Tecnicas de cultivo bacteriano

Las clulas crecen por absorcin de materiales nutrientes, que utilizan como elementos
de construccin para producir nuevo protoplasma, cuando las clulas bacterianas
alcanzan la madures, su tamao mximo, se dividen en dos, y cada clula hija iniciara
una nueva vida independiente y nueva.
El periodo entre la formacin inicial de una bacteria y su divisin final en dos clulas hijas
recibe el nombre de tiempo de generacin, este vara para un tipo determinado de
bacterias. Tambin vara cuando el periodo de incubacin, las condiciones atmosfricas o
cualquier otro requisito de crecimiento sufren alteracin. Los tiempos de generacin de las
bacterias van desde 20 min. Hasta varias horas.
Durante esas primeras horas las clulas de ajustan a su nuevo medio, aumentan su
ndice metablico y entonces formaran nuevo protoplasma, todo ello preparndose para
una fase reproductiva.
El ritmo o velocidad de crecimiento de las bacterias se mantendr en tanto se disponga de
nutrientes abundantes, y se conserve la acumulacin de productos txicos bajo el nivel
crtico, esta fase puede extenderse debido a la alteracin del cambiante ambiente el que
se puede ver afectado por la aireacin del medio de cultivo, por ajustes del PH, por una
combinacin de tales procedimientos. Cuando no se verifica tal regulacin o intervencin,
el ambiente alterado har que entre el cultivo en la siguiente fase, la fase estacionaria.
Las condiciones bsicas para el buen crecimiento y desarrollo de cualquier organismo
incluyendo a las bacterias, son:
A) Un medio adecuado que proporcione nutrientes.
B) Una atmosfera adecuada.
C) Presin osmtica y PH adecuados.
D) Temperatura apropiada
E) Humedad.
Una atmosfera adecuada puede significar la presencia o ausencia de oxigeno, ola
provisin de otro medio gaseoso, algunos organismos tambin requieren de otras
condiciones atmosfricas, otros necesitan aumento de C02 o aumento de H2S
La presin osmtica adecuada se refiere por lo general a la concentracin de ion
hidrogeno en el medio, o sea el PH. Tambin puede referirse a la concentracin de sal y
azcar en los medios, igualmente la temperatura ms adecuada varia tambin, la
humedad es un requisito entre todos los seres vivos.
Consistencia adecuada del medio
Partiendo de un medio lquido podemos modificar su consistencia aadiendo productos
como albmina, gelatina o agar, con lo que obtendramos medios en estado semislido o
slido.
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Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos
microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de
fusin de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla.
Actualmente los medios slidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad,
pero hay tambin gran cantidad de medios lquidos cuyo uso est ampliamente extendido
en el laboratorio.

Presencia (o ausencia) de oxgeno y otros gases:
Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmsfera con tensin de oxgeno
normal. Algunas pueden obtener el oxgeno directamente de variados sustratos. Pero los
microorganismos anaerobios estrictos slo se desarrollarn adecuadamente en una
atmsfera sin oxgeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos
microaerfilos crecen mejor en condiciones atmosfricas parcialmente anaerobias
(tensin de oxgeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un
metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones.
Condiciones adecuadas de humedad:
Un nivel mnimo de humedad, tanto en el medio como en la atmsfera, es imprescindible
para un buen desarrollo de las clulas vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que
prever el mantenimiento de estas condiciones mnimas en las estufas de cultivo a 35-37C
proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para
el crecimiento de los cultivos y evitar as que se deseque el medio.
Luz ambiental:
La mayora de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en
presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sera el caso de los
microorganismos fotosintticos.
PH:
La concentracin de iones hidrgeno es muy importante para el crecimiento de los
microorganismos. La mayora de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro,
aunque los hay que requieren medios ms o menos cidos. No se debe olvidar que la
presencia de cidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano
pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metablicos normales.




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Temperatura:
Los microorganismos mesfilos crecen de forma ptima a temperaturas entre 15 y 43C.
Otros como los psicrfilos crecen a 0C y los temfilos a 80C o incluso a temperaturas
superiores (hipertemfilos). En lneas generales, los patgenos humanos crecen en
rangos de temperatura mucho ms cortos, alrededor de 37C, y los saproftos tienen
rangos ms amplios.

Esterilidad del medio:
Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estriles para evitar la aparicin
de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento
microbiano normal del o de los especimenes inoculados en dichos medios. El sistema
clsico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a
presin como agente esterilizante)
El periodo entre la formacin inicial de una bacteria y su divisin final en dos clulas hijas
recibe el nombre de tiempo de generacin.
