UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

INGENIERA AGROINDUSTRIAL

DETERMINACIN DE BIOMASA
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA DE LOS PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES
PROFESOR: ALUMNA: CICLO: HORARIO:

ING. SNCHEZ GONZALES, JESS ALEXANDER MARTNEZ SALDAA, YURICO ELIZABETH IX JUEVES 11-1PM

TRUJILLO-PER 2012

LABORATORIO N 03.

DETERMINACIN DE BIOMASA PESO HMEDO, PESO SECO, TURBIDIMETRA

I.

OBJETIVOS

Determinar la concentracin en Peso hmedo (g mH/mL) y Peso Seco (g mS/mL) de una solucin celular y ver que mtodo es ms efectivo. Calcular el coeficiente de variabilidad de las tres repeticiones en Peso Hmedo y Peso Seco de la levadura de pan. Determinar la biomasa de una solucin celular desconocida mediante el mtodo de turbidimetra Determinar la cantidad de microorganismos en una muestra mediante la aplicacin de diferentes mtodos. Hallar el factor de conversin para cada caso, mediante la Curva de Calibracin. Determinar el Porcentaje de Error de los factores de Conversin, relacionando los datos. II. FUNDAMENTO TERICO

Biomasa es un trmino general que se refiere a los microorganismos presentes en un sistema. A la vez tambin se puede referir como la cantidad de clulas, de personas o masa de seres vivos. El objetivo de la biomasa es la reproduccin de clulas. La determinacin de la biomasa es una de las variables ms importantes de un bioproceso ya que su determinacin nos lleva a la comprensin de la eficiencia del mismo. Se trata de una variable clave para establecer las tasas de produccin, de consumo de nutrientes y el clculo de los balances de masa de cualquier proceso biolgico. Los mtodos clsicos de determinacin de biomasa son mtodos directos que se basan en el nmero de clulas o en el peso celular. Para determinar la biomasa es necesario calcular el nmero de clulas en una determinada muestra. Esto es importante en ciertas circunstancias; por ejemplo, para determinar la inocuidad de muchos alimentos o drogas se requiere cuantificar los microorganismos en esos productos. Los mtodos para estimar el nmero de microorganismos pueden medir la cantidad de clulas, la masa celular o la actividad celular. Los mtodos que cuantifican la cantidad de clulas son tiles principalmente para enumerar organismos como bacterias o levaduras, mientras los que miden la masa o actividad celular pueden utilizarse para todos los microorganismos, incluidos los hongos filamentosos, en los que es difcil cuantificar las clulas individuales.

A. Medida de biomasa La medida de la masa de los constituyentes de la clula bacteriana es utilizada frecuentemente como base para la medida de una actividad metablica, o de un constituyente metablico o qumico. Algunos de los mtodos para cuantificar la biomas son obvios y confiables, pero pueden volverse complicados si se busca exactitud. 1. Peso hmedo Se obtiene a partir de una muestra en suspensin que es pesada luego de la separacin de las clulas por filtracin o centrifugacin. Es una tcnica til para grandes volmenes de muestra. La principal desventaja es que el diluyente queda atrapado en el espacio intercelular y contribuye al peso total de la masa. La cantidad de lquido retenida puede ser importante, por ejemplo, un pellet de clulas bacterianas muy empaquetadas puede contener un espacio intercelular que aporta entre el 5-30% del peso, de acuerdo a la forma y deformacin celular. Para corregir el peso hmedo se determina la cantidad de lquido que queda retenida en el espacio intercelular luego de una centrifugacin, para ello se utilizan soluciones de polmeros no inicos (como el Dextran) que pueden ingresar en el espacio intercelular pero no pueden atravesar las paredes bacterianas. 2. Peso seco La cantidad total de biomasa presente en una muestra puede medirse en trminos de peso seco por unidad de volumen, ya sea como slidos en suspensin totales (SST) o slidos en suspensin voltiles (SSV). Las clulas se separan del lquido bien por centrifugacin bien por filtracin. Se expresan en g.m.s/mL. La principal desventaja de estas tcnicas es que su determinacin incluye no slo microorganismos activos sino microorganismos muertos, material inerte, polmeros extracelulares y materia orgnica adsorbida. Adems, no puede aplicarse cuando los sustratos a degradar son insolubles. Los mtodos gravimtricos son simples, pero consumen bastante tiempo y son poco reproducibles. A la vez este mtodo este mtodo los componentes voltiles de las clulas pueden perderse en el secado y puede existir alguna degradacin. Tambin la muestra seca pude recobrar humedad durante el pesado, principalmente si el ambiente tiene humedad relativa alta. 3. Absorcin Cuando un haz de luz paralelo (colimado) golpea una partcula en suspensin, parte de la luz es reflejada, parte es diseminada, parte es absorbida y parte es transmitida. La nefelometra mide la luz dispersada por una solucin de partculas. La turbidimetra mide la luz dispersada como un decrecimiento de la luz

