UNIVERSIDAD AUTONOMA DE CHIAPAS Facultad de Ciencias Qumicas Campus IV Tapachula

PRACTICA NUM. :4: GRUPOS SANGUINEOS INTEGRANTES: Menchu Mndez Rosario Aurora Nuila Menchu Omayra Maricela Torres Moreno Roco del Carmen Zamudio Castellanos Fabiola Yeseline GRUPO Y SEMESTRE: Sptimo semestre grupo A CATEDRATICO: Q.F.B. Y E.H.D.L Luis Humberto Rosales Furucawa

Tapachula Chiapas a 3 de noviembre de 2011

LABORATORIO DE HEMATOLOGIA

OBJETIVOS

Al finalizar la prctica el alumno ser capaz: Identificar la importancia de la determinacin de los grupos sanguneos. Tipificar los grupos sanguneos ABO/ABH y Rh. Comprobar los grupos sanguneos con la prueba inversa.

INTRODUCCION

Los diversos grupos sanguneos se determinan por la presencia de determinados antgenos eritrocitarios, de igual manera por los antgenos plaquetarios, leucocitarios y sricos. Dichos antgenos son el producto directo o indirecto de la actividad de los genes y se transmiten hereditariamente segn las leyes mendelianas. Dichos genes transmiten generalmente caracteres codominantes, es decir, que se transmiten tanto a individuos homocigotos como heterocigotos. Cuando la herencia de los grupos sanguneos est relacionada con la de otros, se dice que ellos constituyen un sistema de grupo sanguneo. Todos los antgenos de los grupos sanguneos han sido definidos serolgicamente por los hallazgos de los anticuerpos correspondientes. Cabe sealar que las posibles combinaciones entre los diferentes grupos sanguneos son tantas que el tipo sanguneo puede considerarse una caracterstica peculiar de cada individuo. La importancia a clnica de los antgenos sanguneos se debe a sus propiedades sensibilizantes y a la capacidad de reaccionar con sus correspondientes anticuerpos. Se han definido ms de 400 antgenos eritrocitarios, entre ellos se encuentran unos llamados <pblicos> o de alta incidencia, que estn presentes en casi todos los individuos, mientras que existen otros que son extremadamente raros denominados <privados> o de baja incidencia. El conocimiento de los antgenos y anticuerpos sanguneos es de gran importancia en la medicina clnica, especialmente en la prevencin y tratamiento de las reacciones transfusionales. Puesto que muchos de los antgenos estn ampliamente expresados en otras clulas y lquidos del organismo, pueden considerarse como sistemas de histocompatibilidad. Algunos de los antgenos eritrocitarios se encuentran expresados en el recin nacido, mientras que otros se expresan mucho despus. Los anticuerpos eritrocitarios estn constituidos fundamentalmente por inmunoglobulinas IgG, IgM y raramente IgA, estos son aloanticuerpos naturales; estos generalmente son de tipo IgM anticuerpos que no pueden atravesar la barrera placentaria, sin embargo los anticuerpos inmunes (generados ante un reto inmunolgico) son de tipo IgG y pueden atravesar la placenta, por ellos se genera la EHMF.

Las IgM son llamados Acs completos ya que son capaces de aglutinar a hemates con Ag correspondientes en medio salino, fijan el complemento y los hemates se lisan, sin embargo estos son activados a una temperatura de entre 4o C y 20 o C por lo que no tiene relevancia en la Medicina clnica, sin embargo existen algunos que se activan a 37o C (anti-A, anti-B, anti-AB) todos ellos causan hemolisis intravascular. En cambio los IgG actan a 37oC, son denominados anticuerpos incompletos o sensibilizantes porque son incapaces de aglutinar hemates en medio salino. SUERO DE COOMBS Los sueros de Coombs pueden ser poliespecficos o monoespecficos. Los llamados poliespecficos contienen, adems de los anticuerpos contra fracciones Fc de las inmunoglobulinas humanas, anticuerpos contra la fraccin C3d del Complemento que puede estar presente sensibilizando la membrana eritrocitaria, en la presencia o ausencia de anticuerpos fijados. Los sueros monoespecficos contienen anticuerpos contra solamente un tipo de inmunoglobulina (IgG, IgM o IgA) o contra fracciones del Complemento (C3c o C3d). Los anticuerpos contra la fraccin C4 no deben estar presentes en los sueros poliespecficos, para evitarse reacciones cruzadas con antgenos del grupo sanguneo Chido/Rodgers (ISBT= 017CH/RG). Sin embargo la sensibilizacin de los hemates puede ponerse de manifiesto de manera in vitro por uso de antinmunoglubulina humana como reactivo, que es un anticuerpo capaz de unirse a las molculas de IgG o de la fraccin C3d del complemento fijadas a la membrana eritrocitaria. La prueba se denomina directa cuando se aplica el estudio de hemates que pudieron ser sensibilizados in vivo en el propio organismo. La prueba ser indirecta cuando se ponga en manifiesto, mediante el mismo procedimiento, la sensibilizacin de hemates in vitro con diversos fines como; investigacin de Acs antieritrocitarios en suero problema, determinacin de fenotipo eritrocitario mediante el empleo de Acs de especificidad definida, pruebas cruzadas transfusionales, entre otras. Generalmente los anticuerpos incompletos no generan una hemolisis rpida intravascular a comparacin con los Acs completos, sino que provocan una hemolisis extravascular como consecuencia de la accin del sistema mononuclear fagoctico sobre los hemates sensibilizados. La sensibilidad esta prueba puede ser aumentada por procedimientos que cambian la primera etapa de la reaccin; es decir la fijacin de los anticuerpos durante la incubacin. Los ms utilizados son: adicin de albmina o polietilenoglicol al medio, uso de medios de baja fuerza inica (LISS) y la utilizacin de glbulos rojos ya tratados por enzimas proteolticas.

