Practica N08

MEDIOS DE DIFERENCIACION BIOQUIMICA INTERPRETACION

INTRODUCCION

El metabolismo es toda una serie de reacciones que ocurren en los seres vivos. Estas reacciones incluyen procesos de obtencin de energa como son: la composicin de molculas orgnicas en los quimitrofos (catabolismo) o la captacin de luz para el caso de los fottrofos, as como de sntesis de material celular a partir de nutrientes esenciales (anabolismo). Todas las reacciones metablicas, son catalizados por enzimas que en su mayora funcionan dentro de la clula por lo que se conocen como endoenzimas principalmente hidroliticas que son liberad por la clula para catalizar reacciones fuera de esta. En el laboratorio es posible conocer las caractersticas metablicas de los microorganismos, inoculando en diferentes medios de cultivo, con sustratos que pueden utilizar como fuente de energa, fuente de carbono y de otros nutrientes esenciales para su crecimiento. La mayora de microorganismos, utilizan la glucosa como fuente de carbono y energa .Al entrar a la celula la glucosa ser oxidada en forma incompleta (fermentacin) o completa (respiracin) dependiendo de la presencia de oxigeno y de las capacidades enzimticas de los microorganismos. En la fermentacin de los microorganismos obtienen 1-2ATP/mol de glucosa y liberan cidos orgnicos u otras pequeas molculas orgnicas como productos metablicos, mientras que las bacterias y levaduras de catabolismo respiratorio obtienen mayor cantidad (36-38ATP/ mol de glucosa), CO2 y agua .Algunas especies microbianas pueden ser de tipo respiratorio o fermentativo de acuerdo a las condiciones de oxigenacin. Se han propuesto numerosas pruebas bioqumicas en medios de cultivo con indicador de ph para detectar la produccin de acido o lcali ;con inhibidores selectivos como bilis,cianuro,colorantes,sulfuros,etc,que facilitan la determinacin de diferentes actividades metabolicas como son :la capacidad para fermentar carbohidratos(glucosa,lactosa,sacarosa),catabolizar aminocidos y urea,la produccion de enzimas especificas de tipo endo o exo como oxidasas,reductasas,amilasas,lipasas,etc.

Como se ha observado en prcticas anteriores, algunas bacterias y levaduras tienen caractersticas coloniales y microscpicas muy similares, lo que no permiten decidir si dos cultivos bacterianos o de levaduras morfolgicamente similares pertenecen a una misma especie. Con algunas pruebas bioqumicas es posible su diferenciacin e incluso su identificacin. Cuando el nmero de pruebas es suficientemente amplio.

FUNDAMENTO
Prueba de reduccin de nitratos a nitritos: La prueba se basa en basa en la reduccin del nitrato a nitrito o gas nitrgeno por medio de la enzima nitrato reductasa, es un proceso de oxidacin por el cual el nitrato proporciona oxgeno para ser usado como aceptor de electrones. El nitrito presente en el medio puede detectarse con el reactivo de Griess A y Griess B Britania, dando un compuesto diazoico coloreado. Si se observan burbujas en el medio, stas son de gas nitrgeno, ya que el nitrito intermediario inhibe las decarboxilaciones. Esta prueba ayuda en la determinacin de Enterobacterias gran positivas. Prueba de la Catalasa: La base de esta prueba es demostrar la presencia de la enzima catalasa. La catalasa es una enzima que descompone al perxido de hidrgeno (forma txica del oxigeno) en oxgeno y agua. Esta enzima es similar a la estructura de la hemoglobina. Debido a que el oxgeno es un oxidante poderoso y un excelente aceptor de electrones para la respiracin, siendo su forma normal conocida como triplete de oxgeno, sin embargo una forma habitual del oxgeno txico se denomina singlete de oxgeno, esta es una forma de mayor energa en el que la capa ms externa de electrones que rodean al ncleo se hacen altamente reactivos y son capaces de llevar a cabo una serie de oxidaciones indeseables, dentro de la clula. El singlete de oxgeno se produce tanto fotoqumicamente como bioqumicamente; esta ltima forma es por la reaccin de las peroxidasas. Otras formas altamente txicas de oxgeno incluyen el anin superxido (O2-), perxido de hidrgeno (H2O2) y el radical hidroxilo (HO2). Con tantas formas txicas del oxgeno no es de extraar que los microorganismos hayan desarrollado formas enzimticas capaces de destruirlos. Entre estas formas enzimticas est la catalasa, la peroxidasa y la superxido dismutasa. Excluyendo al gnero Streptococcus y algunos otros la mayora de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas tienen catalasa. Prueba del Indol: Mediante esta prueba se detecta la liberacin de indol (molcula heterocclica, con estructura bicclica que consiste en un anillo de seis miembros -benceno unido a otro de cinco miembros -pirrol) en un cultivo

