Micobacterias NO tuberculosas Gloria Isabel Meja M

Introduccin

El aumento actual de la poblacin inmunocomprometida, debido a infecciones como VIH, cncer, terapias inmunosupresoras y procedimientos invasivos, han elevado el riesgo de estas personas ha ser infectadas por una gran variedad de microorganismos, entre ellos las Micobacterias, particularmente M. tuberculosis y Micobacterias No tuberculosas (MNT). Las MNT estn ampliamente distribuidas en el ambiente y se reconocen alrededor de 125 especies diferentes y de las cuales la mayora no se relacionan como responsables de infeccin en los humanos. Una de las diferencias que existe entre el complejo de M.tuberculosis y las MNT, es su amplio rango de patogenicidad, que no se trasmiten de persona a persona adems de ser de difcil tratamiento por la frecuencia con que se presenta resistencia y recurrencia de los procesos

infecciosos en los que estn implicadas (Herdman 2004).

Las MNT son ubicuas en el ambiente, se han aislado de suelos, fuentes de agua tanto naturales como de acueducto. Algunas investigaciones (Marras 2002) muestran como la incidencia de las infecciones por MNT vara

geogrficamente. Las especies de MNT que mas se presentan como responsable de infecciones en nuestro medio son: M.avium (complejo MAC), M. kansasii, M.marinum y micobacterias de crecimiento rpido. M.avium es reportado como la MNT mas frecuente en infecciones a nivel pulmonar, en la mayora de los estudios, seguida de M.kansasii y M.abscessus. En pases del norte de Europa y Escandinavia el M. malmoense es el segundo en frecuencia. Pacientes con infeccin causada por MNT, generalmente tienen alguna enfermedad estructural del tejido pulmonar como fibrosis qustica, enfermedad obstructiva crnica, fibrosis por tuberculosis anterior o una inmunodeficiencia (Oliver 2001). En Colombia los casos reportados oficialmente de infecciones por MNT es de menos del 2%, debido a que no todos los laboratorios tienen la capacidad de identificar MNT, ni se tienen los soportes clnicos epidemiolgicos

para reportarlos como responsables de la infeccin, por lo cual es de suma importancia que el clnico suministre al laboratorio los datos del paciente que soportan su sospecha clnica. M.mariunum ha sido aislado de agua dulce y marina, relacionadas con enfermedad ocupacional (pescadores, manejo de acuarios), con trauma en piel y tejidos blandos. En muestras derivadas de heridas quirrgicas, especialmente de pacientes sometidos a procesos estticos, las MNT de crecimiento rpido son los mas aislados, tales como: M.chelonae, M.abscessus, M.fortuitun. (Correa 2009) igualmente se han reportado infecciones por MNT en procesos de hipo sensibilizacin y acupuntura. En nuestro medio se ha visto que la especie de MNT que se asla con mas frecuencia a partir de hemocultivos de pacientes con VIH-SIDA, es M.avium (Complejo MAC).

Microbiologa

El gnero de las Mycobacterias y los Actinomycetes pertenecen al orden de los Actinomycetales, el gnero Mycobacterium es el nico de la familia Mycobacteriaceae, su alto contenido en G+C (61-71 mol%) lo relacionan con otros gneros con cidos miclicos en su pared celular como son Gordona, Tsukamurella, Rhodococcus y Nocardia, con los cuales comparten el hecho de ser bacilos cido alcohol resistentes. Las Micobacterias son generalmente bacilos de forma recta, algunas veces ligeramente curvos, aerobios obligados, no mviles, cuyo tamao va de 0.2 a 0.6 m de ancho por 1 a 10 m de largo. La morfologa de la colonia vara segn la especie, pueden ir de suaves a rugosas, sin pigmento o con pigmento que puede ir de amarillo a naranja intenso debido al contenido de carotenos (Wayne 1992). Actualmente se conocen ms de 125 especies, 32 de las cuales han sido descritas en los ltimos 10 aos. La primera clasificacin propuesta para las micobacterias no tuberculosas fue la de Runyon, la cual se basa en la velocidad de crecimiento y la pigmentacin. Esta clasificacin se considera til para una identificacin inicial, sin embargo, en la actualidad se considera necesario llegar hasta la identificacin de especie por las implicaciones patolgicas y teraputicas que puede tener el identificar una u otra especie como agente etiolgico (Tortoli 2003).

Diagrama 1
Clasificacin

TIEMPO DE CRECIMIENTO

PRODUCCIN DE PIGMENTO

> 7 Das:

LENTO

< 7 das: RPIDO

NO CROMGENAS: No pigmento

FOTO CRMOGENAS: SOLO EN PRESENCIA DE LUZ

ESCOTO CROMGENO: En presencia de Luz

y oscuridad

Las MNT estn divididas en dos grupos segn el tiempo de crecimiento en crecedoras lentas y crecedoras rpidas basados en la capacidad de producir colonias visible en menos o mas de 7 das. Entre los crecedores lentos hay mas de 30 especies potencialmente patgenas y la lista de los crecedores rpidos se ha aumentado, debido a que han sido reportadas ocasionalmente nuevas especies de muestras clnicas. Lo mas importante ante un aislamiento de una MNT, es poder diferenciar entre infeccin, colonizacin o

contaminacin, debido a que la mayora de las especies son ambientales se debe tener cuenta para valorar el papel de un aislamiento de MNT de la muestra de un paciente con los criterios descritos en la siguiente tabla (Griffith 2007).
Criterios Microbiolgicos Cultivo positivo de mnimo dos muestras del mismo sitio. Baciloscopia positiva Cultivo positivo de Biopsia de tejido con histolologa con granulomas o BAAR. Cultivo positivo de muestras de origen de sitios estriles o lesiones cerradas.

