Conceitos Bsicos de Tcnicas em Biologia Molecular

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ISSN 0103-0205 Setembro, 2008 Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria Centro Nacional de Pesquisa de Algodo

Documentos 191

Conceitos Bsicos de Tcnicas em Biologia Molecular

Liziane Maria de Lima

Campina Grande, PB. 2008

Conceitos Bsicos de Tcnicas em Biologia Molecular Exemplares desta publicao podem ser solicitados : Embrapa Algodo Rua Osvaldo Cruz, 1143 Centenrio Caixa Postal 174 CEP 58107-720 - Campina Grande, PB Telefone: (83) 3315-4300 Fax: (83) 3315-4367 algodao@cnpa.embrapa.br http://www.cnpa.embrapa.br Comit de Publicaes Presidente: Carlos Alberto Domingues da Silva Secretrio: Valter Freire de Castro Membros: Fbio Aquino de Albuquerque Giovani Greigh de Brito Joo Luiz da Silva Filho Maira Milani Maria da Conceio Santana Carvalho Nair Helena Castro Arriel Valdinei Sofiatti Wirton Macedo Coutinho Supervisor Editorial: Valter Freire de Castro Reviso de Texto: Maria Jos da Silva e Luz Tratamento das Ilustraes: Geraldo Fernandes de Sousa Filho Capa: Flvio Trres de Moura/Maurcio Jos Rivero Wanderley Editorao Eletrnica: Geraldo Fernandes de Sousa Filho 1 Edio 1 impresso (2008) 1.000 exemplares Todos os direitos reservados A reproduo no autorizada desta publicao, no todo ou em parte, constitui violao dos direitos autorais (Lei n 9.610) EMBRAPA ALGODO (Campina Grande, PB) Conceitos Bsicos de Tcnicas em Biologia Molecular, por Liziane Maria de Lima. Campina Grande, 2008 27p. (Embrapa Algodo. Documentos, 191) 1. Cronagem molecular. 2. Manipulao de DNA. 3. Extrao de DNA. 4. Purificao de DNA. 5. Sequenciamento de DNA. I. Lima, L.M. de II. Ttulo. III. Srie.

Embrapa 2008

CDD 574.88

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Autores
Liziane Maria de Lima D.Sc. Biloga da Embrapa Algodo, Rua Osvaldo Cruz, 1143, Centenrio, CEP 58107-720, Campina Grande, PB. E-mail: liziane@cnpa.embrapa.br

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Apresentao

Objetivou-se com este documento apresentar de forma sucinta alguns conceitos bsicos em Biologia Molecular a estudantes ainda no graduados da rea biolgica, no intuito de despertarem para a importncia da tecnologia do DNA recombinante na biotecnologia. A Biologia Molecular baseia-se nos conhecimentos produzidos pelas disciplinas de Bioqumica, Microbiologia, Gentica, Biologia Celular, entre outras, os quais estimulam o surgimento de idias para projetos inovadores com objetivos que visam, muitas vezes, a melhoria da produo de alimentos, produtos farmacuticos e qumicos, alm da aplicabilidade na terapia gnica. Trata-se de uma apostila oferecida durante o curso de curta durao "Tpicos Bsicos em Biotecnologia Vegetal", ministrado na Embrapa Algodo, onde foram apresentadas as teorias de algumas tcnicas aplicadas a Biologia Molecular, no mdulo destinado a esse fim.

Napoleo Esberard de Macdo Beltro Chefe Geral da Embrapa Algodo

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Sumrio

Conceitos Bsicos de Tcnicas em Biologia Molecular ...................... 1. Conceitos bsicos ...................................................................... 1.1. Clonagem molecular ............................................................. 1.2. Enzimas para a manipulao de DNA ..................................... 1.3. PCR .................................................................................... 1.4. Eletroforese em gel de agarose ............................................. 1.5. Clonagem de produtos de PCR .............................................. 1.6. Plasmdeos ou vetores........................................................... 1.7. Transformao celular .......................................................... 1.8. Extrao e purificao de DNA ............................................. 1.9. Seqenciamento de DNA ...................................................... 1.10. Anlise de DNA e RNA em blotting ..................................... 2. Minidicionrio ............................................................................ 3. Referncias Bibliogrficas ..........................................................