bacteriano. Dicha liberacin se debe a la degradacin del aminocido triptfano mediante el enzima triptofanasa (desaminacin reductiva). Las triptofanasas catalizan la reaccin de desaminacin, durante el cual se remueve el grupo amino (NH2) de la molcula de triptfano. Los productos finales de la reaccin son el indol, cido pirvico, amonaco (NH3) y energa. Como coenzima de la reaccin se requiere al fosfato de piridoxal. Para la deteccin del indol se usa el reactivo de Kovacs que se puede preparar con los siguientes ingredientes: Ingredientes Cantidad Alcohol amlico o isoamlico (puede 150 ml. sustituirse por cido butlico). p-dimetilamino-benzaldehdo 10 g. HCl (concentrado) 50 ml.
Constitucin del Reactivo de Kovacs

Prueba de la Oxidasa: El objetivo de la prueba Oxidasa es buscar la presencia de la enzima Citocromo C oxidasa. Se trata de un enzima que oxida el citocromo C de la cadena transportadora de e. Los citocromos contienen ferroporfirina (grupo hemo), se encuentran en clulas aerbicas, algunos en la membrana interna mitocondrial donde secuencialmente transportan electrones a partir de diferentes deshidrogenasas hasta el O2. Otros se ubican en el retculo endoplsmico. El Citocromo C oxidasa se detecta utilizando el tetra-p-fenilendiamina: el reactivo de oxidasa contiene este compuesto que va a ser oxidado por la citocromo C oxidasa. En estado reducido es incolora, pero cuando se oxida vira a prpura. Hidrlisis de la Urea: Para esta prueba es necesario el Caldo Urea. El Caldo de urea es un medio muy pobre y bastante tamponado que permite determinar la presencia de la actividad de la enzima hidroltica ureasa, cuya actividad provoca la degradacin de la urea presente en el medio (un 2% p/v) a CO2 y Amonio, con la consiguiente alcalinizacin. Este cambio de pH es detectado por cambio de color

del indicador azul de bromotimol desde el verde original al azul intenso. Tambin es vlido usar el reactivo indicador Rojo de Fenol el cual vira por la alcalinizacin del medio a un rojo grosella. Rojo de Metilo/Voges-Proskauer: Estas dos pruebas permiten la diferenciacin dentro de las enterobacterias del grupo coli y aergenes. Las enterobacterias son anaerobios facultativos que utilizarn la glucosa en dos fases: primero la metabolizarn aerobiamente (respiracin oxibintica-oxidativa) consumiendo rpidamente el oxgeno del medio, para, en segundo lugar, continuar metabolizndola por va anaerobia (fermentacin). sta puede ser de dos tipos:

Fermentacin cido mixta: La realizan las bacterias del grupo de E.coli y los productos finales son cidos orgnicos (cidos frmico, actico, lctico y succnico) que provocan un fuerte descenso del pH inicial del medio. Puede detectarse por el viraje del indicador de rojo de metilo que permanece amarillo por encima de pH 5,1 y rojo por debajo de 4,4. Fermentacin butiln gliclica: La realizan las bacterias del grupo Klebsiella-Enterobacter (antiguo aergenes). Los productos finales son compuestos neutros como el butanodiol y el etanol, producindose acetona como intermediario que podr ser detectada aadiendo al medio KOH (reactivo A de Voges-Proskauer) y alfa-naftol (reactivo B de VogesProskauer) que reaccionarn con este compuesto produciendo un color rojo caracterstico.

