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ERE
Ab o Ad ???
Temario
Fundamentos
Definiciones bsicas Aspectos tericos
Instrumentacin
Elementos bsicos Columnas Inyectores Detectores y sistemas acoplados
Anlisis
cualitativo y cuantitativo
Cromatografa de lquidos
Mtodo fsico de separacin La muestra se distribuye entre dos fases
Fase estacionaria: slido o lquido Fase mvil: lquido o mezcla de lquidos
Elucin
La muestra se aplica al principio de la columna como una banda fina El eluyente tiene menor afinidad por la fase estacionaria que los solutos Los solutos avanzan por el sistema a velocidades diferentes, menores a la de la fase mvil Los solutos se separan en bandas que eluyen al final de la columna
Cromatografa
Gas Columna
Lquido Plano
CLS
CLL
CFE
CII
CE
CCF CP
CPG
CFG
Tipos de CL
PM < 2000 Cromatografa de intercambio inico Adsorcin: lquido-slido Particin: lquido-lquido Cromatografia en fase normal Cromatografia en fase inversa PM > 2000 Cromatografia de exclusin por tamao
Requisitos de la muestra
Soluble en la fase mvil Limpia No debe reaccionar con ningn componente del sistema cromatogrfico
Instrumentacin
Fase mvil Bomba de alta presin Gradiente de elucin
Muestra
Inyector
Control de temperatura
Columna
Detector
Registrador
Fase mvil
Disolventes grado cromatogrfico Agua de 18 m Baja viscosidad No vlatil Miscibilidad Filtrada Sin oxgeno disuelto (degasificada)
Fase mvil
Flujo = F = gasto en volumen del eluyente por unidad de tiempo . Se determina a la salida de la columna a temperatura ambiente (mL/min)
H = f (v)
Cromatografa
FM FE Inyector Detector
Proceso Cromatogrfico
La fase mvil fluye, arrastrando consigo los solutos Los solutos se reparten entre ambas fases
Fase mvil
Cromatografa de lquidos
Se realiza en columna Separacin por adsorcin y particin Diversidad de tcnicas en funcin de la muestra Anlisis cualitativo y cuantitativo Separaciones analticas y preparativas Anlisis de mezclas relativamente complejas
Dimensiones de columna
L
la
di dp
Fase estacionaria
Soportes de la FE
Permeacin o exclusin
Cuidados de la columna
Instalacin Introduccin de muestras limpias Contaminacin por fase mvil o muestra Almacenarla y guardarla de forma adecuada Lavarla despus de utilizarla con disoluciones reguladoras de pH
Precauciones
No exceder la presin de trabajo Cambios bruscos de presin Intervalo de pH adecuado No utilizar H+ y OH- concentrados Filtrar la muestra y la fase mvil w de la muestra=f (dimensiones de la columna)
Cromatografa
Fase Normal FE polar FM No-polar Fase Inversa FE No-polar FM polar
Fases estacionarias
Fases impregnadas
Cubren uniformemente el soporte Insolubles en la FM Compatibles con el detector El flujo de la FM no debe ser elevado
NO son Estables
Fases estacionarias
Fases qumicamente unidas phases) (Bonded
Unidas al soporte por enlaces covalentes Mayor eficiencia que las Fases impregnadas Costo elevado Son estables
H2O
Polaridad
Polaridad
Detectores
Indice de refraccin Ultravioleta-Visible Fluorescencia Electroqumico Radioactividad Infrarrojo Espectrmetro de masas
Instrumentacin
Fase mvil Bomba de alta presin Gradiente de elucin
Muestra
Inyector
Control de temperatura
Columna
Detector
Registrador
Elucin
de
Gradiente de elucin
Gradiente de elucin
Elucin
Proceso Cromatogrfico
El lecho cromatogrfico puede ser abierto (placa) o cerrado (columna) La fase mvil fluye a lo largo del lecho cromatogrfico en contacto con la fase estacionaria
Proceso Cromatogrfico
Las mleculas de soluto en fase estacionaria se estancan Las mleculas en fase mvil avanzan con ella
Mm m m m m M
Proceso Cromatogrfico
La velocidad del soluto vara inversamente con la afinidad por la fase estacionaria
Mm m m m
M M M
M M
H = f (v)
Ensanchamiento de banda
Ensanchamiento de banda
la
Transferencia de masa en la FE
Ensanchamiento de banda
la
Ensanchamiento de banda
la
H= f (ensanchamiento de la banda)
HL = 2 DM / v k 2 vt a HS = 2 1+k HD = vdp2 / DM HM = HF + HD (1- + k)2 dp2v 30(1-)(1+k)2DM
HF = 2dp
HSM =
H = f (ensanchamiento de la banda)
H=L/N H = HL + HS + HM + HSM H = HS + HM + HSM
Ventajas
Anlisis de compuestos inicos, de alto peso molecular Diversidad de columnas y detectores Formacin de derivados pre-columna y post-columna Separaciones con control de pH Separaciones preparativas
Limitantes
Muestras relativamente limpias Solubilidad de la muestra en la fase mvil Viscosidad de la fase mvil Dimensiones de la columna Presin de trabajo Intervalo de pH Utilizar un filtro (pre-columna)
Cromatografa de Lquidos
Formacin de derivados
ERE
Derivados
Fuera de lnea En lnea Pre-columna Post-columna
Derivados
Derivados
Cromatografa de Lquidos
Aplicaciones
ERE
CCF - CLAE
FE = f (dimetro interno)
Diferente
Cambio de
Aplicacin
Aminas
Aplicacin
Fluorescencia
Polar - No polar
Qu sucedi ???
Sensibilidad
Sensibilidad
Peso molecular
Propiedades = f (PM)
Oligosacridos
Oligoglucosa
Ejemplos
Campo Frmacos Mezclas tpicas Antibiticos, sedantes, esteroides, analgsicos Bioqumica Amincidos, protenas, carbohidratos, lpidos Alimentos Edulcorantes, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos Contaminantes Pesticidas, herbicidas, PCB, fenoles Qumica Drogas, venenos, alcohol en forense sangre, narcticos