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Liziane Maria de Lima

1. Conceitos bsicos
1.1. Clonagem molecular
A clonagem molecular consiste na difuso de molculas de DNA idnticas e baseia-se na propagao natural de clulas ou indivduos geneticamente idnticos ao inicial. O experimento de clonagem gnica consiste em introduzir o gene dentro de clulas bacterianas e isol-las em colnias. As clulas de cada colnia so idnticas entre si (NASCIMENTO et al., 1999). A clonagem gnica consiste em duas etapas bsicas: a) Na primeira etapa faz-se a ligao entre um fragmento de DNA, chamado inserto, contendo o gene de interesse com uma outra molcula de DNA, o vetor, para formar uma quimera ou molcula de DNA recombinante (figura 1) (BROWN, 2003).

Fig. 1. Ligao do vetor com o inserto para formar a molcula de DNA recombinante.

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b) Na segunda etapa, a molcula de DNA recombinante transportada para dentro de uma clula hospedeira, em geral uma bactria, ocorrendo o processo de transformao. A clula que recebeu o DNA recombinante chamada de clula transformada, a qual sofre muitos ciclos de diviso, produzindo vrias cpias do DNA recombinante, como pode ser visto na Figura 2 (BROWN, 2003).

Fig. 2. Transformao de uma clula bacteriana com uma construo de DNA recombinante.

1.2. Enzimas para a manipulao de DNA

As enzimas modificadoras de DNA so as principais ferramentas da engenharia gentica e possibilitam a manipulao in vitro de molculas de DNA ou RNA. A tecnologia do DNA recombinante possvel devido a descoberta das enzimas bacterianas que catalisam reaes especficas nas molculas de DNA. As enzimas podem ser agrupadas em cinco classes (AUSUBEL, et al., 2003; TORRES, 2003). Nucleases e ribonucleases - clivam a ligao fosfodister do DNA e RNA, respectivamente, e podem ter atividade exonuclesica 3' - 5' e/ou 5' - 3' ou endonuclesica. Dentre as nucleases, destacam-se as endonucleases de restrio, comumente chamadas de enzimas de restrio, que so importantes para a tecnologia do DNA recombinante. Elas clivam seqncias de DNA especficas em ambas as fitas, chamadas de stios de restrio, e podem gerar extremidades abruptas ou coesivas (Tabela 1).

Conceitos Bsicos de Tcnicas em Biologia Molecular Tabela 1. Exemplos de endonucleases de restrio com os organismos de origem e as seqncias de reconhecimento. As setas indicam os stios de clivagem (NASCIMENTO et al, 1999).

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Esse stio de reconhecimento da enzima normalmente uma seqncia palindrmica, ou seja, a seqncia de bases de uma fita a mesma da fita complementar, quando lida na direo contrria. As enzimas de restrio so nomeadas conforme o microrganismo do qual foram isoladas; a primeira letra representa o gnero, as segunda e terceira letras representam a espcie, as seguintes, geralmente, representam a linhagem e a ordem da descoberta. Ligases - catalisam a formao de uma ligao fosfodister entre grupos 3'OH e 5'-PO4-, unindo covalentemente molculas de DNA de fita dupla, resultando em uma molcula de DNA recombinante. Polimerases - catalisam a sntese de molculas de DNA a partir de um molde, ou seja, sintetizam uma nova fita de DNA, complementar a um molde de DNA ou RNA preexistente. As polimerases so DNA ou RNAdependentes e so essenciais para a replicao e manuteno de todos os organismos. Modificadoras - catalisam reaes que modificam molculas de DNA pela remoo ou adio de grupos qumicos especficos, como a remoo ou adio de grupamentos fosfato das extremidades 5'.