Este tiempo de generacin varia para los diferentes tipos de bacterias. Tambin varia para
un tipo determinado de bacterias, cuando el periodo de incubacin, las condiciones
atmosfricas o cualquier otro requisito de crecimiento sufren alteracin, los tiempos de
generacin de las bacterias van desde 20 minutos hasta varias horas.
El primer periodo de ajuste y reconstitucin recibe el nombre de fase de retardacin, ya
que parece retardarse el aumento esperado en el nmero de los organismos.
Suponiendo que prevalezcan condiciones ptimas, los organismos se multiplicaran en la
siguiente fase, la fase log, a una velocidad gobernada por su tiempo mnimo de
generacin.
Para casi todo tipo de bacterias esto significa una duplicacin del nmero de organismos
viables cada 20 minutos. Este ritmo o velocidad de crecimiento se mantendr en tanto se
disponga de nutrientes abundante, y se conserve la acumulacin de productos txicos de
desecho bajo el nivel crtico. Puede extenderse esta fase por alteracin del cambiante
ambiente, el que se puede ver afectado por la aireaccion del medio de cultivo, por ajustes
del PH, por la aspiracin y sustitucin del medio, o por una combinacin de tales
procedimientos. Cuando no se verifica tal regulacin o intervencin, el ambiente alterado
har que entre el cultivo en la siguiente fase, la fase estacionaria.
Durante el curso de esta tercera fase, el cambiante ambiente llegara a un punto en el cual
el numero de organismos que mueren igualara al nmero de los que se reproducen. Esta
fase se conoce como fase estacionaria, ya que naturalmente el nmero de organismos
viables mantendr un equilibrio.
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La duracin de esta fase la determinaran la velocidad o ndice del agotamiento de
nutrientes, y la de acumulacin de desechos. Pronto provocara esto la fase final, la fase
de declinacin. Durante esta cuarta y ltima fase, el nmero de organismos que mueren
exceder del numero de los que se estn reproduciendo. Esta fase continuara hasta que
todos los organismos del cultivo hayan expirado.
Medio de cultivo en la placa de petri:
Mediante la incorporacin de un agente solidificante, como el agar, en un medio liquido,
resulta un gel solido cuando se vierte el medio de cultivo en una caja de petri, cuando
todava esta tibio, es decir a mas de 45 C. al extender una pequesima porcin de la
muestra, o bien una diminuta gota de un cultivo mixto en caldo, sobre la superficie de esta
placa. Colonias como recordaremos, son los descendientes de una solas bacteria,
agrupados en un montoncito visible.
Hay en la actualidad diferentes mtodos para extender o untar. Uno, fcil y eficaz, puede
llevarse a cabo as:
A) se usa un alambre delgado, o un asa de alambre o de platino para transferir el cultivo o
la muestra. Puede esterilizarse este alambre o asa entre una y otra colocndolos sobre
una flama de Bunsen hasta el rojo vivo.
B) el inoculo, cultivo o espcimen, se extienden en una capa muy delgada sobre una
pequea rea de la placa.
C) partiendo de esta rea se diluye el inoculo haciendo correr la serie de franjas
(regueros) desde esa rea se diluye el inoculo haciendo correr una serie de franjas desde
esa rea al resto de la placa siguiendo un patrn determinado.
Como la idea es diluir el inoculo, deben hacerse correr las franjas en un solo sentido,
evitando tocar otras franjas ya esparcidas, al hacer las siguientes: si el mtodo contiene
relativamente pocas bacterias, aparecern colonias aisladas a lo largo de las primeras
franjas o regueros.
El bacterilogo experimentado puede diferenciar muchas bacterias simplemente mirando
las colonias.
Las principales formas de los medios de cultivo son:
Entera o completa, ondulada, lobulada, dentada irregular, radialmente estirada y lobulada,
fimbriada, franjeada, rizoide, dentada, plana, elevada, convexa baja, aboveada,
umbronada, papilada convexa.
*Consistencia: la colonia puede ser butirosa, mucoide, translucida u opaca.
*Transparencia: la colonia puede ser transparente, traslucida u opaca.
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*Pigmentacin: los diferentes cultivos pueden producir todos los colores. Tambin es
frecuente que cambien la produccin de pigmento bajo condiciones variables.
Mtodos de inhibicin selectiva.