transmitida a travs de la solucin. Con relacin a la longitud de onda y al tamao de la partcula pueden existir tres tipos de dispersin. Los mtodos de dispersin de la luz son las tcnicas ms utilizadas para monitorear el crecimiento de los cultivos bacterianos. Son muy tiles y poderosos pero pueden llevar a resultados errneos. Principalmente, dan informacin sobre el peso seco (contenido macromolecular). Turbidimetra

La turbidimetra mide la reduccin de la transmisin de luz debido a partculas de una suspensin y cuantifica la luz residual transmitida. Estudios tericos y experimentales han mostrado que soluciones diluidas de diferentes tipos de bacterias, independientemente del tamao celular, tienen casi la misma absorbancia por unidad de concentracin de peso seco. Esto quiere decir que, en soluciones diluidas, la absorbancia es directamente proporcional al peso seco, independientemente del tamao celular del microorganismo. Sin embargo, se encuentran absorbancias muy diferentes por partcula o por UFC (Unidad Formadora de Colonia) cuando los tamaos de las clulas bacterianas son diferentes. Por esta razn, para estimar el nmero de microorganismos totales o el nmero de microorganismos viables de una suspensin bacteriana debe realizarse una "curva de calibracin" con cada tipo de microorganismo, slo de esta forma es posible relacionar Absorbancia (Densidad ptica) con el nmero de microorganismos totales o con UFC.

Figura 1. Absorbancia en funcin del Peso Seco K: constante que vara con la longitud de onda utilizada y representa la inversa del peso seco del microorganismo que produce un aumento de 10 veces en el valor de la absorbancia (1/W 0). Peso seco: Concentracin celular bacteriana expresada en unidades de peso seco (g/ml-mg/ml).

La relacin directa entre la absorbancia y el peso seco slo se aplica para suspensiones diluidas de bacterias. Estas suspensiones no deben tener una absorbancia mayor a 0.3, ya que valores mayores producen desviaciones de la ley de Beer. Sin embargo, el inconveniente de utilizar suspensiones diluidas puede involucrar un mayor error de pipeteo y menor sensibilidad por el bajo nivel de absorcin.

Figura 2. Absorbancia en funcin del Peso Seco III. MATERIALES Y MTODOS A. Materiales e instrumentos Materiales Levadura de panificacin Fleishmann Agua destilada Tubos de ensayo Lminas cubreobjetos Vaso de precipitacin Pipeta Jeringa

Figura 3. Absorbancia en funcin del Nmero de Microorganismos Totales

Equipos Centrifugadora Microscopio Estufa (105C por 3 horas) Balanza electrnica Cmara de Neubauer Espectrofotmetro

B. Metodologa a) Para determinacin de Peso Hmedo Se tomaron muestras de 5 mL de la solucin inicial y se colocaron en tres tubos de ensayos previamente pesados. Luego los tubos son llevados a la centrifuga donde se hacen girar a 4 000 RPM, por un tiempo de 10 minutos. Luego pasamos a pesar cada tubo de ensayo en la balanza analtica, anotamos los pesos y luego promediamos. En Seco la solucin no tiene que estar muy diluida, con este mtodo se mide la levadura b) Para determinacin de Peso Seco Fleischmann Se tomaron muestras de 5 mL de la solucin inicial y se colocaron en tres tubos de ensayos previamente pesados. Los tubos de ensayo son llevados a la centrifuga donde se hacen girar a 4 000 RPM, por un tiempo de 10 minutos. Luego pasamos a pesar cada tubo de ensayo en la balanza analtica y anotamos los pesos. Posteriormente, se llevan los tubos a estufa, a una temperatura de 105 C por un tiempo promedio de 3 horas. Pasado el tiempo anotaremos, los pesos y luego pasamos a sacaremos un promedio.

Figura 4. Metodologa de Peso Hmedo y Peso Seco.