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Topoisomerases - modificam a conformao do DNA circular pela induo ou remoo de superenrolamento.

1.3. PCR
A reao em cadeia da polimerase (PCR) um procedimento rpido que possibilita a amplificao in vitro de fragmentos de DNA especficos, partindo-se de uma quantidade mnima de DNA alvo ou de RNA previamente convertido em cDNA. Para a aplicao da tcnica, so necessrios trs segmentos de cidos nuclicos: a dupla fita de DNA para servir de molde e a construo de dois oligonucleotdeos (primers) especficos - de fita simples e complementares as duas fitas molde de DNA -, desenhados de modo a flanquear a seqncia a ser amplificada. Alm disso, so necessrios DNA polimerase, dNTPs, tampo e sais (MgCl). A tcnica consiste de ciclos repetitivos; cada ciclo est dividido nos passos apresentados na Figura 3 (AUSUBEL, et al., 2003; WEAVER, 2001). 1 passo (94-96C) - Desnaturao do DNA a alta temperatura, devido ao rompimento das pontes de hidrognio que unem as duas fitas. 2 passo (30-60C) - Anelamento dos primers em posies especficas (essa temperatura definida em funo da seqncia nucleotdica dos primers). 3 passo (72-75C) - Extenso da seqncia a ser amplificada pela ao da DNA polimerase. Durante cada ciclo, as fitas complementares de DNA so copiadas pela extenso dos primers que se anelam em posies opostas. Desta forma, cada fita de DNA recm amplificada usada como molde no ciclo seguinte, resultando assim, no acmulo exponencial do fragmento de DNA flanqueado pelos dois primers (Figura 4). Para o isolamento de um gene especfico podem ser utilizadas diferentes estratgias de PCR (S et al., 2002; WEAVER et al., 2001): RT-PCR

Conceitos Bsicos de Tcnicas em Biologia Molecular Fig. 3. Etapas da PCR - Reao em Cadeia da Polimerase.

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Fig. 4. Esquema de amplificao exponencial de um gene por PCR.

(amplificao de seqncias de cDNA); RACE-PCR (amplificao das extremidades 3' e 5' de seqncias de cDNA); Tail-PCR (isolamento de segmentos de DNA adjacentes a seqncias conhecidas) e PCR inverso (isolamento de seqncias que flanqueiam uma regio genmica conhecida).

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1.4. Eletroforese em gel de agarose

A eletroforese em gel de agarose um mtodo simples e eficiente que permite separao, identificao e purificao de molculas de DNA. As molculas so separadas atravs da migrao de partculas no gel, com a aplicao de uma diferena de potencial eltrico, onde as molculas de menor massa migram mais rpido. O protocolo padro de gel de agarose permite separar fragmentos de DNA entre 0,5 a 25 kb. A eletroforese tambm pode ser utilizada para separar protenas e molculas de RNA. A agarose utilizada no gel um polissacardeo que forma uma rede e permite regular a velocidade da migrao das molculas durante a separao. A adio de corante fluorescente (brometo de etdio ou sybr), que se intercala entre as bases do DNA, e o uso de radiao ultravioleta permitem a visualizao e a fotografia, conforme Figura 5 (NASCIMENTO et al., 1999; SOUZA, 2003).

Fig. 5. - Eletroforese de fragmentos de PCR amplificados; (M - marcador de peso molecular).

