Escuela acadmico profesional de Biologa y Microbiologa

AISLAMIENTO DE FRANKIA SP.

ASIGNATURA DOCENTE ALUMNAS

: Microbiologa de Suelos : Blgo. Isabel Ancco : [06-29559] Ana Julissa Naquiche Calero [07-30712] Gricel Marilia Martnez Roncal

AO

: 5to ao

TACNA PERU 2011

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INTRODUCCIN

Frankia es una bacteria filamentosa o actinomiceto, fijadora de nitrgeno, que cuando vive en asociacin con ciertas plantas, induce en sus races la formacin de ndulos fijadores de nitrgeno. Los beneficios de esta simbiosis se conocen desde hace muchos aos y ya desde 1886 se supona que el endofito de estas plantas era microbiano. Se han encontrado evidencias fsiles del Pleistoceno del rbol aile o aliso cuyos ndulos albergaban actinomicetos en su interior. Sin embargo no fu sino hasta 1978 en que el grupo del Dr. Torrey, en la Universidad de Harvard, logr aislar y hacer cultivos puros del actinomiceto Frankia. La simbiosis formada por la bacteria Frankia y el ndulo radical de la planta se conoce con el trmino de actinorriza. Se han descrito en la actualidad alrededor de 200 especies de angiospermas, llamadas Plantas Actinorrzicas, distribudas en ocho familias botnicas, que son portadoras de ndulos radicales fijadores de nitrgeno formados por Frankia. El hecho de que esta bacteria filamentosa haga simbiosis con miembros de varias familias, muestra una de las grandes diferencias que existen entre ella y la otra bacteria simbitica fijadora de nitrgeno, Rhizobium, cuyos gneros hospederos pertenecen en su mayora a la familia de las leguminosas. La capacidad de adaptacin de las plantas actinorrzicas a suelos marginales seguramente est relacionada no solo a su capacidad de autoabastecerse de nitrgeno a travs de su simbiosis con Frankia, sino tambin a que se asocian con hongos endo y ectomicorrzicos, simbiosis que las provee de muchos nutrientes, sobretodo de fsforo. Algunas de estas plantas responden a la falta de fsforo en el suelo con la formacin de races protoides o races en racimo, lo que les permite captar mas eficientemente el poco fsforo disponible en el suelo.

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Este tipo de races se llaman proteoides porque fueron observadas por primera vez en la familia Proteaceae y posteriormente han sido observadas tambin en las leguminosas y en las plantas actinorrzicas. Se trata de grupos densos de raicillas de la misma longitud que producen gran cantidad de pelos y ocurren en intervalos a lo largo de las races laterales dando la impresin de ser un cepilln de botellas.

Fig. 01. Esquema de raz lateral de una planta actinorrzica con races protoides o agrupadas, con muchos pelos, que les permiten capturar nutrientes.

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En resumen, las plantas actinorrzicas son capaces de formar varias y diferentes asociaciones con microorganismos del suelo

Fig. 02. Esquema de una relacin tetrapartita, es decir, un rbol actinorrzico asociado con 3 diferentes microorganismos del suelo formando diferentes tipos de simbiosis, ndulos fijadores de N2, ectomicorriza y micorriza arbuscular.

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I.

GENERALIDADES Esta revisin debe enfocar la bacteria Frankia, su morfologa, su fisiologa, su gentica y ecologa. Sin embargo, no nos parece que est de mas conocer un poco a las plantas que la alojan en sus races, ya que hemos escuchado poco de ellas. Quiz el lector se anime a buscar en las altiplanicies de los pases tropicales otras plantas que no han sido descritas como actinorrzicas, como nosotros, que tuvimos esta emocionante experiencia. Es en los pases templados donde se han hecho la mayora de las exploraciones. Esperemos que al conocer este recurso natural, tambin podamos motivar a los estudiantes a estudiar la bacteria.

II.

LAS PLANTAS HOSPEDERAS Las plantas actinorrzicas son arbustos o rboles que habitan muy diversos ecosistemas y se adaptan a condiciones ambientales extremas como suelos salinos, terrenos pantanosos y ambientes polares. Todas estas plantas tienen en comn que son de rpido crecimiento y una gran capacidad de crecer en suelos de baja fertilidad o despus de algn disturbio (como erupciones volcnicas e incendios), y son frecuentemente las pioneras en el desarrollo de la sucesion de la comunidad vegetal Ninguna de las especies hospederas de Frankia son plantas de inters agrcolas; estas plantas tienen importancia econmica como productoras de madera y de lea, son de inters silvcola, recuperacin de terrenos y algunas en jardinera. Aunque no se conocen usos agrcolas de estas plantas, los frutos de algunas de ellas son de consumo humano en Europa como es el mirto de mar (Hippophe rhamnoides ), cuyos frutos son ricos en vitamina C, E y F, carotenos, y los actualmente muy mencionados cidos omega 3 y omega 6 (cidos linoleco y linolnico); con estos frutos se prepara cidra, cerveza y jaleas Las plantas actinorrzicas son principalmente templadas, a diferencia de las leguminosas que son en su mayora y originalmente del trpico. Muchas de estas