Las ecuaciones que se determinarn son: ( ( ) ) ( ( ) ( ( ) ( ) ( ) ) )

Hallaremos el coeficiente de Variabilidad de las 3 repeticiones. c) Para determinacin de turbidimetra Mtodo Indirecto

Se prepar una solucin acuosa con levadura, a partir de la cual se procedi a preparar diluciones ( 4/5, 3/5, 2/5, 1/10, 1/30, 1/50, 1/100) De la muestra original se tom 5 ml en dos tubos para determinar la concentracin en peso seco y peso hmedo. Para determinar la concentracin por conteo celular se tom una muestra de la dilucin 1/100. Con todas las diluciones y muestra original se procedi a colocarlas uno por uno en celdas para leer la absorbancia en el espectrofotmetro. Con estos datos se pas a realizar las siguientes graficas absorbancia vs peso seco, absorbancia vs peso hmedo y absorbancia vs conteo celular. Se prepar una solucin desconocida con la finalidad de determinar el porcentaje de error (%Error), en la realizacin de la prctica, utilizando los diferentes mtodos empleados.

Figura 5. Metodologa de Turbidimetra.

IV.

RESULTADOS Y DISCUSIONES A. Para Peso Seco y Peso Hmedo Tabla1. Peso Seco y Peso Hmedo de las muestras conocidas de 5ml

Muestra Original
A B C PROMEDIO S CV

W Tubo vaco(g)
7,4625 6,4196 9,7336 -

W tubo + muestra hmeda (g)

7,9003 6,8065 10,1598 -

W tubo + muestra seca (g)

7,5198 6,4859 9,80321 -

Peso en hmedo (g/mL)

0,0876 0,0774 0,0852 0,0834 0,0053 0,0730

Peso en seco (g/mL)

0,01146 0,01326 0,0139 0,0129 0,00128 0,0357

Tabla 2. Peso hmedo y peso seco de las muestras desconocida de 5 ml

W Tubo vaco(g)

W tubo + muestra hmeda (g)

W tubo + muestra seca (g)

Peso en Peso en seco hmedo (g/mL) (g/mL)

6,5821

6,7484

6,5989

0,03326

0,00336

B. Para Turbidimetra

En la Cmara Neubauer se escogi 5 celdas al azar para tener una muestra representativa de la cual se obtuvo una muestra original de 1210000000 cel. /ml.

Tabla 3. Peso Hmedo, peso Seco, Absorbancia y Conteo Celular de la muestra original y de cada dilucin. Diluciones Muestra original 4/5 Concentracin 0,80 Conteo celular (cel/ml) Absorbancia 1210000000 968000000 2,499 2,413 Peso hmedo (g/ml) 0,083393333 0,066714667 Peso hmedo (g/ml) 0,012880667 0,010304533

3/5 2/5 1/10 1/30 1/50 1/100

0,60 0,40 0,10 0,03 0,02 0,01

726000000 484000000 121000000 40333333,33 24200000 12100000

2,268 2,065 1,265 0,603 0,428 0,482

0,050036 0,033357333 0,008339333 0,002779778 0,001667867 0,000833933

0,008243627 0,006594901 0,005275921 0,004220737 0,003376589 0,002701272

ABSORBANCIA vs. PESO HMEDO

3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 Peso hmedo (g/ml) Absorbancia

y = 25.934x + 0.7018 R = 0.8682

0.07

0.08

0.09

Figura 6. Relacin absorbancia vs peso hmedo.

De la Muestra problema se obtuvo una absorbancia de 1.671 y 179000000 cel. /ml. Esto se obtuvo igual que para muestra original, escogiendo 5 cuadrados al azar en la cmara de Neubauer.

Tabla 4. Porcentaje de error Ecuacin y de la muestra en peso hmedo.

ECUACIN ABSORBANCIA PESO HMEDO REAL PESO HMEDO TERICO

25,93x + 0,701 1,671 0,03326 0,037408407

ERROR (%)

-12,47266161

ABSORBANCIA vs. PESO SECO

3.5 3 2.5 Absorbancia 2 1.5 1 0.5 0 0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.014 Peso seco (g/ml) y = 234.06x - 0.0653 R = 0.8408

Figura 7. Relacin absorbancia vs peso seco Tabla 5. Ecuacin y porcentaje de error de la muestra en peso seco ECUACIN ABSORBANCIA PESO SECO REAL PESO SECO TERICO ERROR (%) 234,0x - 0,065 1,671 0,00336 0,007418803 -120,7977208

ABSORBANCIA vs. CONTEO DE CLULAS

3.5 3 Absorbancia 2.5 2 1.5 1 0.5 0 0 500000000 1E+09 1.5E+09 Conteo de clulas (cel/ml) y = 2E-09x + 0.7018 R = 0.8682

Figura 8. Relacin absorbancia vs conteo celular Tabla 6. Ecuacin y porcentaje de error de la muestra en conteo celular ECUACIN ABSORBANCIA CONTEO DE CLULAS REAL CONTEO DE CLULAS TERICO ERROR (%) 2E-09x + 0,701 1,671 179000000 4,85E-10 100