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1.5. Clonagem de produtos de PCR

A Taq DNA polimerase adiciona um resduo de deoxiadenosina (A) extremidade 3' das fitas de DNA, durante a amplificao por PCR. Esse Aprotuberante permite ligar o fragmento de DNA a vetores especficos, especialmente preparados, contendo um resduo de deoxitimidina (T) protuberante na extremidade 3'. A molcula do vetor tem somente um stio de clivagem para uma determinada enzima de restrio que abre o vetor na seqncia onde o inserto ser inserido. Os fragmentos de DNA oriundos da reao de PCR so misturados ao vetor linearizado juntamente com a enzima T4 DNA ligase, a qual permite a ligao entre eles, gerando uma molcula de DNA plasmidial, contendo o gene de interesse. Este plasmdeo pode ser inserido dentro de uma bactria por transformao e, ento, ser replicado. Alm do fragmento de PCR, outras molculas de DNA podem ser inseridas em vetores previamente clivados com enzimas de restrio. A DNA ligase pode atuar em ligaes de fragmentos com extremidades coesivas ou abruptas (BROWN, 2003; NASCIMENTO et al., 1999).

1.6. Plasmdeos ou vetores

Os plasmdeos so molculas de DNA fita dupla extracromossomal encontrados em todas as espcies de bactrias. Os plasmdeos variam em estrutura, tamanho, modo de replicao, nmero de cpias por clula e habilidade para propagarem-se em diferentes bactrias. Todos contm trs caractersticas comuns: marca seletiva, origem de replicao e stio mltiplo de clonagem (NASCIMENTO, 1999). A marca seletiva refere-se a genes que conferem resistncia a antibiticos e que proporcionam a seleo dos clones transformados daqueles no transformados. Para essa seleo, adicionado ao meio de cultura o antibitico adequado, em concentraes que permitam diferenciar a clula no-transformada (sensvel ao antibitico) da clula transformada (resistente ao antibitico). Os principais antibiticos utilizados nos meios de cultura para a seleo de transformantes esto apresentados na Tabela 2. A origem de replicao autnoma ou ori o stio em que se inicia a replicao do DNA, podendo se

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Conceitos Bsicos de Tcnicas em Biologia Molecular Tabela 2. Principais antibiticos utilizados como agentes seletivos e a concentrao final utilizada.

Fonte: MARANHO (2003).

replicar independentemente da replicao bacteriana e produzir milhares de cpias do plasmdeo dentro da clula hospedeira. A replicao dos plasmdeos pode ser sincronizada com o ciclo celular, resultando em baixo nmero de cpias, ou ser independente do ciclo da clula hospedeira, permitindo a proliferao de centenas de cpias por clula. O stio mltiplo de clonagem ou polylinker um stio de clivagem de endonucleases de restrio no qual inserido um fragmento de DNA de interesse sem interferir na funcionalidade do plasmdeo (BROWN, 2003; WEAVER, 2001).

1.7. Transformao celular

O processo de transformao consiste na introduo de um DNA exgeno em clulas hospedeiras, que podem ser: bactrias, leveduras, fungos filamentosos, clulas vegetais e clulas de mamferos. A clula mais comumente utilizada a clula bacteriana de Escherichia coli. O processo de transformao bacteriana utilizada na Biologia Molecular ocorre in vitro, e pode ser afetado pelo tamanho e conformao da molcula de DNA a ser introduzida na clula. Plasmdeos pequenos incorporam-se mais facilmente clula bacteriana competente. A transformao bacteriana utilizada para a preparao de DNA plasmidial, em larga escala, e para a seleo de clones recombinantes (BROWN, 2003; MARANHO, 2003a).

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A atrao do DNA pelas clulas bacterianas, em condies naturais, um evento muito raro, devido ocorrncia da repulso eletrosttica entre as cargas negativas dos fosfolpideos da membrana e as cargas negativas dos grupamentos fosfatos da molcula de DNA, esquematizada na Figura 6 (MARANHO, 2003a).

Fig. 6. Representao esquemtica da repulso eletrosttica entre as cargas negativas da molcula de DNA e a camada fosfolipdica da membrana celular.