En bacteriologa mdica podemos ser frecuentemente selectivos en nuestro enfoque
cuando se trate de aislar agentes patgenos de ciertos especmenes.
Cuando sabemos cules bacterias no deseamos aislar, podemos crear condiciones que
impidan que esas bacterias indeseables crezcan.por desgracia nos encontraremos a
menudo con que estos mtodos que impiden que crescan las bacterias no deseadas,
tambin inhibirn las que deseamos.
Adems, es frecuente que los tecnlogos olviden, que aunque muchas condiciones
inhibidoras impiden el crecimiento de las bacterias que desean eliminar, pocas destruyen
en realidad esas bacterias. En consecuencia, a menudo consideran como cultivos puros a
muchas mezclas compuestas por colonias aparentemente puras, que estn creciendo
sobre otros tipos viables de bacterias.
Cuando se transfiere a la colonia con los contaminantes subyacentes a otro medio, para
un nuevo ensayo de la colonia es natural que los resultados sean pocos dignos de
confianza.
Sin perjuicio de lo anterior, varios mtodos de inhibicin selectiva dan excelentes
resultados cuando se les llega a usar cuidadosamente.
Algunos de estos mtodos de inhibicin selectiva muy frecuentemente usados son los
siguientes:
A) El crecimiento a altas o bajas temperaturas, para el aislamiento de termfilos y
psicrofilos respectivamente.
B) La incubacin anaerbica o aerobica naturalmente excluir a los aerobios y
anaerobios respectivamente.
C) La variacin del PH excluir a muchas bacterias.
D) La incorporacin de inhibidores especficos, como los antisueros y varios agentes
qumicos. Las sales biliares por ejemplo inhibirn a muchas bacterias
grampositivas.
Algunos mtodos especiales para cultivar bacterias merecen mayor atencin:
Cultivo anaerbico: En el curso de los aos se han empleado varios mtodos distintos
para el cultivo anaerbico de bacterias. Los siguientes se encuentran entre los mas
populares:
A) Medios liquidos: tales como el caldo de tioglicolato, el caldo de carne cocida y
otros, pueden servir para cultivar a casi todos los anaerobios, pero solo resultan
prcticos cuando son relativamente frescos.
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B) Frasco de spray: este es un frasco de diseo especial, con dos compartimientos,
donde asienta perfectamente la parte inferior de un disco de petri. Los dos
compartimientos quedan separados por un reborde bajo, situado en la parte
inferior del frasco.
C) Frascos de Gaspak: estos se han sustituido a los frascos de torbal
En los frascos de torbal se necesita reemplazar el oxigeno por el hidrogeno usando una
bomba de vaco, una fuente de hidrogeno y un catalizador interno. El frasco Gaspak sigue
un principio semejante al usado en la tcnica spray, presentando las ventajas adicionales
de contar con paquetes desechables de reactivos y un frasco ms grande en donde
caben 10 placas a la vez.
Se agregan cuidadosamente 10 ml. de agua a un gaspak desechable. Se colocan tanto el
gaspak como un indicador con los cultivos en el frasco y se cierra la tapa. Un catalizador
para la temperatura del interior har que ocurra una reaccin qumica que consuma todo
el oxigeno dentro del frasco en unos 30 min.
Cultivos para recuento de organismos viables.
Para calcular el nmero de bacterias viables que hay en una muestra liquida, o en un
cultivo liquido, puede seguirse una tcnica bastante simple.
Se pueden hacer diluciones de la muestra en caldo esteril en 1 ml, doblando o
decuplicando la dilucin. Cada ml de muestra diluida puede entonces mezclarse con un
medio de agar derretido a 45 y verterse la mezcla en una caja de petri. Al ocurrir la
incubacin apropiada se desarrollaran bacterias viables formando colonias detectables
que quedaran enterradas en el medio. Contando el numero de colonias producidas y
multiplicando estas por el factor de dilucin puede hacerse recuentos exactos del numero
de bacterias viables que haya en 1 ml de la muestra original.
Mtodo de dilucin.
Al diluir sultivos mixtos en caldo, se llegara a una dilucin final que solo contenga uno de
los tipos. Este mtodo solo ser til para separar un tipo de otro, o bien para separarlo de
otros tipos que en conjunto deben estar presentes en menores nmeros que aquel que
deseamos aislar.
Si no puede el lector visualizar perfectamente las dificultades y limitaciones de este
mtodo, trate de de obtener un saco que contenga digamos 200 bolitas rojas, 100 azules,
50 verdes, y 10 amarillas; con un total de 360.