Para la realizacin de estas dos pruebas se cultiva el microorganismo en caldo RMVP (Red Metil Voges-Proskauer) conocido tambin como medio de Clark y Lubs. Medio MR-VP: El Medio MR-VP es utilizado para la diferenciacin de organismos coliformes en base a las pruebas de Rojo de metilo y Voges-.Proskauer. En 1915 Clark y Lubs demostraron que las bacterias del colon de la familia aerogenes podan dividirse en dos grupos en base a su accin en un medio con dextrosa y peptona. Cuando se probaron con el Rojo de Metilo como indicador de pH, el grupo de coliformes produca una gran cantidad de cido mientras que el grupo de los aergenos produca una reaccin menos cida. La prueba para detectar a los altos productores de cido es conocida como Rojo de Metilo (MR). La prueba para detectar a los menos productores de cido est basada en el procedimiento que describieron Voges y Proskauer en 1898 donde se presenta una reaccin colorida cuando los cultivos se incuban en un medio conteniendo dextrosa y peptona y se les adiciona hidrxido de potasio exponindolos al aire. Esta reaccin pone de

manifiesto la formacin de acetilmetilcarbinol y es conocida como la prueba de Voges-Proskauer (VP). En este medio las peptonas proporcionan la fuente de carbono y nitrgeno. La dextrosa es el carbohidrato fermentable y el fosfato acta como buffer.

Constitucin del Caldo MRVP Metil Red Voges Proskauer

Mezcla de Peptonas Dextrosa Fosfato de potasio pH

7.0 5.0 5.0 6.9 0.2

Prueba del Agar Citrato de Simmons : La utilizacin de citrato como nica fuente de carbono es una prueba til en la identificacin de enterobacterias. La utilizacin de citrato como nica fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo con citrato como nica fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinizacin del medio. Este aumento del pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6.

Resultados positivos y negativos de la Prueba Agar Citrato de Simmons

Prueba del cido Fenil Pirvico. La desaminacin produce cido fenilpirvico que se detcta a travs de una prueba colorimtrica. La fenilalanina es un aminocido que en detrminados microorganismos puede transformarse por desaminacin oxidativa en APP (cido fenil pirvico), el cual con una reaccin de cloruro frrico produce una coloracin verde. Prueba de la Descarboxilacin de la Lisina (Prueba LIA -Lysine Iron Agar Agar Lisina Hierro): Esta prueba se da cuando la descarboxilacin de la lisina (aminocido) da la formacin de la cadaverina que hace virar o cambiar el pH del medio hacia el lado alcalino, en donde genera CO2. La descarboxilacin de los aminocidos libera CO2 y una amina. Esta prueba permite diferenciar los microorganimos que producen descarboxilacin o desaminacin de la lisina. Se pude detectar adems la produccin de SH2 y es ms sensible que el TSI (Triple Sugar Iron) para la deteccin de SH2. Es muy utilizado para descartar Salmonella de aislamientos primaros.

Resultado positivo de la Prueba de la Descarboxilacin de la Lisina Prueba Lia- Lysine Iron Agar

Prueba de la Gelatina: La gelatina tiene la propiedad de precipitar cuando se aaden metales pesados, los microorganismos que degradan la gelatina es porque segregan enzimas hidrolticas transformando esta protena en peptonas haciendo perder la capacidad de precipitar los metales pesados.