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plantas son muy importantes en pases de latitud alta donde las condiciones no son favorables para las leguminosas y s para las actinorrzicas permitindoles un crecimiento vigoroso. En los perodos glacial y post-glacial fueron muy abundantes en Amrica del Norte y en Europa donde colonizaron los depsitos glaciales pobres en nitrgeno y aceleraron el desarrollo del suelo con incorporacin de materia orgnica rica en nitrgeno. El significado de la simbiosis actinorrzica es su valor ecolgico, no solo porque son plantas que se adapten a los suelos empobrecidos y a ambientes extremos o porque sean especies pioneras, sino porque adems, esta simbiosis tiene un papel ecolgico en el balance global del nitrgeno e incrementa la productividad de muchas comunidades vegetales vecinas. Utilizando los mismos mtodos de medicin, las cantidades de nitrgeno fijado por estas plantas usualmente son mas grandes o comparables con las cantidades fijadas por las leguminosas; se considera que las tasas de acumulacin anual de nitrgeno van de 60 a 320 kg/ha/ao en plantaciones de aile . El incremento de la productividad de los sitios en las comunidades de plantas vecinas se explica por diferentes razones: 1) se incorpora nitrgeno al suelo a travs de hojarasca que cae al mismo 2) se transfiere parte del nitrgeno que ellas fijan hacia las plantas vecinas a travs de la red subterrnea de hifas de la ectomicorriza que va de unas plantas a otras 3) el nitrgeno orgnico se mineraliza rpidamente en las plantaciones donde hay plantas actinorrzicas; la cantidad de nitrgeno mineralizado en las plantaciones de Elaeagnus umbellata llega hasta 236 kg por hectrea en un ao. La distribucin filogentica de estas plantas entre las angiospermas ha conducido a muchas dudas en cuanto a la evolucin de las simbiosis fijadoras de nitrgeno. Cronquist hace el siguiente esquema de clasificacin con base en caractres morfolgicos: tres de las familias actinorrzicas (Betulaceae, Casuarinaceae y Myricaceae) se agrupan en la subclase Hamamelidae, otras tres (Elaeagnaceae,

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Rhamnaceae y Rosaceae) se agrupan en la subclase Rosidae y las otras dos familias (Datiscaceae y Coriariaceae) en otras dos subclases (Dilleniidae y Magnolidae). Sin embargo, la introduccin de la filogenia molecular ha dado resultados muy interesantes y se ha mostrado que las simbiosis rhizobiana y actinorrzicas forman un solo grupo y apoyan un solo origen de la predisposicin a la simbiosis. Un estudio ms profundo sobre el anlisis de secuenciacin de nucletidos del gene del cloroplasto que codifica para la subunidad grande de la ribulosa-1,5-bifosfato carboxilasa/oxigenasa (Rubisco), reafirma que todas las plantas noduladas forman un grupo coherente e indica mltiples orgenes de la simbiosis dentro del grupo Finalmente, nos gustara comentar que un rbol actinorrzico nativo de Mxico, el aile o aliso (Alnus sp.) muestra que tiene la potencialidad de ser usado con xito en restauracin ecolgica, problema que requiere solucin urgente en Mxico (y en todo el planeta). En Mxico otro rbol actinorrzico ha dado buenos frutos, se trata de Casuarina. Esta planta, capaz de crecer en arena, fue introducida para estabilizar los mdanos de la costa del Golfo de Mxico (y evitar que el mar le ganara terreno al continente) y como cortina para proteger a las poblaciones cercanas al puerto de Veracruz de la lluvia de arena y sales producida por el arrasador y veloz viento del norte. Es tambin un rbol capaz de tolerar la adversidad de los ejes viales de la ciudad de Mxico; ha podido crecer y fructificar en esas condiciones.

III.

LOS NDULOS Los ndulos actinorrzicos son perennes y tienen forma de estructuras coraloides con muchos lbulos; cada lbulo es una raz lateral modificada. El tamao de los ndulos vara con la planta de la que se trate y es muy comn encontrar en el campo ndulos de 3 a 5 cm de dimetro; nosotros encontramos uno de 15 cm en las races de Alnus accuminata

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En los ndulos de las leguminosas el tejido vascular se bifurca rodeando a las clulas infectadas por Rhizobium, mientras que en los ndulos actinorrzicos el tejido vascular se encuentra en la parte central y, hacia los lados, en el cortex, se encuentran las clulas que contienen a la bacteria Frankia. Adems de la estructura, tambin la ontogenia de los ndulos es diferente en las leguminosas; en stas el primordio del ndulo se forma en el cortex, mientras que en las plantas actinorrzicas se forma en el periciclo, de manera que la bacteria tiene que atravesar casi o todo el cortex de la raz para llegar a las clulas nodulares. Los ndulos fijadores de N2 generalmente se forman y funcionan en las races (en el suelo), aunque se han descrito ndulos areos formados en el tallo de algunas leguminosas; en algunas plantas actinorrzicas tambin se han encontrado ndulos caulinares como en Casuarina cunninghamiana y en C. equisetifolia. El desarrollo de una interaccin simbitica involucra cierta diferenciacin del microsimbionte o endofito. En el caso de Frankia, su diferenciacin depende de la especie de la planta, que determina la morfologa de las vesculas (en algunos casos las vesculas no se forman, como en los ndulos de Casuarina), as como su localizacin en las clulas infectadas. La planta tambin determina el sitio de penetracin de la bacteria (ya sea por los pelos radicales o intercelularmente), la extensin de la infeccin y el nmero de ndulos.

IV.

LA BACTERIA Frankia es un procarionte gram-positivo con hifas o filamentos septados, con una composicin de su ADN de 70% de guanina mas citosina. Este alto contenido de GC est tambin presente en otros actinomicetos como Geodermatophilus; en otras bacterias fijadoras de nitrgeno este nivel es mas bajo. Otra gran diferencia con Rhizobium es que Frankia fija nitrogeno in vitro bajo las condiciones normales de presin y temperatura; si bien Azorhizobium tambin fija N2 in vitro, es un genero genticamente muy diferente a los otros miembros de la familia Rhizobiaceae Son bacterias microaeroflicas cuando utilizan nitrgeno atmosfrico (N2) para crecer y

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son absolutamente aerobias cuando se les proporciona nitrgeno combinado (NH3) en el medio de cultivo.