Factor Rh

Los antgenos del sistema Rh son de naturaleza proteica. El antgeno D posee la mayor capacidad antignica. Los genes responsables de este sistema se localizan en el cromosoma 1. Existen dos teoras sobre el control gentico: Teora de Fisher: Tres genes C, D, E (presentan antgeno D aquellas combinaciones que contengan el alelo D como por ejemplo cDe). Teora de Wiener: En determinados casos se expresa un antgeno D dbil Du (rh-) como consecuencia de: 1. La represin del gen D por un gen C en posicin trans (cromosoma opuesto). 2. La existencia de un alelo Du. 3. La formacin de un antgeno D incompleto.

Teora de Tippet (1986): Tippet emite la teora de la existencia de dos genes RHD y RHCD, que son secuenciados en 1990 por Colin y colaboradores. La enfermedad del Rh es provocada por una madre Rh- que concibe un hijo Rh+. Los anticuerpos de la sangre materna destruyen los Rh+ del beb. Si la madre piensa tener un segundo hijo debe aplicarse una vacuna que elimina los anti-Rh, llamada la gammainmunoglobulina. sta debe ser aplicada dentro de las 72 horas despus del primer parto, ya que si se tiene un segundo bebe con Rh+ la madre producir anti-Rh en exceso que destruir la sangre del hijo, produciendo una enfermedad llamada Eritroblastosis fetal (anemia severa), si es que el hijo nace, porque por la produccin en exceso de los anti-Rh el hijo puede morir intrauterinamente. Los grupos sanguneos Rh (descubierto por Landsteiner y Wiener en 1940) tiene un inters clnico similar a los grupos ABO dada su relacin con la enfermedad hemoltica del recin nacido (EHRN) y su importancia en la transfusin.

MATERIAL

EQUIPO: Centrifuga Bao Maria

A) BIOLOGICO Muestra sangunea obtenida con EDTA, eritrocitos conocidos de los grupos A, B , eritrocitos sensibilizados ( A, A1, B, O , RH )

B) DE LABORATORIO Gradillas, Placas de aglutinacin, tubos de ensaye de 12 x 75, aplicadores de madera, Pipetas Pasteur.

C) REACTIVOS Sueros hemotificadores, albumina, suero de Coombs ( antiglobulina humana) , SSI.

METODOLOGIA En tubo (mtodo directo) 1) Obtencin de la muestra sangunea. Separacin del plasma y concentrado Eritrocitario, mediante centrifugacin: 2500 rpm/5min.
2) Una vez separado el plasma, se realiza un lavado al concentrado eritrocitario. Se agrega solucin salina y procedemos a centrifugar 5 min/2500 rpm. Repetir el procedimiento 3 veces.

3) Preparar una solucin al 1 % de eritrocitos con solucin salina isotnica.

0.1 ml de concentrado eritrocitario + 9.9 SSI. Homogenizar con cuidado

4) Colocar 7 tubos de ensaye y agregarle lo siguiente, primero se agregan los Acs (1 gota d c/reactivo). 1. - Anti-A 2. - Anti-A1 3. - Anti-B 1 2 3 4 5 6 4.-Anti-AB 7 8 1 5.- Anti-D 6.- Albmina 7.- Coombs 8.- Suero del paciente (testigo).