Pruebas importantes para el diagnstico clnico de bacterias y su utilizacin ms frecuente

Prueba Fermentacin de hidratos de carbono Principio Produccin de cido y/o gas durante el crecimiento fermentativo con azcares o alcoholes azucarados Mtodo Un caldo de cultivo con hidratos de carbono y rojo de fenol como indicador de pH, tubo invertido para el gas Utilizacin ms frecuente Diferenciacin de enterobacterias (tambin para la separacin de otros gneros o especies distintos con algunos azcares determinados).

Catalasa

La enzima descompone el perxido de hidrgeno, H2O2. La utilizacin del citrato como fuente nica de carbono produce la alcalinizacin del medio.

Aadir una gota de H2O2.a un cultivo denso y buscar burbujas (O2). Un medio de citrato con azul de bromotimol como indicador de pH. Buscar un color azul intenso (pH alcalino). Mezclar una suspensin lquida densa de bacterias con plasma, incubar y buscar un cogulo de fibrina. Medio enriquecido con aminocidos. El prpura de bromocresol como indicador de pH vira a prpura (pH alcalino) si acta la enzima. Incubar una suspensin pesada de un cultivo lisado con ONPG. Buscar un color amarillo. Incubar un caldo con 12% de gelatina. Enfriar para comprobar la formacin del gel. Si se hidroliza la gelatina, el tubo permanece lquido cuando se refrigera. El H2S se detecta en un medio rico en hierro a partir de la formacin del sulfit ferrosos negro (muchas variantes: agar hierro de Kligler y agar hierro triple azcar, tambin detectan la fermentacin de los hidratos de carbono). Deteccin de indol en medio de cultivo con dimetilaminobenzaldehido (color rojo). Caldo de glucosa. Despus de la incubacin, aadir indicador rojo de metilo a la muestra. Caldo con nitrato. Tras la incubacin, detectar nitrito con cido -naftilamina sulfanlico (color rojo). Si es negativo, confirmar que el NO3- est an presente aadiendo polvo de zinc para reducir el NO3- a NO2. Si tras la adicin del zinc

Utilizacin del citrato.

Bacillus (+) de Clostridium (); Streptococcus (-) de Micrococcus-Staphylococcus (+). Klebsiella-Enterobacter (+) de Escherichia (-), Edwarsiella () de Salmonella (+)

Coagulasa

La enzima provoca la aglutinacin del plasma sanguneo.

Staphylococcus aureus (+) de S. epidermis (-)

Descarboxilasas (lisina, ornitina, arginina). Prueba de la Galactosidasa (ONPG)

La descarboxilacin de los aminocidos libera CO2 y amina.

Ayuda a la determinacin del grupo bacteriano entre las enterobacterias.

Licuefaccin de la gelatina

El ortonitrofenil--galactsido (ONPG) es un sustrato artificial para la enzima. Cuando se hidroliza, se forma el nitrofenol (amarillo) Muchas hidrolasas hidrolizan la gelatina y destruyen el gel.

Citrobacter y Arizona (+) de Salmonella (-). Identificacin de algunas especies de Shigellla y Pseudomonas. Ayudar a la identificacin de Serratia, Pseudomonas, Flavobacterium, Clostridium.

Produccin de sulfuro de hidrgeno (H2S)

La produccin de H2S por rotura de los aminocidos azufrados o reduccin del tiosulfato.

En enterobacterias, ayudar a la identificacin de Salmonella, Arizona, Edwarsiella y Proteus.

Prueba del Indol

Conversin del triptfano de las protenas en indol (molcula cclica). Los fermentadores mixtos de cidos producen suficiente cido para disminuir el pH por debajo de 4.3 El nitrato como aceptor de electrones alternativo, reducido a NO2- o N2.

Prueba del rojo de metilo

Reduccin del nitrato

Distinguir Escherichia (+) de Klebsiella (-) y Enterobacter (); Edwarsiella (+) de Salmonella (-) Diferenciar Escherichia (+, cultivo rojo) de Enterobacter y Klebsiella (generalmente-, cultivo amarillo). Ayudar a la identificacin de enterobacterias (generalmente +).