4.1 Morfologa. Morfolgicamente Frankia es un organismo complejo, presenta un crecimiento pleomrfico; crecen en forma de filamentos y, como la mayora de los actinomicetos, las hifas se diferencian en esporangios. Estos contienen en su interior gran cantidad de esporas en estado latente que germinan para formar hifas cuando encuentran condiciones ambientales adecuadas. Todava no se sabe con precisin, cules son los factores que influyen en la formacin de esporangios ni en la germinacin de las esporas.

Fig.03. Esporangios multiloculares llenos de esporas, de la bacteria filamentosa Frankia. Algunos tienen aspecto de mazorca de maz redondas o alargadas.

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Las hifas tambin pueden diferenciarse para formar una estructura que constituye un rasgo sobresaliente de Frankia, la vescula. Esta estructura est especializada en la fijacin de nitrgeno atmosfrico. Las vesculas se desarrollan como un hinchamiento de las hifas ramificadas lateralmente, son redondas y de pared gruesa La funcin de la vescula es proteger a la nitrogenasa del efecto negativo del O2. La nitrogenasa est localizada en el interior de las vesculas y es la enzima encargada de la fijacin de nitrgeno, es decir, de la transformacin del nitrgeno no asimilable por la planta (N2) a una forma asimilable (NH3). A mayor concentracin de oxgeno en el medio, la pared envolvente tambin aumenta y las vesculas se evidencian al microscopio con mayor refringencia Las especies de Frankia crecen muy lentamente in vitro, no forman micelio areo en medio de cultivo solidificado por lo que se les propaga en medio lquido donde el conjunto de filamentos tiene el aspecto de copos de nieve.

4.2 Aislamiento Para aislar Frankia de los ndulos, los lbulos de los mismos despus de desinfectarse cuidadosamente, se colocan en medio lquido o en medio slido. En ocasiones, despus de un mes de incubacin se logra obtener una colonia de unos milmetros; a veces el perodo de incubacin puede ser de 6 meses. Muy pocas cepas de Frankia son cultivables; aquellas que pueden cultivarse son las ms saprofticas o con requerimientos nutricionales menos estrictos, como son las cepas de las Betulceas (Alnus). En otros casos, como en Casuarina, la mayora de las cepas se encuentran dentro de los ndulos radicales y son muy pocas las cultivables. De muchas otras plantas como Adolphia, Datisca, Ceanothus, Dryas, hasta la fecha no se ha podido aislar su microsimbionte fijador de nitrgeno.

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4.3 Taxonoma La taxonoma del gnero se debe a Becking) quien propuso que el nombre Frankia resurgiera en honor del microbilogo suizo A. B. Frank, quien acu el trmino simbiosis. El coloc al gnero en la familia Frankiaceae del orden Actinomycetales. El mismo autor cre 10 especies de acuerdo a la especificidad de Frankia para nodular plantas, segn la usanza de los taxonomistas de Rhizobium de esa poca. En la actualidad, se aceptan tres grupos de plantas, llamados grupos de especificidad de hospedero. Estos grupos se basan en la especificidad que muestran las cepas cultivables para inducir la formacin de ndulos en ciertas plantas. La validez de estos grupos se han confirmado con tcnicas modernas de anlisis gentico. Hay excepciones, como son algunas cepas de Alnus con capacidad de nodular Elaeagnus y las cepas aisladas de Gymnostoma que tambin nodulan Elaeagnus. Entre las plantas, tambin hay algunas que son poco selectivas en cuanto a su compaero bacteriano y no muestras preferencia por cepas especficas, lo que resulta en que forman ndulos con cepas de Frankia que nodulan otras plantas, como es el caso de Myrica y Gymnostoma.

V.

LA BACTERIA EN EL SUELO. El nmero de propgulos de Frankia presentes en el suelo est en pequeas cantidades, lo que limita los tipos de ensayos que se puedan hacer para contar la bacteria en el suelo. Adems, su aislamiento directo del suelo es muy difcil, de hecho solo ha sido reportado una sola vez. Su presencia en el suelo ha sido comprobada y cuantificada a travs de bioensayos utilizando plantas hospederas y verificando su nodulacin, su nmero va de 0-4600 unidades de nodulacin/gr de suelo.

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En cuanto a estudios ecolgicos de poblaciones de Frankia, es importante considerar para ello las dificultades en su aislamiento y su lento crecimiento, por lo tanto es necesario obviarse la etapa del asilamiento. Afortunadamente se ha avanzado mucho en los mtodos moleculares, los que proveen una va alternativa para medir cuantitativamente las poblaciones de Frankia en el suelo en forma precisa y reproducible. La amplificacin especfica de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) tanto en su modalidad anidada (nested) como reforzada (booster) son muy sensibles, con un potencial de deteccin de una sola unidad gnica/gr de suelo. As mismo, la tcnica de PCR del ADN extrado directamente del suelo e hibridado posteriormente con sondas especficas muestra ser una herramienta excelente para estudios de distribucin de la poblacin en el suelo. Hay que enfatizar en el hecho de que estas tcnicas tienen limitaciones en la prctica segn la pureza del ADN extrado del suelo y por las substancias inhibitorias del mismo. En relacin a otro estudios ecolgicos, tambin se ha desarrollado mtodos moleculares para estudiar directamente en el interior del ndulo la presencia de ciertas cepas de Frankia , tanto aquellas cultivables , como las no cultivables. Para ello se han diseado, al igual que en el caso anterior, sondas gnero especficas e incluso de algunos tipos genticos de cepas. Este punto lo tratamos ampliamente adelante, en la seccin de gentica.

VI.

