Laboratori o 5y6

Determinacin de Protenas en semillas

Mariela Silva & Sebastin Gonzlez Laboratorio de Bioqumica Profesor Pedro Cuadra

1. Objetivos

Extraer y Determinar la cantidad de protenas obtenidas de diversas semillas.

2. Resultados
Semillas Porotos Lentejas Nuez Man Almendras Absorbancia 0,251 0,322 0,997 0,492 0,637

Tabla 1. Muestra los valores obtenidos de absorbancia mediante espectrofotmetro (TU-1800 Uv-vis spectrofot)

Metodologa para obtener Concentracin

Ejemplo Poroto: 0,251 de abs. y = 0,0429x + 0,0399 0,251 = 0.0429x + 0,0399 0,251 0,0399 = 0.0429x 0,2111= 0.0429x 0,2111/ 0.0429 = x 4,9= x (concentracin) De acuerdo a esto, tenemos para cada semilla:

Solucin de semilla Poroto Lenteja Nuez

Concentracin de la solucin (ug/ml) 4,92 6,57 22,16

Absorba ncia 0,251 0,322 0,997

Man Almendra

10,53 13,91

0,492 0,637

Tabla 2. Muestra los valores de concentracin de cada semilla con su respectiva absorbancia.

Grfico 1. Muestra la recta de absorbancia BSA-biuret que se obtuvo, como puede apreciarse la absorbancia aumenta a medida que la concentracin tambin lo hace.

3. Discusin El fin ltimo de esta experiencia era determinar protenas de cada una de las semillas disponibles (almendra, nuez, man, poroto y lenteja), por medio de mtodos precisos de cuantificacin en donde cada una debi reaccionar con el azul brillante de Coomassie (CBB) y el Biuret, para producir un complejo azul-violeta para posteriormente ser llevado al espectrofotmetro para realizar una curva de calibracin preparada utilizando soluciones estndar de estas protenas para comparar la absorbancia espectrofotomtrica de cada muestra obtenindola del complejo azul-violeta en la regin visible del espectro, se puede considerar que se llev a cabo con xito. En este mtodo se estableci un rango de 0,5 absorbancia correspondiente para que a la hora de graficar la pendiente, sta no cambie y sea recta. Sin embargo como se pudo apreciar los datos obtenidos de absorbancia presentados por la almendra fue de un 0,6 absorbancia y la nuez con un 0,9 absorbancia, lo que determina que fueron superior al rango recomendado, estaban muy concentradas, la dilucin como se hara normalmente en rangos elevados no se realiz, ya que los valores no fueron extremadamente altos y la grfica result ser una recta. Por otra parte se verific con xito que la absorbancia

depender determinadamente de la concentracin de la solucin y no de la cantidad de sustancia.

4. Conclusiones

Un compuesto con un alto valor de coeficiente de extincin molar es muy eficiente en la absorcin de luz de la longitud de onda adecuada y, por lo tanto, puede detectarse por medidas de absorcin cuando se encuentra en disolucin a concentraciones muy BAJAS. Enlaces peptdicos o ciertos aminocidos reaccionan y los productos coloridos son los que se cuantifican. Todas las protenas pueden ser detectadas, sin embargo slo ciertos residuos de aminocidos son los que se leen en la regin del UV. En general, la absorbancia depende de la concentracin que tenga la solucin y no de la cantidad de protenas o de sustancia que sta tenga, as mismo la grfica vara al variar la concentracin ya que esto a su vez hace que la absorbancia tambin cambie.

5. Bibliografa
BRADFORD, M., 1976, A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Analytical Biochemistry, 72:248-254. SORIA, J., I. GUEVARA, J.S. PADILLA & N. VASCO, 2004, DETERMINACIN DE PROTENAS DE RESERVA EN SEMILLAS DE SELECCIONES DE GUAYABA (Psidium guajava L.) DEL ESTADO DE AGUASCALIENTES, Memoria primer congreso estatal, 2pp. CURTIS H., BARNES S., SCHNEK A., & A. MASSARINI. 2008. Biologa. 7 ed. Argentina, Buenos Aires.

DUPONT D, H., & G. W. GOKEL. 1985. Qumica orgnica experimental. Revert S. A. ed. Espaa, Barcelona. 484, 485. GONZALEZ. C., M.C. CERN, F. ACIEN, C. SEGOVIA, Y CHISTI & J.M. . FERNANDEZ, 2010, Protein measurements of microalgal and cyanobacterial biomass, Elsevier, Bioresource Technology 101. CORREA, P., L. BERNAL & E. MARTINEZ-BARAJAS, 2012, Oxidized Glutathione Promotes the Association of Proteins from Bean Seeds to Potato Starch, J. Mex. Chem. Soc. 56(1), 32-35.

Cuestionario laboratorio n5 1) Indique cules con las longitudes de onda principales donde absorben las protenas y qu residuos son responsables de esta absorcin.

