Qumica Biolgica 2110. Microbiologa y Tcnico de Laboratorio. Ao 2008. Trabajo Prctico Nro.

6: PROTEINAS Objetivos: Demostrar el efecto de metales pesados, sales, cidos fuertes, y calor sobre la estabilidad de las protenas en solucin acuosa y demostrar a travs del uso de test estndares la deteccin de protenas presentes en distintos materiales. Determinar la concentracin proteica de 4 muestras complejas utilizando el mtodo de Bradford Introduccin: Las protenas son compuestos biolgicos constitudos principalmente por aminocidos (aa) unidos linealmente por enlaces peptdicos. Las protenas conocidas estn formadas por una combinacin de 20 aminocidos unidos en una secuencia determinada, propia de cada protena (estructura primaria). Una de las propiedades ms caractersticas de los aminocidos es su naturaleza anftera. En soluciones acuosas pueden encontrarse como iones bipolares o zwiteriones, los cuales en presencia de cidos se comportan como bases y toman protones mientras que en presencia de bases se comportan como cidos cediendo protones.

El trabajo prctico contar de dos partes: 1.- Reacciones de precipitacin y reconocimientos de protenas. 2.- Cuantificacin protenas segn el mtodo de Bradford. 1.- REACCIONES DE PRECIPITACIN DE PROTENAS. Las molculas proteicas pueden reaccionar unas con otras, tambin con iones de carga opuesta y con agua por ser sta un dipolo, ya que una protena tiene muchos grupos correspondientes a sus cadenas laterales, cargados positiva o negativamente (dependiendo del pH del medio en que se haya disuelta). Tendremos por lo tanto, interaccin protenaprotena, protena-H2O, protena-in. Si la interaccin protena-protena es grande y la interaccin protena- H2O es pequea, la protena ser insoluble. Si la interaccin protena - H2O es alta, entonces la protena tender a solubilizarse (altamente solvatada). Cualquier condicin que aumente la interaccin protena-protena o disminuya la interaccin protena- H2O disminuye la solubilidad de las protenas (le quita la capa de solvatacin).

Precipitacin por salado: grandes cantidades de una sal muy soluble agregada a una solucin de protenas, disminuye la interaccin protena- H2O porque le quita la capa de solvatacin, predominar la interaccin protena-protena y se producir la precipitacin. La concentracin salina a la que se produce la precipitacin no es igual para cualquier proteina, lo que permite usar sta propiedad para la separacin y purificacin de protenas particulares a partir de mezclas complejas. Comnmente se usa sulfato de amonio (NH4)2SO4 para tal fin, a causa de su gran solubilidad. La adicin gradual de sta sal permite el fraccionamiento de una mezcla de protenas, las cuales son precipitadas pero no desnaturalizadas, entonces un exceso de agua, por encima del punto de precipitacin, permite solubilizar nuevamente las protenas.

Efecto del calor: el calentamiento de las protenas en soluciones neutras produce alteraciones en sus propiedades, tales como disminucin de la solubilidad, prdida de la actividad especfica, prdida de sus caractersticas de cristalizacin. Conjunto de alteraciones que se las conoce como desnaturalizacin.
Formacin de sales: Efecto de metales pesados: las protenas son precipitadas de sus soluciones por sales de metales pesados, por combinacin del in metlico con la forma aninica de la protena. Las sales comnmente usadas son HgCl2 ZnCl2. Efecto de los cidos: las protenas pueden precipitarse de la solucin acuosa por la adicin de ciertos cidos tales como tricloroactico (TCA), perclrico, clorhdrico, los cuales forman con las protenas sales insolubles.

PARTE PRCTICA: A) Reactivos: Solucin de TCA al 5% (v/v en H2O) Solucin saturada de (NH4)2SO4 (o la sal) Solucin de HgCl2 (1% p/v en H2O) B) Tcnica: 1.- En una serie de 8 tubos de ensayo, colocar 1.5 ml de la muestra en 4 tubos y igual volumen de H2O en los restantes. 2.- Efecto de sales: A 2 tubos, uno conteniendo la muestra y el otro H2O, agregar el mismo volumen de la solucin saturada de (NH4)2SO4. Mezclar bien y colocar en bao de hielo. Observar y registrar el resultado. Luego agregar 5 ml de H2O. Cmo explica lo ocurrido? 3.- Efecto del calor: A 2 tubos, uno conteniendo la muestra y el otro H2O, calentar CUIDADOSAMENTE a la llama del mechero. Observar y registrar el resultado. Luego agregar 5 ml de H2O y observar lo que ocurre. 4.- Efecto de metales pesados: A 2 tubos, uno conteniendo la muestra y el otro H2O, agregar gota a gota solucin de HgCl2 1%. Observar y registrar el resultado. Luego agregar 5 ml de H2O y observar lo que ocurre.

