi antar penyakit yang disebabkan agent dan sel, efek obat pada sel, proses penuaan dan studi nutrisi Uji toksisitas Studi efek penggunaan obat-obatan baru Riset kanker

Studi fungsi berbagai zat kimia, virus dan radiasi untuk mengubah sel kultur normal menjadi sel kanker Virologi Kultivasi virus untuk produksi vaksin, juga dipakai untuk mempelajari siklus infeksi. Rekayasa Gen

Produksi protein komersial, produksi virus skala besar untuk vaksin seperti polio, rabies, chicken pox, hepatitis B & campak Terapi Gen

Sel-sel yang memiliki gen fungsional dapat diganti dengan sel yang tidak memiliki gen fungsional Kultur Jaringan Kultivasi in vitro organ, jaringan dan sel pada suhu tertentu menggunakan inkubator dilengkapi dengan medium yang mengandung nutrien sel dan faktor-faktor pertumbuhan yang secara kolektif disebut kultur jaringan Berbagai jenis sel yang ditumbuhkan dalam kultur meliputi elemen jaringan ikat seperti fibroblas, otot skelet, otot jantung dan jaringan epitel (liver, payudara, kulit, ginjal) serta berbagai jenis sel tumor.

Kultur Primer Sel-sel hasil dari pembedahan atau secara enzimatik diambil dari organisme dan diletakkan pada lingkungan kultur yang cocok akan melekat dan tumbuh disebut sebagai kultur primer Sel-sel kultur primer umurnya pendek Kultur primer mengandung populasi sel yang sangat heterogen Sub kultur primer menghasilkan generasi cell lines Cell lines umurnya juga pendek, menghasilkan beberapa generasi sebelum akhirnya mati Sel seperti makrofag dan neuron tidak membelah secara in vitro sehingga dapat digunakan sebagai kultur primer

Keturunan sel yang berasal dari kultur primer disebut strain sel Kebanyakan cell lines tumbuh hanya beberapa generasi setelah itu akan berhenti Cell lines yang secara spontan atau diinduksi virus atau secara kimia akan berubah menjadi cell lines kontinyu Ciri cell lines kontinyu:

-lebih kecil, lebih bulat, kurang berikatan dan rasio nukleus/sitoplasma lebih tinggi -Pertumbuhan cepat dan jumlah kromosom aneuploid -serum dan ketergantungan perlekatan berkurang dan tumbuh lebih cepat dalam kondisi suspensi -mampu untuk tumbuh hingga kerapatan sel tinggi -berbagai fenotip dari jaringan donor -berhenti mengekspresikan gen jaringan spesifik Tipe sel Berdasar morfologi (bentuk dan penampakan) atau ciri-ciri fungsional dibagi menjadi tiga: Epithelial like-yang melekat ke substrat serta tampak memipih dan poligonal bentuknya Lymphoblast like- sel-sel tidak melekat tetapi tetap dalam suspensi dengan bentuk sferis Fibroblast like, sel-sel terikat substrat dan tampak memanjang atau bipolar

Mengapa harus subkultur.? Bila permukaan substrat sudah tertutup oleh sel (a confluent culture) maka pertumbuhan akan melambat dan berhenti.

Sel-sel yang dalam keadaan sehat dan tahapan tumbuh yang baik bisa disubkultur atau dipelihara untuk menghasilkan generasi baru Ini dilakukan saat mereka mencapai 80-90% confluency pada flask/dishes/plates

Enzim seperti trypsin, dipase, collagenase dalam kombinasi dengan EDTA akan memecah perekat sel dengan permukaan Kultur Sel Sel-sel dikultur sebagai anchorage dependent atau independent Cell lines yang berasal dari jaringan normal dianggap sebagai anchorage-dependent yang ahanya tumbuh pada substrat yang sesuai misalnaya sel-sel jaringan Sel-sel suspensi adalah anchorage-independent misalnya sel-sel darah Transformasi cell lines bisa tumbuh sebagai monolayer atau sebagai suspension

Sel-sel Adherent Merupakan sel-sel anchorage dependent Sel-sel dicuci dengan larutan PBS (bebas ca & mg ) Tambahkan trypsin/EDTA secukupnya untuk bisa membentuk monolayer Inkubasi pada suhu 37 C dalam plate selama 1-2 menit Tambahkan medium lengkap untuk memisahkan sel Bila tetap berikatan digunakan pipet sebagai bantuan Tambahkan medium lengkap sesuai subkulturnya

Suspensi Sel Lebih mudah untuk ditumbuhkan dan tak perlu memisahkannya Suspensi sel mudah mencapai konfluensi Dapat menggunakan 1/3 dari medium Medium dapat ditambahkan dengan jumlah yang sama (sebelumnya dihangatkan dulu)

Bekerja dengan cryopreserved cells Vial dari nitrogen cair ditempatkan pada air bersuhu 37 C water bath, vial diagitasi terus menerus hingga medium mencair Centrifuge 10 menit pada 1000 rpm di suhu kamar, seka ujung vial dengan 70% ethanol dan bauang supernatan

Suspensi kembali pellet sel dalam 1 ml medium lengkap dengan 20% FBS adan pindahkan ke culture plate berlabel yang mengandung medium dalam jumlah cukup Check kultur setelah 24 jam untuyk memastikan bahwa kulktur terikat baik pada plate Cganti medium saat warnanya berubah, gunakan 20% FBS hingga sel tetap