540 nm.

2)

Indique la composicin qumica del reactivo de Biuret.

3) Indique que compuesto no dan la reaccin de Biuret y cuales interfieren en la determinacin de protenas. Cualquier sustancia que no tenga enlaces peptdicos no dan reaccin Biuret y las que interfieren en la reaccin Biuret son el Hidrxido potsico (KOH), Sulfato cprico (SuSO4) junto con Tartrato de sodio y potasio (KNaC4H4O6 4H2O) 4) Compare el principio de en que se basa el mtodo Biuret con el mtodo de Bradford. Mtodo de Bradfor: El azul brillante G-250 COOMASSIE se adhiere a la protena, el colorante se torna se rojizo a azulado y el mximo de absorcin de colorante cambia de 465 a 595 nm. El cambio en la absorbancia a 595 nm es proporcional a la concentracin de la muestra.

Mtodo de Biuret: Al formar complejos los iones cpricos con los enlaces peptdicos de las protenas se produce un color violeta- morado bajo condiciones alcalinas.

5) Averige cuales son los otros mtodos utilizados para la determinacin de protenas. Mtodo UV. Mtodo de adhesin de colorante. Mtodo de la Ninhidrina.

6) Indique cuales son las ventajas y desventajas de este mtodo. Ventajas: Mtodo rpido se puede completar en 2 minutos. Reproducible. Sensible (muchos mas que el mtodo de Lowry. No existe interferencia de cationes como K+, Na+ y Mg+. No existe interferencia del sulfato de amonio.

no existe interferencia de los polifenoles ni carbohidratos como la sacarosa. Mide protena y polipptidos con una masa molecular aprox. Igual o mayor de 4 000 daltons.

Desventajas: El complejo protena colorante formado puede unirse a las celdas de cuarzo. El color vara con diferentes tipos de protenas. La protena estndar debe seleccionarse con mucho cuidado. Interferencia con detergentes.

7) Indiquen en que se basa la modificacin de Lowry al mtodo de Biuret. Este mtodo es la asociacin de dos reacciones, una de ellas es el reactivo Biuret y el otro es el reactivo Folin-Ciocalteu, juntas dan un determinado resultado. 8) Dibuje un esquema indicando la interaccin del reactivo Biuret con la protena.

9) Explique como afecta el pH en este mtodo de determinacin. Afecta de manera que establece un medio ideal, ya que la protena reacciona a pH alcalino para formar un complejo azul violeta, si ste fuera cido no habra coloracin. 10) Compare 3 mtodos colormetros para determinar protenas segn su sensibilidad, tiempo requerido, principio en que se basan e interferencias.

Sensibilidad Mtodo de Muy sensible Bradford Mtodo de Biuret Poco sensible

Tiempo Requerido 5 min 30 min

Principio que en que se basan e interferencias Muestra algunas interferencias Muestra pocas interferencias

Mtodo Lowry

Muy sensible

1 hora

Muestra muchas interferencias

Cuestionario laboratorio n6

1) Entregue un grafico absorbancia vs. Concentracin de estndares.

2) Calcule el coeficiente de extincin molar de la BSA.

Es 43 824 M-1 cm-1 o bien usando el coeficiente dado en porcentaje que es de 6.6 para una solucin de BSA al 1% (10 mg/mL).

3) Indique la concentracin de las soluciones AX/10 y XX.

4) Por qu se utiliza buffer para la extraccin proteica?

Se utiliza buffer, ya es el que determinara la extraccin que se utilizar dependiendo si desea o no que las protenas conserven su actividad biolgica, su conformacin nativa, su interaccin con otras protenas u otras molculas. Algunos protocolos son tan violentos que involucran la ruptura de todas las membranas; otros en cambio permiten fraccionar y obtener, distintos componentes subcelulares (ncleos, mitocondrias, etc).

5) Por qu el mortero y tubos de centrifuga deben mantenerse a baja temperatura?

Para evitar la degradacin por accin de las proteasas, evitar romper cualquier estructura que se quiera analizar.

6) Cual es la formula molecular del CBB?

7) Por qu se utiliza el orden de concentracin ug/ml para construir la curva de estndares?

Ya que esta medida tiene mayor precisin, se utiliza cuando la concentracin o la cantidad de analito es muy pequea, por ejemplo, que tenga 500ug, es ms exacto que decir 0.5mg, ya que esos 0.5 pueden ser aproximados como; 0.46, 0.49, etc.

8) Cual es la funcin del CBB? Escriba una ecuacin qumica que la represente.

Frmula molecular: C45H44N3NaO7S2 Las protenas del gel se fijan gracias al cido actico y al mismo tiempo se tien. El colorante en exceso que se incorpora en el gel se puede eliminar destiendo con una disolucin de composicin idntica excepto por el colorante. Las protenas se detectan como bandas azules contra un fondo claro. Al teir, el SDS puede interferir el proceso ya que tambin es aninico por lo cual generalmente se utiliza un gran volumen de disolucin de tincin (aproximadamente 10 veces el volumen del gel).