5) Agregar una gota de la solucin de eritrocitos a cada uno de los tubos que contienen los reactivos.

6) Homogenizar y centrifugar 2500 rpm/1 min.

1 1 2 3 4 5 1 6 7 8

2 3

4 5 1

6 7 8

7) observar los tubos despus de la centrifugacin, observar la presencia de aglutinacin moviendo los tubos con cuidado.

2 3

4 5 1

6 7 8

En tubo (mtodo inverso)

1) Obtencin de la muestra sangunea. Separacin del plasma y concentrado Eritrocitario, mediante centrifugacin: 2500 rpm/5min. Separar el plasma.

2) Colocar en tubos una gota del plasma (muestra problema) despus los eritrocitos sensibilizados del grupo (1 gota de cada uno): 1.- A1 2.- A2 1 2 3 4 3.- B 4.- O 5.- O

6) Homogenizar y centrifugar 2500 rpm/1 min.

7) observar los tubos despus de la centrifugacin, observar la presencia de aglutinacin moviendo los tubos con cuidado.

2 3

2 3

Determinacin de la variante D

1) Poner una gota de la suspensin de eritrocitos de la sangre de la muestra problema en un tubo de ensaye. Agregar una gota de suero anti-D

2) Incubar a 37 C durante 15 minutos. Despus centrifugar 2500 rpm/1 min.

3) Los glbulos rojos no deben estar aglutinados, puesto que indicara que es positivo; y necesitamos que este negativo para continuar con la prueba.

4) Despus de cerciorarse que el resultado es negativo, se agrega SSI, centrifugamos. Este procedimiento se repite tres veces.

5) Decantar el sobrenandante del ltimo lavado. Agregar una gota del suero de Coombs, homogenizar. Centrifugar 2500 rpm/1min. Observar si hay o no aglutinacin. Las Du positivas aglutinaran, si no aglutinan se informa como Rh negativo, Du negativo.

6) Para mayor confianza de la prueba, se realiza un consumo de Coombs, que consiste en agregar eritrocitos Rh positivos sensibilizados. Con lo cual debemos observar aglutinacin, de lo contrario se realizara de nuevo la prueba.

Mtodo en placa 1) En una placa de porcelana colocar una gota de los siguientes rx: 1. - Anti-A A A1 B AB Rh 2. - anti-A1 3. - anti-B 4. - anti-AB 5. - anti-D

1) A cada uno de los pocillos de la placa, agregar una gota de la suspensin de eritrocitos al 1%. Homogenizar con un palillo de madera (uno por cada pocillo); continuar agitando la placa por rotacin durante dos minutos.

A A1 B AB

Rh

3) observar la placa, buscando aglutinacin; cuya presencia significa un resultado positivo.

OBSERVACIONES

RESULTADOS A) Mtodo en placa

FOTO

Grupo: A

Rh: Positivo (+)

B) Mtodo en tubo

FOTO Grupo: A Rh: Positivo (+) Tubo control Negativo: Negativo Tubo de Coombs: Negativo Tubo testigo: Negativo

C) Prueba inversa

Tubo A1: Negativo Tubo A2: Negativo FOTO Tubo B: Positivo Tubo O: Negativo D) Investigacion de la variante Du Tubo O: Negativo

Rh: Negativo Du Negativo FOTO

DISCUSIONES

La literatura menciona que los pacientes con sangre del tipo A tienen glbulos rojos que expresan antgenos de tipo A en su superficie y anticuerpos contra los antgenos B en el plasma de su sangre y los pacientes con sangre del tipo B tiene la combinacin contraria; glbulos rojos con antgenos de tipo B en su superficie y anticuerpos contra los antgenos A en el plasma. Mediante la realizacin de la prctica lo pudimos observar, a travs de la aglutinacin que no es ms que la reaccin de los antgenos presentes en membrana de los eritrocitos y los anticuerpos del plasma del paciente. Tambin pudimos comprobar que los individuos con sangre del tipo O 0 (cero) no expresan ninguno de los dos antgenos (A o B) en la superficie de sus glbulos rojos pero tienen anticuerpos contra ambos tipos, mientras que las personas con tipo AB expresan ambos antgenos en su superficie y no fabrican ninguno de los dos anticuerpos.

CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFIA

Sans J. et al. (2006). Hematologa Clnica. Editorial Elvesier. 5 edicin. Pg. 809-811. Miale J. (1985). Hematologa: Medicina de laboratorio. Editorial Reverte. Pg. 536, 537.