Para a transformao bacteriana, podem-se utilizar dois diferentes mtodos de transformao: Choque trmico - Comumente chamado transformao com cloreto de clcio, um mtodo fcil e relativamente barato de transformao. Consiste na preparao das clulas, para torn-las competentes, por tratamento com cloreto de clcio ou outro on divalente (cloreto de ltio ou magnsio). Os ons atuam neutralizando as cargas negativas da membrana e do DNA. Aps um choque trmico na temperatura de 37 a 42C, criamse poros na membrana e o DNA pode alcanar o interior da clula (MARANHO, 2003b; NASCIMENTO et al., 1999). Eletroporao - um mtodo mais eficiente para transformao de clulas com DNA plasmidial. Consiste, inicialmente, na preparao das clulas com

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uma soluo aquosa para torn-las competentes e aptas a receber o DNA. As clulas so submetidas a alta voltagem (choque eltrico) que provoca uma desestabilizao da membrana externa e a formao de poros, possibilitando a entrada do DNA para o interior da clula. Esse tipo de transformao, que requer um equipamento - denominado eletroporador -, pode ser utilizado para a transformao de bactrias gram positivas e negativas, leveduras, fungos filamentosos, clulas animais e vegetais. O eletroporador deve ser ajustado para cada tipo celular, considerando os seguintes parmetros: capacitncia, intensidade e durao do pulso eltrico (AUSUBEL et al., 2003; MARANHO, 2003b).

1.8. Extrao e purificao de DNA

O isolamento de DNA cromossomal ou plasmidial um procedimento bsico e fundamental para a clonagem molecular. Existem muitas tcnicas disponveis que permitem o isolamento de DNA, porm esses mtodos possibilitam o isolamento de apenas um tipo de DNA por extrao. A purificao consiste na separao do DNA a partir dos restos celulares e das protenas, principalmente as DNases que degradam as molculas de DNA, tanto em clulas bacterianas como em clulas eucariticas. Diferentes reagentes e substncias so combinados e utilizados para esse procedimento de acordo com o tipo celular. No caso das bactrias gram negativas (E. coli), a combinao de detergentes e substncias alcalinas removem as camadas lipdicas da membrana externa e da parede celular expondo o DNA para a purificao. As protenas podem ser removidas eficientemente com a utilizao de uma mistura dos solventes orgnicos fenol e clorofrmio. Esses solventes atuam como agentes desproteinizantes, rompendo rapidamente a integridade celular e desnaturando as protenas, deixando os cidos nuclicos em soluo aquosa (BROWN, 2003; MARANHO; MORAES, 2003). O procedimento de preparao de DNA, a partir de uma cultura de clulas bacterianas, pode ser resumido da seguinte maneira: 1 - As clulas so cultivadas em meio de cultura, depois recuperadas por

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centrifugao, a partir da cultura, e concentradas no menor volume possvel. 2 - As clulas so rompidas e seu contedo liberado, formando um extrato celular. 3 - Esse extrato celular tratado e todos os seus componentes so removidos, exceto o DNA. 4 - O DNA resultante concentrado por precipitao e mantido em soluo aquosa.