GENTICA DE Frankia Entre los propsitos de estudiar la gentica de Frankia, como la de cualquier otro microorganismo, est conocer su diversidad y su filogenia, y en su caso particular entender a un nivel molecular las interacciones que se dan entre este actinomiceto simbionte y sus hospederos, adems de contar con herramientas para su estudio ecolgico. Este actinomiceto adems de ser difcil para cultivar, tambin es difcil para ser modificado genticamente. Hasta la fecha no ha sido posible obtener mutantes, lo cual ha impedido conocer la funcin de muchos de sus genes. Adems no se ha

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logrado introducir ADN ajeno a su genoma, lo que ha impedido su manipulacin gentica. Este hecho ha encontrado una explicacin en los hallazgos de Tavares y Sellstedt quienes demostraron que Frankia produce una gran cantidad de enzimas que degradan al ADN (ADNasas), impidiendo de esta forma la incorporacin de ADN extrao. Por estas razones los estudios genticos en esta bacteria se han tenido que desarrollar comparndola con otros microorganismos. Como Frankia es un simbionte fijador de nitrgeno y formador de ndulos, se ha comparado con Rhizobium y como es actinomiceto se compara con Streptomyces. De esta forma se han descrito genes muy importantes. La mayora de ellos involucrados en la fijacin de nitrgeno o en el proceso simbitico. As, esta parte de la revisin se enfocar a la descripcin de dichos genes y el impacto que han tenido para describir la diversidad y la filogenia de Frankia. Genes ribosomales. Estos genes codifican para el ARN ribosomal (rARN), el cual se ensambla con protenas para formar los ribosomas, organelos celulares involucrados en la sntesis de protenas. Se dice que entre ms copias de este gene existan ms rpido crece un microorganismo. As por ejemplo, Escherichia coli tiene 6 copias de sus genes ribosomales y se duplica cada 20 min; en cambio, Frankia tiene solo dos copias y se duplica cada 5 das. La secuencia de los genes ribosomales define a cada microorganismo. Es decir, el orden de las nucleotidos que forman dichos genes es para los microorganismos, lo que las huellas digitales es para los humanos. Conocer la secuencia de estos genes permiti construir el rbol genealgico de todos los seres vivos Existen tres genes ribosomales, cada uno tiene diferente tamao y en procariotes se conocen como 23S, 16S y 5S. En el genero Frankia estos genes muestran la estructura de cualquier bacteria, 16S-23S-5S, y presenta dos espacios intergnicos. Estos espacios son fragmentos de ADN que no codifican para ningn gene, esto hace que las mutaciones en el ADN se fijen con mayor frecuencia que en los genes codificantes, sirviendo de esta forma como un reloj molecular que nos permite diferenciar cepas muy emparentadas. El uso de estos fragmentos de ADN se discutir mas adelante.

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Genes simbiticos. Como se mencion anteriormente existen grandes similitudes entre las simbiosis entre Frankia y las plantas actinorrzicas y Rhizobiumleguminosas, sobre todo en el proceso de infeccin y la fijacin de nitrgeno (revisado en Pawlowski y Bisseling). Estos estudios comparativos se han enfocado principalmente a dos grupos de genes, los genes nod y los genes nif. a) Genes nod. Sin lugar a dudas existen grandes similitudes entre los procesos de infeccin de las simbiosis Frankia-plantas actinorrzicas y Rhizobium-leguminosas, lo cual sugiere la existencia de analogas entre ambos procesos. El primer reconocimiento entre Rhizobium y las leguminosas se lleva a cabo mediante la liberacin de algunos compuestos conocidos como flavonoides por la planta. Algunos estudios sugieren que esto puede ocurrir tambin en la simbiosis actinorrzica. Los flavonoides de la planta activan varios grupos de genes de los microorganismos, que al expresarse hacen posible la nodulacin. Un grupo de estos genes es conocido como nod (genes de nodulacin). Varios investigadores han tratado de utilizar genes nod provenientes de Rhizobium y Bradyrhizobium como sondas para encontrar genes homlogos en Frankia. Los resultados han sido poco alentadores. Otros investigadores han intentado complementar mutantes nod- de Rhizobium con ADN de Frankia, los resultados tampoco han sido positivos. Los genes nod de Rhizobium son los responsables de la sntesis de una molcula conocida como factor nod. Este factor cuando es aplicado a las races de las leguminosas provoca deformacin en los pelos de la raz. Se sabe de la existencia de un factor deformante de pelos radicales de plantas actinorrzicas en el sobrenadante de cultivos de Frankia, tal como ocurre con Rhizobium. Recientemente se ha estudiado la naturaleza de este factor deformante y se ha comprobado que es diferente al de Rhizobium An no se ha descrito con exactitud la naturaleza qumica de este factor deformante, ni los genes que estn involucrados en su expresin. Todava

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queda mucho por descubrir en esta simbiosis, especialmente en lo referente a sus genes de nodulacin. b) Los genes de la nitrogenasa. Una de las caractersticas ms importantes de Frankia es su capacidad de fijar nitrgeno tanto in vivo como in vitro. La fijacin biolgica de nitrgeno es un fenmeno que se lleva a cabo exclusivamente en procariotes. Este proceso consiste en la reduccin del nitrgeno atmosfrico (N2) a amonaco (NH3) mediante la accin de una enzima conocida como nitrogenasa. La sntesis de esta enzima esta codificada por tres genes llamados nifHDK, los cuales estn localizados en un opern. Como los ensayos para desarrollar mtodos de mutacin en Frankia no han tenido xito y tampoco se han encontrado vectores de expresin adecuados, la localizacin de los genes nif en Frankia se logr a travs de hibridaciones heterlogas con genes de otros microorganismos diazotrficos .As fueron localizados y secuenciado estos genes estructurales de la nitrogenasa; el gene nifH, el gene nifD y el gene nifK Se ha estudiado muy a fondo la organizacin del operon nifHDK en Frankia se ha observado la presencia de dos espacios intergnicos como los que hay entre los genes ribosomales. En la mayora de las cepas de Frankia estos genes estn contiguos y codificados en el cromosoma,, a diferencia de Rhizobium, cuyos genes nif estn en un gran plsmido. El anlisis de las secuencias del gen nifH de Frankia ha revelado que este gen se parece ms al gen nifH de la cianobacteria Anabaena que a los genes nif de otros fijadores Gram positivos como Clostridium o Paenibacillus . Esto apoyara la hiptesis de que estos genes se han transmitido horizontalmente y no verticalmente de un ancestro comn La presencia de los genes nif se considera un rasgo diagnstico del gnero Frankia y basados en las secuencias obtenidas se han diseado algunos iniciadores Frankia especficos para detectar este gen por la tcnica de la PCR, permitindonos identificar especficamente a Frankia en muestras de suelo o ndulos.

