Mtodos de estudio y cultivo de virus

Dra. Ana Marta de los ngeles Lobo Snchez Zaira Guerrero Gonzlez

Los sistemas celulares utilizados para propagar los virus en el laboratorio son:

1.Animales de experimentacin 2.Embriones animales 3.Cultivos celulares artificiales

Cultivo en huevo frtil de ave

cuerpos intracelulares Viruela aves

tripsina

1929. Ernest William Goodpasture y Woodruff

estudio y propagacin

1935.virus gripal

patgeno para los pollos

Agua

Replicacin en clulas vivas

Protenas Aminocidos (AA) Carbohidratos Lpidos / Grasas Vitaminas Liposolubles

Husped especfico Tropismo

Embrin de pollo

Componentes

. y mem. extraembrionarias

sustratos variados

Vitaminas Hidrosolubles Minerales

Otros Componentes

Desarrollo del Embrin del Pollo

Viabilidad del embrin

Ubicacin del embrin

Cmara de aire

Infeccin: lesin tisular local (pstula)

Cantidad del inculo

Intraperitoneal, o intracerebral

Temperatura

Dilucin

Tiempo de incubacin

Vas de inoculacin
Inoculacin por saco alantoideo

Con colorante se observa: liquido alantoideo, albumina y cmara de aire teidos

Liquido alantoideo: virus hemaglutinantes o produccin de hemaglutininas Embrin de 9-12 das, inoculo de 0.10.2ml

3 mm

45
1cm

Inoculacin en saco amnitico

Con colorante: lquido amnitico, cmara de aire Primoaislamiento de cepas de influenza Embrin de 7-15 das, inoculo de 0.10.2ml

Inoculacin en saco vitelino

Con colorante: Saco vitelino, Cmara de aire Cultivo de clamidias y ricketsias Embriones de 5-8das, inoculo de 0.2-1ml

Inoculacin en saco vitelino

Inoculacin en Membrana corioalantoidea (MCA)

Con colorante: corioalantoidea membrana

Permite cuantificar aquellos grupos virales que producen lesiones localizadas Embrion de 10-12 das, inoculo de 0.10.5ml

Inoculacin de membrana corioalantoidea (MCA)

MEMBRANA

VIRUS

TIPO DE EMBRIN
Se emplean embriones de 5 8 das Se emplean embriones de 10 12 das

CANTIDAD DE INOCULACIN
0.2 1 ml

SIGNOS DE CRECIMIENTO
Muerte

Saco vitelino

Herpes simple Neumona y Rickettsias Herpes simple Poxvirus Sarcoma de Rous Varicela Virus de Laringotraqueitis aviar Enfermedad de Beyer Influenza New Castle Virus de la bronquitis infecciosa Parotiditis Virus de la Gripe Virus de la Leucemia Virus del herpes Rabia

Cariolantoes

0.1 0.5 ml

Muerte Pstulas Pstulas Focos o pstulas fcilmente visibles

Alantoides

Se emplean embriones de 9 12 das 7 15 das

0.1 0.2 ml

Hemoglutinacin

Amnitica

0.1 0.2 ml

Muerte

Intravenosa

10 - 15 das

0.02 - 0.05 ml.

Pstulas

Intracerebral

8 14 das

0.01 0.02 ml

Alteraciones cerebrales

VENTAJAS
Control preciso y fino del medio ambiente (fcil manipulacin) Caracterizacin y homogeneidad de la muestra Economa

DESVENTAJAS
tcnica sensible calidad y costos Inestabilidad Apreciacin difcil durante los tres primeros das de edad del embrin

No es necesario el espacio ni el cuidado que requieren los animales.

Mantenimiento de los cultivos celulares.
Se pueden cuantificar aveces al correlacionar el numero de pustulas con la dilucin viral inoculada. (Herpes y vaccinia). Se emplea para preparar vacunas (influenza, fiebre amarilla) Aislamiento para diagnostico (viruela, herpes, influenza) Hacer ensayos de nuevos agentes virales

Capacidad de anclaje

clasificacin

Monocapa

Suspencin

Discontinuas (t limitado) Lineas celulares Continuas

Cultivos primarios Clulas diploides Multiplicacin indefinida

La inoculacin en animales de experimentacin de muestras clnicas o de virus para su aislamiento o propagacin. Poco usada Se emplea nicamente cuando se trata de propagar virus cuya replicacin en los otros sistemas no es posible. Los animales ms utilizados: monos, los cobayos y los ratones lactantes

La inoculacin animal sigue siendo un mtodo de gran valor para estudiar: La oncognesis viral La patologa de los padecimientos virales La respuesta inmune a los virus El efecto de los factores ambientales sobre infecciones virales

 cambios bioqumicos y moleculares, morfolgicos y de viabilidad celular, visibles a microscopa ptica, causados durante el ciclo de replicacin viral. Aunque todos los virus lticos producen efecto citoptico, puede observarse una gran diversidad de manifestaciones

En clulas infectadas en cultivo, en las que se aprecia: prdida de adherencia al sustrato inhibicin por contacto redondeamiento celular formacin de sincitios cuerpos de inclusin citoslicos transformacin celular lisis, etc.

 Es la conclusin del conjunto de alteraciones celulares que se producen, secuencial o simultneamente en la clula infectada, liberando finalmente al medio las nuevas partculas virales.

 Muchos tipos de virus inducen la aparicin de estructuras membranosas en el citoplasma, en algunos casos en forma de grandes vacuolas citoplasmticas o pequeas.

 Los sincicios son grupos de clulas fusionadas apreciables como una masa celular multinucleada

 Es una alteracin en el crecimiento normal de las clulas en cultivo con evidentes manifestaciones morfolgicas. Se asocia a una serie de cambio moleculares y est especialmente ligada a virus que insertan su genoma en el de la clula infectada, pudiendo causar mutagnesis insercional al interrumpir antioncogenes o activar pro-oncogenes, o alterando la correcta regulacin de la expresin gnica celular.

 Las alteraciones bioqumicas son muy diversas y especficas de cada virus, si bien pueden sealarse las ms importantes a nivel general. Algunos virus son capaces de mostrar esta inhibicin en etapas tempranas de la infeccin pero la mayora de los virus animales lo hacen en etapas tardas. El efecto ms drstico suele producirse en la inhibicin de la expresin de protenas celulares por traduccin preferente o casi exclusiva de protenas virales.

 1.- Inhibicin de la sntesis de protenas celulares 2.- Inhibicin de la sntesis de DNA celular 3.- Inhibicin de la sntesis de RNA celular

 Cambios en la actividad de enzimas presentes en las membranas. Modificaciones en la funcionalidad del sistema vesicular.

Aumento de la permeabilidad de la membrana plasmtica.