Prueba de la oxidasa

El citocromo C oxida al aceptor de electrones artificial: tetrametail (o dimetil)-pfenilendiamina.

Prueba de la oxidacinfermentacin (O/F).

Algunos organismos producen cido solamente cuando crecen en aerobiosis.

no hay color, entonces NO3NO2- . Caldo o agar. Las colonias oxidasa positivas en agar pueden detectarse sumergiendo la placa en un reactivo y buscando colonias azuladas o marrones. Produccin de cido en la parte alta del tubo de cultivo que contiene azcar; el agar blando se utiliza para disminuir la mezcla durante la incubacin

Separar Neisseria y Moraxella (+) de Acinetobacter (-). Separar enterobacterias (todas). De pseudomonas (+). Ayudar a la identificacin de Aeromonas (+). Diferenciar Micrococcus (produccin de cido solamente en aerobiosis) de Staphylococcus (produccin anaerbica de cido). Caracterizar Pseudomonas (produccin aerbica de cido) de enterobacterias (produccin anaerbica de cido). Caracterizar el gnero Proteus y el grupo Providencia.

Prueba de la fenilalanndesaminasa

La desaminacin produce cido fenilpirvico que se detecta en una prueba colorimtrica.

Hidrlisis del almidn

El yodo-ioduro da un color azul con el almidn.

Prueba de la ureasa

La urea (H2N CO NH2) se escinde en 2 NH3 + CO2

Prueba del VogesProskauer

La acetona es producida a partir de la fermentacin de azcares.

Medio enriquecido en fenilalanina. Despus del crecimiento, aadir cloruro frrico y buscar el color verde Crecimiento de un organismo en una placa que contiene almidn. Sumergir la placa en ioduro de Gram y buscar las zonas claras alrededor de las colonias. Medio con un 2% de urea y rojo de fenol como indicador. La liberacin de amonio eleva el pH, intenso de color rojo rosado Prueba qumica para acetona utilizando -naftol.

Identificar los hidrolizadores tpicos de almidn como Bacillus spp.

Dsitinguir Klebsiella (+) de Escherichia (-). Distinguir Proteus (+) de Providencia (-)

Separar Klebsiella y Enterobacter (+) de Escherichia (-). Caracterizar los miembros del gnero Bacillus.

Azul de timol Prpura de m-cresol 4- Dimetilaminoazobenzol Azul de bromofenol Rojo de Congo Naranja de metilo Verde de bromocresol Indicador mixto Rojo de metilo

Zona de viraje pH 1,2 2,8 1,2 2,8 2,9 4,0 3,0 4,6 3,0 5,2 3,1 4,4 3,8 5,4 4,4 5,8 4,4 6,2

Cambio de color rojo amarillo rojo a amarillo rojo a anaranjado amarillento amarillo a violado rojizo violeta azulado a naranja rojizo rojo a anaranjado amarillento amarillo a azul violado rojizo a verde rojo a anaranjado amarillento

Tornasol Prpura de bromocresol Rojo de bromofenol Azul de bromotimol Rojo de fenol Rojo neutro Rojo de cresol Prpura de m-cresol Azul de timol Fenolftalena Timolftalena Amarillo de alizarina GG Azul de psiln

5,0 8,0 5,2 6,8 5,2 - 6,8 6,0 7,6 6,4 8,2 6,8 8,0 7,0 8,8 7,4 9,0 8,0 9,6 8,2 9,8 9,3 10,5 10,0 12,1 11,6 13,0

rojo a azul amarillo a prpura amarillo anaranjado a prpura amarillo a azul amarillo a rojo rojo azulado a amarillo anaranjado amarillo a prpura amarillo a prpura amarillo a azul incoloro a violado rojizo incoloro a azul amarillo claro a amarillo pardusco anaranjado a violeta

Indicadores de cidos y bases ms utilizados en las pruebas de Diagnstico Clnco

PROCEDIMIENTO
Materiales, Equipos y Reactivos:

Tubos de prueba Placa petri Mechero Papel de filtro whatman Caldo nutritivo cido sulfanlico Caldo rea Caldo rojo de metilo Cloruro frrico Agar LIA Caldo lactosa Agar gelatina Solucin clorhdrica Col. De dihidrocloruro de tetrametil parafenilendiamina Aguja y asa de kolle Gradilla Algodn Estufa a 35C Solucin de perxido de hidrgeno Agar nutritivo cido tartrico Reactivo de Kovac`s Agar citrato de Simmons Agar TSI Caldo glucosado Agar almidn Lugol

Procedimiento: Reduccin de Nitratos a Nitrititos: Se realiza la siembra en caldo de nitrato, luego de la incubacin a 37C por un tiempo de 24 a 48h, se adiciona el reactivo de Griebs al cultivo. Reactivo de Griebs

Caldo de nitrato Prueba de Indol: Se realiza la siembra en caldo de triptona, luego de la incubacin a 37C por 24h se adiciona el reactivo de KOVACS de 2 a 3 gotas. Reactivo de Kovac`s

Caldo de triptona Asimilacin de Citrato: Se realiza la siembra en Agar de Citrato de Simmons, luego se incuba a 37C por 24h

Tolerancia al Cianuro de Potasio: Se realiza la siembra en un caldo nutritivo de 2ml que contiene 0.1ml de KCN, luego se realiza la siembra y se procede ala incubacin a 37C por 24h.

Descarboxilacin de la lisina: Se realiza la siembra por picadura profunda en Agar La, se procede a la incubacin a 37C por 24h

Formacin de cido fenil pirvico: Se realiza la siembra en agar nutritivo, luego se procede a incubar a 37C por 2448h, para realizar la lectura se agrega Cl3Fe de 2 a 3 gotas Cl3Fe

Oxidacin fermentativa de la glucosa: Se realiza la siembra por picadura profunda en dos tubos, luego uno de ellos se agrega cera lquida, incubacin de 37C por 24-48h.

Hidrlisis de la Urea: Se realiza la siembra en el caldo de la urea, incubacin de 37C por 24h.

Prueba de la Oxidasa: Se obtiene papel de filtro watman impregnado con solucin de Dihidrocloruro de tetrametil parafenilendiamina, luego con una asa de koller, se realiza una estria sobre el papel y se observa la reaccin.

Prueba de la catalasa: En un porta objeto se coloca la cepa, luego se agrega 2 a 3 gotas de peroxido de hidrogeno y se observa el desprendimiento de oxigeno.

Hidrlisis de la gelatina: Se realiza la siembra por estras del microorganismo en la placa petri que contiene agar, incubar a 37C por 24horas luego de esto se agrega gotas de solucin clorhdrica y se expone por un minuto, luego enjuagar con agua corriente. Cl3Mg

Hidrlisis del almidn: Se realiza la siembra por estras por un agar de almidn al 1% en placa petri, incubar a 37C por 24horas, se adiciona gotas de lugol sobre la placa.

lugol

I.

RESULTADOS:

Salmonella typhi
PRUEBA Reduccin de nitritos a nitratos Prueba de Indol Prueba de citrato de Simmons (P. de asimilacin de citrato) Descarboxilacin de la lisina RESULTADO Positivo con formacin de nitritos Negativo Positivo, se produce una alcalinizacin por el amoniaco Positivo , se produce una alcalinizacin en el pH COLORACIN Rojo ladrillo Amarillo Azul

Amarillo en la superficie y morado en la parte de abajo siendo este ms intenso Coloracin amarilla, no concuerda con el coloracin verde propia de las desaminacin oxidativa

Formacin de APP (acido fenil piruvico)

Negativo,no hay cambios

Reduccin de nitritos a nitratos (Rojo ladrillo)

Prueba de Indol (Amarillo)

Prueba de citrato de Simmons (P. de asimilacin de citrato) (Azul)

Formacin de APP (acido fenil piruvico)