1.9. Seqenciamento de DNA

A seqncia do DNA um pr-requisito para a anlise detalhada de um gene. O mtodo de seqenciamento de DNA mais utilizado o automtico, baseado no mtodo de Sanger-Coulson, desenvolvido em 1979, tambm conhecido como mtodo de terminao de cadeia, que permite determinar a ordem exata dos nucleotdeos em um segmento de DNA. No seqenciamento automtico, os nucleotdeos so marcados com quatro fluorocromos diferentes, um para cada nucleotdeo (A, C, G, T). Esse mtodo necessita de um DNA de fita simples e, normalmente, clonado em um vetor M13 ou outro vetor comercial. O mtodo baseia-se na sntese de uma segunda fita de DNA complementar ao DNA molde, na presena de um primer complementar seqncia adjacente ao stio mltiplo de clonagem do vetor. O fragmento de Klenow da DNA polimerase I inicia o elongamento da cadeia complementar a partir da extremidade 3' do primer; os deoxinucleotdeos - dNTP - (dATP - deoxiadenosina trifosfato -, dTTP deoxitimidina trifosfato -, dGTP - deoxiguanosina trifosfato -, dCTP deoxicitosina trifosfato) so selecionados de acordo com o pareamento ao molde e ligados a cadeia por ligaes fosfodister (AUSUBEL et al., 2003; NASCIMENTO et al., 1999). Como, para cada dNTP, utiliza-se um fluorocromo diferente, a eletroforese realizada em um nico canal do gel de seqenciamento. medida que os fragmentos passam pelo feixe de laser, os fluorocromos so excitados e a

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luz emitida, em diferentes comprimentos de onda, detectada por um fotomultiplicador. Esta informao traduzida na forma de seqncia por meio de um computador e apresentada no eletroferograma, apresentado na Figura 7 (AUSUBEL et al., 2003; NASCIMENTO et al., 1999).

Fig. 7. Sequenciamento automtico utilizando todos os dNTP marcados com fluorescncia (Fonte: http://educacao.genesisdbm.com.br/sequenciamento.shtml).

1.10. Anlise de DNA e RNA em blotting

As tcnicas de blotting baseiam-se nas propriedades de hibridizao das molculas de cidos nuclicos. Algumas tcnicas foram criadas propondose localizar a posio de um gene em uma molcula de DNA. Para a anlise de DNA, utiliza-se a tcnica de Southern blotting. Primeiramente, o DNA digerido com uma ou mais enzimas de restrio e separado em uma eletroforese em gel de agarose. Os fragmentos de DNA fita dupla so

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desnaturados in situ e transferidos para uma membrana de nylon ou nitrocelulose, na qual so imobilizados no mesmo padro de bandeamento do gel. A imobilizao realizada com radiao UV, para as membranas de nylon, e calor, para as membranas de nitrocelulose. A membrana colocada sobre o gel e um tampo de alta concentrao salina adicionado e, por capilaridade, passa atravs do gel, promovendo a transferncia dos fragmentos de DNA para a membrana. A membrana resultante uma rplica do gel de agarose. Sondas de RNA ou DNA marcadas com radioatividade so utilizadas, a hibridizao com o DNA fixo na membrana ocorre e uma auto-radiografia revela qual fragmento de restrio contm o gene clonado, conforme pode ser visto na Figura 8 (AUSUBEL et al., 2003; HARWOOD, 1996; WEAVER, 2001).

Fig. 8. Southern blotting. Um fragmento de DNA especfico pode ser identificado separando a mistura de fragmentos por eletroforese, transferindo para a membrana e hibridizando a seqncia com uma sonda molecular complementar e marcada com 32P

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Para a anlise de RNA, a tcnica, que anloga ao Southern blotting, recebeu o nome de Northern blotting. Um RNA extrado submetido eletroforese em gel de agarose, transferido para uma membrana e hibridizado com sondas radioativas de RNA ou DNA. Esta tcnica permite identificar em qual tecido ou tipo celular um determinado gene expresso. Para um experimento de Northern blotting, alguns cuidados para manter as solues e os materiais do experimento livres de RNases devem ser adotados at a transferncia do RNA para a membrana (HARWOOD, 1996; KYAN, 2003).