Segn Arniz, et al (1992), el peso hmedo se obtiene a partir de una muestra en suspensin que es pesada luego de la separacin de las clulas por filtracin o centrifugacin. Demostrando una tcnica til para grandes volmenes de muestra. La principal desventaja es que el diluyente queda atrapado en el espacio intercelular y contribuye al peso total de la masa. Esto se puede contrastar en la Tabla 1, hay una diferencia entre el peso hmedo y el peso seco debido a que el primero contiene agua del diluyente de la solucin. Este peso hmedo tiene una masa de 0,0834 gramos lo cual representa a 1210000000 clulas. De modo que las clulas estarn hidratadas y gran parte de ellas podran ser visibles. Segn Gil (2003), el recuento de clulas por rea presentes en una solucin, su coeficiente de variacin se encuentra dentro de lo aceptable si no hay mucha diferencia significativa, ya que dentro de la determinacin de biomasa, su variacin poda ser significativamente cuando es menor (CV= 12,3 %),

indicando que la exactitud de la determinacin vara con los laboratorios y el personal. Esto se comprueba con las muestras de peso seco y hmedo calculadas donde se obtienen valores menores al mencionado: 7.304% en cuanto a peso hmedo y 3.57% en peso seco; de lo que hay un mnimo error significativo esto se puede atribuir por el pesado y una buena maniobrabilidad con los objetos de laboratorio. Segn Rodrguez, et al ( 2005), nos seala que para que sean visibles las trazas de turbidez es necesario ms de un milln de clulas por ml., como para ser medida por un espectrofotmetro. Por lo que la turbidimetra no es un mtodo til para medir la contaminacin de lquidos para un nmero relativamente pequeo de bacterias y o levaduras. Se comprob en la prctica con xito en el experimento ya que tanto la muestra original analizada como la muestra problema sobrepasaban dicha cantidad,; adems, todas las muestras de concentraciones diferentes se leyeron 550nm de longitud de onda, cercano a 540 nm, (longitud de onda comnmente utilizada para la determinacin de crecimiento por el mtodo de turbidimetra en las investigaciones). Segn Toro (2005), la relacin directa entre la absorbancia y el peso seco slo se aplica para suspensiones diluidas de bacterias. Sus absorbancias no deben ser mayores a 0.3, ya que valores mayores producen desviaciones. Esto se comprob con el peso Seco de la muestra problema, su peso real y su peso terico, presentando estos un % de error mayores y donde su absorbancia result 1.671. V. CONCLUSIONES Se determin la biomasa de la levadura Fleischamn mediante el mtodo de peso hmedo, peso seco y por turbidimetra, encontrando su Absorbancia y su variabilidad. La determinacin de biomasa mediante peso seco y peso hmedo es un mtodo fcil y rpido de realizar pero que tambin es un mtodo impreciso debido a diversos factores que se presentan en laboratorio. Encontramos el factor de conversin para cada caso, logrando construir la curva de calibracin y hallar el factor de conversin en los tres mtodos para determinar sus resultados tericos comparndolos con los reales, obtenidos en laboratorio. Determinamos el porcentaje de error. VI. RECOMENDACIONES

Para obtener una muestra homognea se debe agitar la muestra antes de colocarlas en las celdas y de esta manera evitar errores en las lecturas del espectrofotmetro.

 El llenado en las celdas de la cmara de Neubauer se debe hacer correctamente para evitar que se pierda parte de la muestra. Calibrar el espectofmetro antes de tomar las medidas, ya que este pudo haber sido utilizado con otras sustancias en experimentos anteriores. Del mismo modo calibrar la balanza analtica par que nuestro porcentaje de error sea mnimo. El llenado correcto de la muestra en la cmara, se debe realizar de modo que no se derrame en la lmina cubre objeto la solucin. De esta manera haremos el conteo.

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS ARNIZ,C., ISAC,L. Y LEBRATO, J. (2000).Determinacin de la biomasa en procesos biolgicos. Sevilla. GIL, E. (2003). Elementos clave en la uniformidad de distribucin de abonos. Escuela superior de

agricultura de Barcelona. RODRGUEZ, E., GAMBOA, M., HERNNDEZ, F Y GARCA, J. (2005). Bacteriologa General: Principios y prcticas de laboratorio. Editorial Universidad de Costa Rica. TORO R. (2005), Manual de Introduccin al Laboratorio De Microbiologa, editorial universidad de caldas, 2005.

ANEXOS