CONLUSION

Los microorganismos mueren con la presencia de los nitratos al ser esta una sustancia toxica. La salmonella typhi descompone al nitrato en nitrito aprovechando el oxigeno que es liberado para su proceso de respiracin Las granallas de zinc sirven para confirmar que la reaccin es negativa y que hay presencia de nitratos en la muestra adems de descartar la posibilidad que el microorganismo haiga degradado o reducido el nitrato a nitrgeno Si en la prueba de reduccin de nitrato a nitrito al confirmar con las granallas de zinc no hay cambio de color es porque el microorganismo ha degradado hasta el final el nitrato y es muy vido de oxigeno por lo que se podra decir que el microorganismo es un aerobio estricto. La reduccin total del nitrato es nitrgeno o nitrgeno celular. La salmonella tiphy nos dio negativo en la prueba del indol debido a que no puede degradar el triptfano del caldo triptona. El reactivo de griess reacciona con los nitritos y debido a esto para saber si el nitrato fue degradado por el microorganismo se le debe agregar este reactivo dndonos un color rojo ladrillo como prueba positiva. La alfanaftilamina es la que detecta el nitrito pero en las condiciones que le da el acido sulfanlico y el acido tartrico. En la prueba de la catalasa la enzima descompone el perxido de hidrogeno en agua y O2 ,debido a esto se producen las burbujas formadas.

DISCUCION

Segn BROCK MICHAEL T. MADIGAN, JOHN M. MARTINKS & JACK PARKER (1998) los microorganismos que al reducir los nitratos a travs de la enzima nitrato reductasa, liberan gas nitrgeno, producen un resultado falso negativo con la metodologa detallada previamente. Por eso, ante un resultado negativo, agregar unas granallas de Zinc y observar el color desarrollado. Esto permitir dar el resultado definitivo de la prueba de reduccin de los nitratos. Este enunciado fue comprobado en la experiencia de laboratorio. Segn LA UNIVERSIDAD DEL ZULIA (2003) en la prueba del indol ciertos microorganismos forman Indol por descomposicin del aminocido triptfano (indol-alanina) presente en la triptona. Despus del periodo de incubacin, la presencia del Indol se reconoce con el reactivo de Kovacs, integrado por p-dimetil-amino-benzaldehido, alcohol amlico y HCl concentrado, con el cual forma un estrato superficial de color rojo en el tubo de reaccin; en la prctica al realizar esta prueba con la salmonella tiphy nos dio una coloracin roja al adicionar el reactivo de Kovacs lo que nos indica que la salmonella puede degradar al triptfano. Segn LA UNIVERSIDAD DEL ZULIA (2003) en la prueba de VogesProskauser el periodo de incubacin es de 24-48 horas utilizando el medio M.R.-V.P. (caldo glucosado-sal peptona), esta reaccin consiste en establecer la formacin de acetilmetil- carbinol o acetona, producida por ciertos microorganismos a partir de la glucosa, con el reactivo de Barrit, constituido por alfa-naftol y KOH ; sin embargo en la gua de prctica se especifica que el periodo de incubacin es de 3 das y los reactivos a usar son la creatina y el KOH . La UNIVERSIDAD DEL ZULIA (2003) nos menciona que para la prueba del rojo de metilo se debe incubar el medio M.R.-V.P. (caldo glucosado-sal peptona) por 5 das (a 35C) para luego adicionar las gotas del indicador para observar la reaccin del medio; no obstante en la gua de prctica se nos indica que el periodo de incubacin debe ser 24 horas. En la Prueba de asimilacin del citrato se debe sembrar en el agar citrato de simmons con una aguja de Kohl poco cargada e incubar a 35C durante

72-96 horas y luego observar si ha habido desarrollo del cultivo o cambio del color verde al azul ,UNIVERSIDAD DEL ZULIA (2003) ; en la prctica el periodo de incubacin del agar citrato de Simons fue 48 horas

ANEXOS