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Los espacios intergnicos (IGS). Como se mencion anteriormente los espacios o segmentos intergnicos de Frankia han recibido gran atencin. Debido a que son relojes moleculares que caminan ms rpido que los basados en genes, permiten la diferenciacin de los individuos hasta el nivel de cepa. Con el anlisis de genes en muchas ocasiones no es posible diferenciar entre cepas muy relacionadas. El espacio entre los genes 16S y 23S ha sido usado para estudiar la diversidad gentica de cepas de Frankia aisladas y no aisladas de Casuarinaceas y se ha podido demostrar que las cepas capaces de nodular Gymnostoma (Casuarinaceae) son cepas nodulantes de Elaeagnaceas, tambin ha servido para demostrar coinfeccin (doble infeccin) en ndulos de Casuarina collina con cepas compatibles entre Casuarina y Elaeagnus. Estos estudios se han extendido a cepas provenientes de muchas otras plantas actinorrzicas, incluyendo aislados pertenecientes a muy diversos grupos genmicos, Los genes nifHDK de Frankia tambin presentan dos espacios intergnicos, lo que ha permitido desarrollar mtodos que permiten el anlisis de estas regiones tan variables. As mismo, se han diseado iniciadores gnero especficos y se ha encontrado que este espacio es ms variable que el espacio ribosomal. Este tipo de estudios ha demostrado una alta variabilidad gentica dentro del gnero Frankia, especialmente entre los aislados de Alnus y Elaeagnus y curiosamente una baja diversidad entre los aislados de Casuarina. Estos estudios han sido utilizados tambin para hacer estudios de tipo ecolgico junto con otras herramientas que se explicarn enseguida. Marcadores Frankia especficos. Una de las grandes retos de los eclogos microbianos es conocer el comportamiento de los microorganismos a travs del tiempo y el espacio. En este caso en particular, es muy importante desarrollar tcnicas que nos permitan identificar rpidamente a una cepa de Frankia. Imaginen que deseamos saber si una cepa de Frankia es capaz de sobrevivir en un nuevo hbitat. Si siguiramos los mtodos clsicos de la ecologa microbiana, tendramos que reaislarlo del hbitat al cual lo hemos introducido, esto podra llevarnos meses!. Por ello se han desarrollado algunos mtodos moleculares que nos permiten seguir

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a Frankia en el suelo o en los ndulos, ahorrndonos los pasos del aislamiento y el cultivo. El anlisis de las secuencias de los genes nif y ribosomales ha permitido la utilizacin de secuencias de ADN complementarias a ciertas regiones especficas del genoma de Frankia. Estas secuencias conocidas como sondas son marcadas para su deteccin, ya sea con radioactividad o con fluorescencia. Estas sondas han sido utilizadas para diferenciar cepas de Frankia dentro de los ndulos de rboles que han sido inoculados con varias cepas para estudiar la competencia entre ellas, para localizar a Frankia en el suelo y para detectar in situ las hifas de Frankia usando fluorescencia. Estas tcnicas han demostrado ser muy poderosas para diferenciar cepas y han sido usadas para estudiar poblaciones de Frankia bajo diferentes condiciones ambientales. Otra tcnica que nos permite diferenciar entre una cepa y otra es la conocida como rep-PCR. Estos elementos son secuencias palndromes, cortas, intergnicas que se repiten y estn muy conservadas y generan una huella digital gentica que es especifica para cada microorganismo, permitindonos diferenciar entre una cepa y otra. Murry et al reportaron la utilidad de esta tcnica para diferenciar cepas de Frankia, y posteriormente ha sido utilizada para estudiar cepas dentro de los ndulos de plantas actinorrzicas de las cuales no ha sido posible aislar al actinomiceto. Con este mtodo tambin ha sido posible diferenciar cepas de Casuarina que por otros mtodos no haba sido posible Diversidad gentica de Frankia. El primer aislamiento de Frankia en 1978 dio la pauta para que se aislaran cepas de Frankia de muchas otras plantas actinorrzicas. Con las cepas aisladas, recordemos que se hicieron pruebas de su capacidad de inducir la formacin de ndulos en las plantas, lo que condujo a la formacin de tres grupos de bacterias, llamados grupos de especificidad de hospedero (o HSG, por sus siglas en ingls) Posteriormente, Fernandez et al, propusieron una nueva clasificacin con base en el parecido del genoma de una bacteria con otra (homologa ADN/ADN total). As, se formaron 9 grupos genmicos de Frankia, que coinciden con los grupos de

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especificidad de hospedero. Los grupos genmicos 1, 2 y 3 contienen cepas del grupo de Alnus (HSG 1). Los grupos genmicos 4, 5, 6, 7 y 8 contienen cepas del grupo de Elaeagnus (HSG 3), mientras que el grupo genmico 9 contiene nicamente cepas de Casuarinaceae (HSG 2), Beyazova y Lechevalier cortaron el ADN de muchas cepas de Frankia con enzimas (endonucleasas) en segmentos muy grandes (perfiles de macrorestriccin). Al analizar los datos se formaron grupos que coincidieron en un 73% con los reportados por Fernandez et al. Estudios ms recientes hechos con base en las secuencias de ADN de las Frankiae presentes en los ndulos actinorrzicos han revelado que en la naturaleza existe una mayor diversidad que la detectada en los microorganismos cuando se estudian cultivados.. Este es uno de los motivos por los que a ltimas fechas se han investigado las secuencias de ADN pertenecientes a las bacterias dentro de los ndulos actinorrzicos. La mayora de estos estudios incluyen cepas de plantas actinorrzicas poco estudiadas como Ceanothus, Coriaria, Discaria, Purshia, Colletia, Elaeagnus, Talguenea y Trevoa y diferentes especies de Myricaceas. Los datos obtenidos en estos estudios, junto con los de Normand et al han permitido establecer las relaciones que existen dentro de los miembros del gnero Frankia , como se explicar en el siguiente apartado.