5.- Efecto de cidos: A 2 tubos, uno conteniendo la muestra y el otro H2O, agregar gota a gota solucin de cido TCA al 5%. Observar y registrar el resultado. Luego agregar 5 ml de H2O y observar lo que ocurre. 2.- CUANTIFICACIN PROTENAS SEGN EL MTODO DE BRADFORD. La cuantificacin de protenas de manera exacta, confiable y reproducible es una de las cuestiones experimentales mas frecuente en un laboratorio bioqumico. Esto se debe a que la mayor parte de los datos experimentales son normalizados por la cantidad de protenas presentes en la muestra analizada. Se han desarrollado varios mtodos espectroscpicos para la cuantificacin de protenas. Todos ellos se mantienen vigentes, y se usan de acuerdo a la necesidad del experimentador. El ms simple de estos mtodos es la medicin de la absorbancia intrnseca de una protena en solucin en la regin UV (280 nm). Esta tcnica se basa en la absorcin intrnseca de los residuos aromticos que forman parte de la protena y por ello para cada protena se debe conocer su coeficiente de extincin molar () ya que ste vara de acuerdo a la composicin de aminocidos. Aunque este mtodo es muy exacto y muy simple, solo puede ser empleado para protenas puras de () conocido, en soluciones libres de sustancias interferentes en la absorcin en UV, y se debe disponer de cubetas de cuarzo. Adems existen 2 mtodos basados en la formacin de complejos con cobre: i) mtodo de Lowry y ii) mtodo de cido Bicinconnico. Ambos mtodos se basan en la reduccin del Cu2+ a Cu1+ por parte de las amidas. Esto los hace mtodos bastante precisos pero requieren de la preparacin de varios reactivos que deben ser cuidadosamente mezclados durante el ensayo, incubaciones muy precisas a temperaturas elevadas, y los compuestos coloreados resultantes son bastante inestables. Ambos ensayos adems presentan interferencias con diversas sustancias que suelen estar presentes en muestras biolgicas como lpidos, buffers, agentes reductores y detergentes. Esto conlleva a la preparacin de numerosos blancos de reaccin para descartar dichas interferencias. Por ltimo, el mtodo de Bradford es el ms empleado para la determinacin de protenas en una muestra compleja. Este ensayo se basa en el corrimiento del mximo de absorcin del colorante Azul de Coomasie G-250 desde 465 nm a 595 nm cuando esta unido a protenas. Bajo condiciones fuertemente cidas, la forma estable del colorante es la doblemente protonada que absorbe a 465 nm. Mientras que al unirse a protenas la forma estable es la desprotonada, de color azul que absorbe a 595 nm. La interaccin protena-colorante es estabilizada por interacciones inicas y sobre todo por interacciones hidrofbicas. Por esto, la relacin entre la aparicin de color y concentracin de protenas depender tambin de la composicin aminoacdica de la protena en estudio. La desventaja que presenta es que la relacin color/concentracin en lineal en un pequeo rango (1 25 g/mL). Como se puede deducir, no existe un mtodo ideal o de referencia, pero de los mtodos mencionados el ms empleado es el de Bradford por su rapidez y simplicidad y es el que se desarrollar en el TP.

A) Reactivos:

Solucion estndar de albmina srica bovina: Se utilizar una solucin madre de 100 g/mL con la cual se realizar la curva de calibrado del mtodo. Reactivo de Bradford: Disolver 20 mg de Coomasie G en 10 ml de etanol, agregar 20 ml de Acido fosfrico y diluir a 200 ml con H2O. Filtrar y conservar a 4 C a resguardo de la luz en frasco color caramelo. B) Tcnica:

Cada grupo realizar una curva de calibrado de albmina en las concentraciones finales indicadas en la tabla, y tendr una solucin problema a la cual determinar la concentracin a partir de la curva de calibrado construda.
1- Rotular

10 tubos eppendorf como B, T2, T4, T6, T8, T10, P1, P2, P3, P4. Los datos de estas muestras sern empleados en el TP siguiente. 2- Colocar en cada tubo la cantidad de H2O y solucin Standard de albmina segn se indica en la tabla. 3- Agregar 1 mL del reactivo de Bradford y agitar en vortex. 4- Incubar 5 minutos (y no ms de 15) a temperatura ambiente. 5- Leer absorbancia a 595 nm. 6-Preparar la curva de calibrado graficando la DO corregida de cada patrn en funcin de la concentracin de los mismos. 7- Determinar la concentracin de protenas en la muestra problema utilizando la curva elaborada anteriormente. Tubo B T2 (2 g) T4 (4 g) T6 (6 g) T8 (8 g) T10 (10 g) P1 (Problema) P2 (Problema) P3 (Problema) P4 (Problema) Standard BSA 0 L 20 L 40 L 60 L 80 L 100 L 0 L 0 L 0 L 0 L H2O 100 L 80 L 60 L 40 L 20 L 0 L 90 L 90 L 90 L 90 L Muestra 0 L 0 L 0 L 0 L 0 L 0 L 10 L 10 L 10 L 10 L DO DO corregida