2. Minidicionrio
Atividade exonuclesica - a propriedade da enzima em clivar ligao fosfodister na extremidade de uma molcula de DNA. Atividade endonuclesica - a propriedade da enzima em clivar ligao fosfodister no interior de uma molcula de DNA. Bactria competente - uma bactria apta a receber DNA exgeno. Extremidade abrupta - produzida por algumas enzimas de restrio, tambm chamada de extremidade cega por no apresentar nucleotdeos em cadeia simples. Extremidade coesiva - produzida por algumas enzimas de restrio, apresenta um pequeno nmero de nucleotdeos em cadeia simples e permite a ligao a outro fragmento de DNA pela complementariedade das bases. Fluorocromo - corante fluorescente usado para corar amostras biolgicas, emite energia luminosa quando excitado por radiao luminosa adequada. Fragmento Klenow - fragmento protico da DNA polimerase I com capacidade de polimerizao e atividade exonucleotdica 3' - 5'.

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Transformao bacteriana - o processo que envolve a introduo de DNA exgeno na bactria competente. Vetor circular - um vetor fechado, no permite a ligao a um fragmento de DNA. Vetor linearizado - um vetor digerido por uma enzima de restrio especfica, permite a ligao a um fragmento de DNA compatvel com as extremidades. Quimera - molcula de DNA recombinante que contm seqncias gnicas de origens diferentes.

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3. Referncias Bibliogrficas
AUSUBEL, F. M.; BRENT, R.; KINGSTON, R. E.; MOORE, D. D.; SEIDMAN, J.G.; SMITH, J.A.; STRUHL, K. Current protocols in molecular biology, New York: John Wiley , 2003. 4755 p. BROWN, T. A. . Clonagem gnica e anlise de DNA. Porto Alegre: Artmed, 2003. 376 p. SOUZA, M. T. de. Anlise de DNA por eletroforese em gel de agarose. In: AZEVEDO, M. O.; FELIPE, M. S. S.; BRGIDO, M. M.; MARANHO, A. Q.; SOUZA, M.T. de. Tcnicas bsicas em biologia molecular. Braslia, DF: Universidade de Braslia, 2003. 211 p. S, M. F. G. de; BATISTA, J. A. N.; OLIVEIRA NETO, O. B.; FRAGOSO, R. R.; MONTEIRO, A. C. Clonagem e expresso de genes. Braslia, DF: Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia, 2002, 52 p. Apostila. HARWOOD, A. J. Basic DNA and RNA protocols. London: Human Press, 1996. 528 p. KYAN, C. M. Northern blot: deteco de RNA por hibridizao em membranas. In: AZEVEDO, M. O.; FELIPE, M. S. S.; BRGIDO, M. M.; MARANHO, A. Q.; SOUZA, M. T. de. Tcnicas bsicas em biologia molecular. Braslia, DF: Universidade de Braslia, 2003. 211 p. MARANHO, A. Q. Transformao bacteriana. In: AZEVEDO, M. O.; FELIPE, M. S. S.; BRGIDO, M. M.; MARANHO, A. Q.; SOUZA, M. T. de. Tcnicas bsicas em biologia molecular. Braslia, DF: Universidade de Braslia, 2003a. 211 p. MARANHO. A. Q.; MORAES, L. M. P. Extrao e purificao de DNA. In: AZEVEDO, M. O.; FELIPE, M. S. S.; BRGIDO, M. M.; MARANHO, A. Q.;

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SOUZA, M. T. de. Tcnicas bsicas em biologia molecular. Braslia, DF: Universidade de Braslia, 2003b. 211 p. NASCIMENTO, A. A. C.; ESPREAFICO, E. M.; LARSON, M. L. P.; MONESI, N.; ROSSI, N. M. M.; RODRIGUES, V. Tecnologia do DNA recombinante. Ribeiro Preto: Universidade de So Paulo, 1999. 85 p. Apostila. TORRES, F. A. Principais enzimas modificadoras de cidos nuclicos. In: AZEVEDO, M. O.; FELIPE, M. S. S.; BRGIDO, M. M.; MARANHO, A. Q.; SOUZA, M. T. de. Tcnicas bsicas em biologia molecular. Braslia, DF: Universidade de Braslia, 2003. 211 p. WEAVER, R. F. Molecular biology. Lawrence: University of Kansas, 2001. 880 p.

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