VII.

POSICIN FILOGENTICA DE Frankia. Una de las preguntas que frecuentemente nos hacemos y que quisiramos poder contestar es Qu relacin tiene este microorganismo con otros?, es decir, Cul es la filogenia de este microorganismo?. El estudiar la filogenia de Frankia nos permite saber que relacin tiene este microorganismo con otros y sobretodo conocer el parentesco que tienen entre s estos actinomicetos capaces de establecer simbiosis con plantas tan dismiles pertenecientes a ocho familias botnicas diferentes. La primera clasificacin de Frankia fue hecha con base en el tipo de esporangios que presenta este actinomiceto, as junto con los gneros Geodermatophilus y Dermatophilus formaba la familia Frankiaceae. Esta primera clasificacin

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morfolgica no coincidi con su identificacin gentica hecha posteriormente con base en el anlisis parcial de la secuencia nucletidica del gen ribosomal 16S de una cepa aislada de Alnus. Este estudio revel una cercana entre Frankia, Geodermatophilus y con una bacteria del Mar Muerto conocida como "Blastococcus" pero no con Dermatophilus, proponindose la exclusin de este ltimo de la familia Frankiaceae. Posteriormente el anlisis de un mayor nmero de secuencias de este mismo gene demostr que dentro del genero Frankia existen 4 grupos, concepto actualmente aceptado, a saber: Grupo 1: cepas infectivas en Myrica (Myricaceae), Alnus (Betulaceae), Casuarina y Allocasuarina (Casuarinaceae). Grupo 2: cepas no cultivables presentes en ndulos de Rosaceae, Coriariaceae y Datiscaceae Grupo 3: cepas de Eleagnaceas y Gymnostoma (Casuarinaceae). Grupo 4: cepas aisladas de ndulos de diversas plantas que nodulan (pero son nif -) o no Alnus. En uno de estos estudios con base en la secuencia del gen ribosomal 16S, el actinomiceto ms cercano a Frankia fue Acidothermus cellulolyticus .

Recientemente otro anlisis filogentico con base en el gen recA, que esta involucrado en la reparacin del ADN, ha comprobado la relacin cercana entre Frankia y Acidothermus. Acidothermus cellulolyticus, es un microorganismo celuloltico de aguas termales que tiene un gran contenido de hopanoides, al igual que Frankia. Los autores proponen que ambos actinomicetos tuvieron un ancestro comn, rico en hopanoides que quiz fijaba nitrgeno y que posteriormente ambos tomaron direcciones divergentes, transformndose en microorganismos totalmente diferentes.

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VIII. FISIOLOGA Y BIOQUMICA DE FRANKIA Pared celular y qumica celular. La qumica celular juega un papel prominente en la taxonoma de los actinomicetos al nivel de gnero. Los compuestos ms importantes incluyen: aminocidos, aminoazcares y azcares presentes en la pared celular, polisacridos unidos no covalentemente a la pared celular, cidos grasos, fosfolpidos y menaquinonas. El gnero Frankia posee una pared celular tipo III que es la ms comn entre los actinomicetos, constituda fundamentalmente por cido meso-diaminopimlico, cido glutmico, alanina, glucosamina y cido murmico Con relacin al patrn de azcares presentes en el gnero Frankia, se observa que es variable y depende de cada cepa. Algunas cepas presentan el patrn tipo D (constitudo de xilosa y arabinosa), otras el tipo E (constituido de fucosa), algunas otras presentan el patrn B (con madurosa) y otras tantas poseen el tipo C (con galactosa y glucosa) Los fosfolpidos caractersticos del gnero son: fosfatidilinositol, fosfatidilinositol mansidos y difosfatidilglicerol (patrn tipo PI). Las menaquinona predominante es la MK9

Siderforos. La quelacin es un fenmeno rutinario en los sistemas biolgicos y consiste en la formacin de complejos moleculares en donde participa un agente quelante (molcula que atrapa) y un elemento quelatado (elemento atrapado). Un ejemplo en el suelo, lo constituyen las estructuras moleculares complejas denominadas como arcillas, que funcionan como agentes quelantes que atrapan o liberan iones dependiendo de las condiciones imperantes en el mismo, afectando esto la disponibilidad de iones para la nutricin de microorganismos y plantas. Los siderforos son agentes quelantes producidos por diferentes microorganismos en el suelo; los microorganismos fijadores de nitrgeno producen siderforos para obtener el hierro necesario para llevar a cabo la fijacin de este elemento. Recordemos que la enzima nitrogenasa est compuesta de varios componentes