Pembekuan sel untuk disimpan Buang medium tumbuh, cuci sel dengan PBS dan buang PBS dengan dihisap Pisahkan sel dengan trypsin-versene Cairkan sel dengan medium tumbuh Transfer suspensi sel ke tabung reaksi 15 ml, centrifuge pada 200g selama 5 menit di suhu kamar dan bauang media tumbuh dengan dihisap Resuspensi sel dalam 1-2 ml medium pembeku Transfer sel ke cryovials, inkubasi cryovials pada suhu -80 C overnight Hari berikutnya transfer cryovials nitrogen cair

Viabilitas sel Viabilitas sel ditentukan dengan pewarnaan sel menggunakan trypan blue Trypan blue permeabel terhadap sel-sel non-viabel atau sel-sel mati Warnai sel dengan zat warna trypan dan amati dengan haemocytometer serta hitung persentase sel yang viable = Juml sel tak terwarna x 100 jumlah total sel Human cell lines -MCF-7 HL 60 HEK-293 HeLa kanker payudara Leukemia Human embryonic kidney Henrietta lacks

- % sel viable

Primate cell lines Vero Cos-7 African green monkey kidney epithelial cells African green monkey kidney cells

Dan lain-lain seperti CHO dari hamster, sf9 & sf21 dr serangga

Contaminant pada kultur sel Ada dua tipe Chemical-difficult untuk mendeteksi yang disebabkan oleh endotoxins, plasticizers, ion logam atau runut disinfectants yang tak nampak Penyebab biologis seperti mycoplasma, yeast, bacteria atau jamur juga dari kontaminasi silang dengan cell lines yang berbeda.

Efek kontaminasi biologis Mereka berkompetisi memperebutkan nutrien dari sel-sel inang Mensekresikan hasil samping yang bersifat alakalis atau asam yang menghentikan pertumbuhan sel-sel inang Mendegradasi arginine & purine yang menghambat sintesis histone dan asam nukleat Juga menghasilkan H2O2 yang secara langsung toksik thdp sel

Deteksi kontaminan Secara umum indikator adanya kontaminasi adalah mediua kultur menjadi keruh, laju pertumbuhan berubah, pH menjadi sangat tinggi, ikatan lemah, sel menjadi multi-inti, sel tampak berbintik, vacuolisasi, adanya benda2 mati dan sel lisis Yeast, bacteria & fungi biasanya menunjukkan efek tampak pada kultur (perubahan turbiditas atau pH) Mycoplasma dideteksi secara langsung dr pewarnaan DNA dengan substansi flourosensi seperti misalnya Hoechst 33258 Mycoplasma ajuga dideteksi dengan enzyme immunoassay melalui antiserum spesifik atau monoklonal atyau dengan amplifikasi PCR RNA mycoplasma Cara terbaik adalah mengeliminasi kontaminan secara langsung

Alat-alat dasar dalam kultur sel Laminar cabinet-Vertical lebih baik Fasilitas inkubasi- Suhu 25-30 C untuk serangga dan 37 C untuk sel mamalia, CO2 2-5% & 95% udara pada kelembaban relatif 99%. Untuk mencegah kematian sel, inkubator disetel pada suhu mendekati 38.5 C Lemari pendingin- medium cair pada suhu 4 C, enzymes (e.g. trypsin) & media components (e.g. glutamine & serum) at -20 C Microscope dengan perbesaran 10x to 100x

Aturan kerja kultur sel Jangan gunakan materia terkontaminasi dalam area steril Gunakan urutan yang benar bila kerja dengan lebih dari satu cell lines. Sel Diploid (Kultur primer, lines ujntuk produksi vaksin dsbnya) Sel Diploid (Laboratory lines) Line yang tumbuh kontinyu lambat Line yang tiumbuh kontinyu cepat Lines yang mungkin terkontaminasi

Line penghasil virus Kondisi akseptik dasar Gunakan Bunsen flame untuik memanasi udara sekitar Bunsen Lap semua ujung botol dan lehernya dengan 70% ethanol Panasi semua leher botol dan pipet dengan melewatkannya secara cepat ke bagian lampu yang paling panas Hindari meletakkan tutup atau pipet di meja, biasakan memegang tutup botol dengan jari Bekerjalah dari sebelah kanan atau kiri sehingga semua material tetap pada tempatnya setelah selesai Bersihkan tumpahan secara langsung dan tinggalkan laboratorium dalam keadaan bersih dan rapi

Aspek keamanan dalam kultur sel Sedapat mungkin jagalah agar kultur tetap bebas dari antibiotik agar dapat mengenali adanya kontaminasi Jangan pernah gunakan botol media yang sama untuk cell line yuang berbeda. Bila tutup jatuh atau tersentuh secara tak sengaja ganti dengan yang baru Leher botol atau gelas sebaiknya dipanaskan setidaknaya selama 60 dtk pada suhu 200 C Pindahkan ke laminar flow cabinet 20 menit sebelum mulai bekerja

Sel kultur yang biasanya dipakai harus di subcultered dan disimpan sebagai strains duplikat

Fakta lain .? Gunakan sel yang tumbuh aktif pada log phase pertumbuhan, dengan 80-90% viable Tetap paparkan pada trypsin secara minimum Perlakukan sel dengan hati2. Djangan sentrifus sel dengan kecepatan tinggi dalam meresuspensi sel Pemberian makan dan sub culturing sel lebih sering lalu gunakan serum yang mengandung kondisi yang diperlukan Gunakan konsentrasi yang lebih rendah dulu jumlah sel/ml untuk menginisiasi pertumbuhan