9) Cul de todas las semillas es la ms nutritiva de todas?

La nuez ya que contiene alto grado de protenas y como se demostr en laboratorios pasados, tambin es rica en cidos grasos insaturados que tambin son nutritivos.

10)Averige sobre otros mtodos (cualitativos y cuantitativos) comnmente utilizados en la determinacin de protenas. Cuantitativas:

Mtodo del Biuret: En solucin alcalina el Cu+2 reacciona con el enlaces peptdico de las protenas dando un color purpreo que se cuantifica espectrofotomtricamente (540nm). Como estndar se utiliza una solucin de albmina.

Protena + Cu+2 Protena (prpura)

Complejo Cu-

Muestra: suero o plasma (heparina o EDTA). Separar el suero del cogulo o el plasma de las clulas antes de 3h. Si el paciente est acostado durante la extraccin el resultado ser menor.

Mtodo de Lowry: Dependen de la concentracin de tirosina y triptfano de la muestra.

Consiste en dos reacciones: 1. Reaccin de Biuret. 2. Reaccin de Folin: caracterstica de los grupos OH reductores de los aminocidos tirosina y triptfano que, junto con los complejos Cu+2, reducen el reactivo de Folin generando un color azul. Est sujeto a muchas interferencias. Se utiliza fundamentalmente en orina.

Turbidimetra: Medicin de la turbidez resultante de la precipitacin de protenas.

Absorcin en el ultravioleta: Se mide la absorbancia a 270nm originada fundamentalmente por los anillos aromticos de triptfano y tirosina.

Mtodos de unin a colorantes.

Mtodo de Bradford: Se basa en la unin de un colorante, Comassie Blue G-250 (tambin Serva Blue) a las protenas. El colorante, en solucin cida, existe en dos formas una azul y otra naranja. Las protenas se unen a la forma azul para formar un complejo protena-colorante con un coeficiente de extincin mayor que el colorante libre. Este mtodo es sensible (1-15 g), simple, rpido, barato y pocas sustancias interfieren en su determinacin. Entre las sustancias que interfieren estn los detergentes y las soluciones bsicas.

Mtodo de BCA: El cido bicinconnico, sal sdica, es un compuesto capaz de formar un complejo prpura intenso con

inones Cu1+ en medio alcalino. Este reactivo forma la base de un mtodo analtico capaz de monitorizar el in cuproso producido en una reaccin entre las protenas con Cu2+ en medio alcalino (reaccin de Biuret). La estabilidad del reactivo y el cromforo proporciona un mtodo para la cuantificacin de protenas que es sencillo, rpido, muy sensible, y que muestra una gran tolerancia a compuestos que afectan a otros mtodos. Cualitativas: Prueba de Biureth: Los compuestos que tienen dos grupos carbamidos (-CONH-), ya sea unidos directamente o a travs de un tomo de carbono o nitrgeno, dan un color violeta con el sulfato de cobre alcalino (Reactivo de Biureth). Los tripptidos son las molculas ms pequeas capaces de dar una prueba de Biureth positiva, mientras que esto no ocurre con los aminocidos. La prueba de Biureth es una buena prueba general para las protenas y la intensidad del color violeta es una medida del nmero de enlaces peptdicos. Algunas sustancias como la oxamida pueden dar falsos resultados positivos en ensayos cualitativos de protenas. Desnaturalizacin por calor y pH extremos: La desnaturalizacin es cualquier proceso por el cual el arreglo espacial de una protena cambia de la estructura ordenada de la molcula nativa a una forma tridimensional desordenada. Durante la desnaturalizacin se pierden las estructuras de orden superior de las protenas, con prdida de la actividad biolgica. Las enzimas por ejemplo, que realizan trabajos catalticos en las clulas, tienen una temperatura y un pH ptimo en el cual presentan un mximo de actividad, pero la actividad disminuye significativamente hacia valores extremos de pH y a bajas o elevadas temperaturas. Precipitacin con cationes y aniones pesados y sales concentradas: Los cationes de metales pesados y los aniones de elevado peso molecular son muy usados en la separacin de protenas y en la preparacin de filtrados libres de protenas. A pH neutro por lo general las protenas tienen carga neta negativa y se combinan fcilmente con iones de metales pesados que, al neutralizar la carga producen la precipitacin. A pH por debajo del punto isoelctrico en cambio, se combinan con aniones porque presentan carga neta positiva. Soluciones concentradas de sales, de sulfato de amonio, por ejemplo, reducen en gran medida la solubilidad de las protenas, porque compiten por las molculas de agua de disponibles para la solvatacin y las interacciones protena-protena se hacen ms importantes.