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proticos y que 36 tomos de Fe se requieren para su correcto funcionamiento. Se ha observado en algunas cepas de Frankia que nodulan casuarina, la presencia de siderforos que forman parte de un mecanismo inducible de abastecimiento de hierro cuando el microorganismo se desarrolla en condiciones limitantes de este mineral Hasta la fecha se han detectado dos tipos de siderforos en las cepas de Frankia estudiadas, los siderforos tipo catecol y los siderforos tipo hidroxamato. La francobactina y la francobactina A son ejemplos de siderforos tipo hidroxamato descritos en Frankia sp cepas 52065 y CeSI5. Resistencia a antibiticos.La bsqueda de marcadores genticos en Frankia a travs de los patrones de resistencia y sensibilidad a antibiticos ha puesto en evidencia la existencia de mecanismos de resistencia a los mismos en diferentes cepas. Se sabe que hay cepas resistentes a rifampicina, estreptomicina, kanamicina, tetraciclina, kasugamicina, lincomicina, gentamicina y novobiocina. Sin embargo, estos microorganismos muestran sensibilidad a ampicilina, penicilina G, neomicina, espectinomicina, thiostreptona, cloranfenicol y eritromicina. Es necesario mencionar que los patrones de resistencia-sensibilidad a antibiticos pueden variar dependiendo de las cepas probadas (en esto radica su valor como marcador gentico para la diferenciacin de cepas) como en el caso reportado por Car con frankias de la familia Ramnaceae. Proteosoma. Entre las diferentes protenas que libera Frankia al medio circundante destacan los complejos protenicos multicatalticos de alto peso molecular o proteosomas. Estas macromolculas pueden ser tiles como abastecedores de aminocidos cuando el microorganismo crece bajo condiciones saprofticas. Tambin podran participar en la colonizacin de la planta actinorrzica promoviendo la despolimerizacin de protenas de la pared celular del macrosimbionte. Esta megaprotena es similar desde el punto de vista estructural, bioqumico e inmunolgico a los proteosomas caractersticos de las clulas eucariontes. En la cepa de Frankia BR su proteosoma est involucrado en un fenmeno de autlisis. Se ha demostrado que la actividad de su megaproteinasa se ve

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incrementado cuando cesa el crecimiento en medio mineral con agitacin magntica, reflejndose esto en un decremento de la biomasa de hasta un 50%. Crecimiento. Como se mencion previamente, la mayora de las cepas de Frankia no son cultivables y su crecimiento es extremadamente lento, su tiempo de generacin vara considerablemente en funcin de las condiciones de cultivo. Se ha logrado una apreciable disminucin en el tiempo de crecimiento cuando se cultivan en agitacin magntica a 200 rpm y agregando al medio fosfatidilcolina Para el aislamiento y cultivo de Frankia, se recomienda el uso de propionato de sodio como fuente de carbono, sin embargo, esta cido orgnico de cadena corta puede ser utilizada por otras bacterias y no garantiza el xito en el aislamiento de Frankia y s el crecimiento de un contaminante. Los aislados nativos de Frankia nodulantes del rbol Casuarina en Mxico se obtuvieron slo cuando se us el acetato de sodio en lugar de el propionato como fuente de carbono.Otro caso es el del aislamiento de Frankia de ndulos de Ramnceas en que el propionato se substituy por la glucosa. Otro problema que se presenta para el aislamiento de este microorganismo es que generalmente se recomiendan medios de cultivo lquidos (recordemos que no forma micelio areo), los cuales no excluyen la posibilidad de obtener un co-cultivo, adems de que existe la posibilidad de que en un mismo lbulo se encuentren hospedadas ms de una cepa de Frankia. Es por ello que se requiere obtener cultivos clonales a partir de esporas o de filamentos del microorganismo para estudios posteriores en donde es un prerrequisito contar con cultivos puros. Fuentes de Carbono. Las fuentes de carbono utilizadas por Frankia para su crecimiento y desarrollo generalmente son diversas. Estas incluyen los cidos grasos de cadena corta tales como el propionato y el acetato, cidos grasos derivados del tween, intermediarios del ciclo del cido ctrico tales como el succinato y el malato y algunos cidos orgnicos como el piruvato. Existen algunas cepas que se propagan con la utilizacin de glucosa como fuente de carbono, tal es el caso de algunas frankias aisladas de los arbustos Colletia

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hystrix, Retanilla ephedra y Telguenea quinquinervis, pertenecientes a la familia Ramnaceae. El hecho de que muchas cepas de Frankia no puedan utilizar los carbohidratos se le atribuye a la falta de sistemas transportadores de azcares. La eficiencia en la utilizacin de carbohidratos de ciertas cepas de Frankia puede mejorarse a travs del uso de tween, el cual incrementa la permeabilidad de la membrana celular. En Frankia se ha demostrado la existencia del ciclo del cido ctrico, ciclo del glioxilato y actividades enzimticas de la gluconeognesis. Las cepas que son capaces de utilizar la glucosa como nica fuente de carbono, la catabolizan a travs de la ruta de Embden-Meyerhof-Parnas. El propionato es metabolizado por una conversin a succinato a travs de la va de la propionil CoA carboxilasa. Fuentes de Nitrogeno. Frankia puede utilizar el nitrgeno atmosfrico, el amonio y los nitratos, as como varios aminocidos como fuente de nitrgeno para su crecimiento in vitro. La asimilacin del amonio producto de la fijacin del nitrgeno atmosfrico se lleva a cabo por el sistema glutamino sintetasa-glutamato sintasa. Como mencionamos previamente, la fijacin de nitrgeno atmosfrico o reduccin del mismo para el crecimiento de Frankia se lleva a cabo en el interior de las vesculas. Estas estructuras producto de la diferenciacin celular en este actinomiceto, presenta una envoltura constituda fundamentalmente de dos tipos de lpidos hopanoides, el bacteriohopanotetrol (tetrol) y su monoester con el cido fenilactico (cido feniltetrol), adems de escualeno. El bacteriohopanotetrol se encuentra abundantemente en las clulas de Frankia, sin embargo, el cido feniltetrol se encuentra en altas concentraciones slo en las vesculas. Los hopanoides son triterpenoides tetracclicos que tienen propiedades semejantes a los esteroles en cuanto a que modifican la permeabilidad de la membrana de muchos procariontes. Cuando Frankia se encuentra viviendo en forma saproftica o en simbiosis con las plantas actinorrcicas, la envoltura de sus vesculas constituye una barrera fsica que limita la difusin del oxgeno hacia la nitrogenasa, misma que si entra en contacto

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con ese gas se inactiva permanentemente. Si la tensin de O2 aumenta, el grosor de la pared envolvente tambin aumenta. Esto se observa tanto en los cultivos bacterianos como en los ndulos . Esta variacin en el grosor de la pared sugiere un nivel especfico de regulacin del oxgeno en la vescula que es dependiente del mismo oxgeno En los arbustos Coriaria y Datisca se ha visto que las vesculas de Frankia se encuentran rodeadas de mitocondrias de la clula hospedero, tal parece que la respiracin mitocondrial juega un papel muy importante en la regulacin de los niveles de oxgeno en el rea donde se fija activamente el nitrgeno atmosfrico en el ndulo. Al igual que en la fijacin de nitrgeno por Rhizobium, se ha demostrado que Frankia nodulante de Casuarina, presenta una hidrogenasa, tanto en cultivo como en simbiosis. Esta hidrogenasa recicla el hidrgeno que produce la nitrogenasa al reducir los protones, incrementando la eficiencia de la nitrogenasa. Dicha enzima, en Frankia requiere de niquel para su buen funcionamiento; cuando se agrega nquel al medio de cultivo, se incrementa la toma de H2, pero no su desprendimiento. Se desconoce si el nquel juega algn papel en este tipo de hidrogenasas en Rhizobium. En simbiosis, la planta hospedero afecta el metabolismo del hidrgeno en el endosimbionte. Se ha observado que una misma cepa de Frankia que se asocia con diferentes especies del rbol casuarina muestra diferencias en la fijacin de nitrgeno y el metabolismo del hidrgeno dependiendo ambos procesos de la combinacin Frankia-especie de planta.

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IX.

AISLAMIENTO DE Frankia sp. a. Material bilgico Nodulos de Casuarina sp. Material de laboratorio Medio Basal FM Matraz erlenmeyer de 100 ml Pipetas pasteur Pipetas de 1 ml Probeta de 100 m Estiletes Laminas porta y cubreobjetos Azul de lactofenol Agua destilada Frascos de penicilina Hipocloriton de Sodio al 1%

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b. Toma de muestra Se recolectan ndulos frescos obtenidos de la base de los rboles de Casuarina sp que se encontraban en los alrededores de la UNJBG, se recolectan en placas petri.

c. Esterilizacin de ndulos

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Se colocan sobre un tamiz y se lavan con agua potable. Tomar los ndulos claros y turgente. Colocarlos en un pequeo frasco para esterilizar superficialmente con el Hipoclorito de sodio al 1% (4-5 veces)

Figura 04: Ndulos de Casuarina sp. Tomar un ndulo y colocarlo sobre un portaobjeto estril, y con una laminilla cubreobjetos, realizar el squash.

Figura 05: Squash de ndulos

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Con un estilete, coger el liquido lechoso e inocularlo en Medio Basal FM.

Figura 06: Componentes del Medio Basal FM

Figura 07: Medio Basal FM

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Figura 08: Siembra del liquido lechoso de los ndulos de Casuarina sp. En Medio Basal FM

Incubar por 3-7 das a 30C

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d. Resultados

Luego de 7 das de incubacin se ha obtenido el crecimiento de l bacteria problema Frankia sp. En Medio Basal FM. El crecimiento se ve evidenciado, ya que en los viales en los cuales se ha inoculado a esta bacteria, ha crecido en la superficie una pelcula a manera de una tela de araa, lo cual corresponde al micelio de esta bacteria.

EVALUACION MACROSCPICA

POSITIVO CRECIMIENTO

NEGATIVO CRECIMIENTO

Figura 09: Viales con medio basal FM

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EVALUACION MICROSCPICA

Se ha tomado una muestra de los viales en los que ha habido crecimiento, y se ha colocado sobre una lmina portaobjeto en la cual se ha depositado Lactofenol, se cubre con cubreobjetos, y se visualiza al microscopio.

MUESTRA AUMENTO MICROORGANISMO DESCRIPCIN

: Ndulos de Casuarina sp : 40x : Frankia sp : Las hifas se diferencian en esporangios . Estos contienen en su interior gran cantidad de esporas en estado latente que germinan para formar hifas. Las hifas tambin pueden diferenciarse para formar una estructura que constituye un rasgo sobresaliente de Frankia, la vescula.

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X.

CONCLUSIONES

En los pases tropicales de montaa existe un gran recurso natural al que podemos recurrir para enfrentar un buen nmero de problemas del ambiente. Nos referimos a las plantas actinorrzicas. Algunas pueden ser usadas en restauracin ecolgica urbana y rural, otras en produccin de madera y de lea, etc.

Se desconocen muchos aspectos de la simbiosis que estas plantas llevan a cabo con diferentes microorganismos, consideramos de suma importancia la que lleva a cabo con su asociado fijador de nitrgeno, Frankia, pues un conocimiento apropiado de esta interaccin podra conducir a un estado ptimo de eficiencia en su crecimiento y produccin.

No menos importante es la falta de informacin sobre la bacteria misma. Esta carencia la ha propiciado su lento crecimiento, que no ha permitido desarrollar vectores genticos ni mutantes que permitan conocer cmo funcionan sus genes. Tampoco hemos sido capaces de desarrollar mtodos de cultivo que permitan aislar todo tipo de Frankia.

No obstante los cientficos seguimos aceptando el reto de trabajar con este difcil y quisquilloso microorganismo y deseamos que se unan a nosotros muchos otros colegas.

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XI.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

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