Aislamiento e Identificacin

El diagnstico microbiolgico est basado en el aislamiento de la micobacteria de la muestra del paciente, utilizando mtodos estndares en el laboratorio, teniendo en cuenta que deben ser utilizados tanto medios lquidos como slidos, ( Middlebrook 7H9 y 7H11, SISTEMAMGIT 960 )(Becton Dickinson, Sparks,MD) y no solo en Lowestein Jensen ( LJ), ya que este no favorece el crecimiento de todas las MNT. Los medios lquidos permiten un crecimiento mas rpido, pero en los medios slidos es posible observar las caractersticas fenotpicas de las microcolonias y macrocolonias, lo cual es de importancia para la identificacin de especie. La baciloscopia en muestras con infecciones por MNT tiene una sensibilidad mucho menor que en tuberculosis, alcanza solo 10-15 %, se ha recomendado la coloracin con fluorocromos (Auramina Rodamina, AR) tanto para infecciones por M.tuberculosis como para MNT, por ser considerada mas sensible que la coloracin de Zielh Neelsen y Kinyoun; esta baja sensibilidad hace necesario el diagnstico de MNT por cultivo. La temperature optima de incubacin de la gran mayora de las MNT est entre 28-37C, todas las muestras tomadas de piel o lquidos de articulaciones, debe ser sembradas e incubadas a temperaturas de 28-32C y a 37C. (Brown-Elliot 2007). Las caractersticas fenotpicas de ambos grupos, crecedores rpidos y lentos vara en la apariencia de la microcolonia, macrocolonia (Fig. 1 y 2), la presencia o no de pigmentos, (Diagrama 1) , en la actividad enzimtica y en la capacidad de utilizar o reducir algunos substratos (Ejemplo Diagrama 2). La cromatografa en capa fina para anlisis de cidos grasos, perfiles de cidos miclicos mediante cromatografa lquida de alta presin (HPLC) y los mtodos moleculares, reducen el tiempo de identificacin de especie y han permitido el conocimiento de nuevas especies micobacterianas, mtodos moleculares como la secuenciacin de la subunidad 16S del ARN ribosomal (16S ARNr), PCR con enzimas de restriccin (PRA), sistemas comerciales de identificacin como AccuProbe (GenProbe, USA), INNO-LipA micobacterias (Innogenetics, Blgica) y Genotype Mycobacterias (Hain Lifescience, Alemania), son ejemplos de estas tcnicas, sin embargo su uso est limitado a los laboratorios de referencia, ya que requieren del equipos sofisticados, personal altamente calificado y tienen un gran costo para su aplicacin en pases con bajos recursos econmicos

(Leao 2004-2005). El mtodo de PRA, es uno de los mtodos moleculares mas utilizados para la identificacin genotipica de especie de MNT, ste mediante la amplificacin por PCR de un fragmento de aproximadamente 440 pares de bases (pb) del gen hsp65, que codifica para la produccin de una protena de choque trmico presente en todas las especies de micobacterias y mediante la digestin del amplicn resultante con las enzimas BstEII y HaeIII, ha permitido el anlisis de los fragmentos obtenidos, mediante su comparacin con

patrones ya publicados en la literatura (Telenti 1993) y en la internet (http://www.app.chuv.ch/prasite). Este mtodo permite la identificacin de la especie de micobacteria en aproximadamente dos das posteriores al crecimiento del microorganismo en los medios de cultivo iniciales,

disminuyendo entre una a dos semanas el tiempo de reporte de resultados si se compara con el tiempo que demora la identificacin utilizando los mtodos fenotpicos convencionales. Aunque el PRA se ha considerado un buen mtodo para identificacin rpida de especies de MNT, la correlacin con las pruebas convencionales de laboratorio no siempre ha sido del 100% (Araya 2006). Las explicaciones posibles para los resultados no concordantes pueden ser: la presencia de dos o ms especies de micobacterias en la misma muestra,bases de datos disponibles incompletas, nuevas especies subespecies de micobacterias an no reportadas en la literatura o errores tcnicos como la contaminacin de material de laboratorio, teniendo en cuenta que stas hacen parte del medio ambiente. Para el laboratorio de microbiologa es importante resolver estas discrepancias, ya que de ello depende la aplicabilidad de nuevos mtodos de diagnstico y/o identificacin, adems de la calidad y confiabilidad de los resultados. La secuenciacin de 16S ARNr es una de las herramientas moleculares ms recomendadas para la identificacin de microorganismos previamente descritos o de nuevas especies (Kolbert 2004). sta tcnica tambin ha permitido la identificacin de nuevas especies o de especies previamente descritas (Tortoli 2007). Estas metodologas han permitido la identificacin rpida de MNT,

sumado a su alta especificidad y bajo costo, las convierten en una herramienta para implementarse de rutina en el laboratorio de micobacterias.

Principales Mtodos para el Aislamiento e Identificacin de Micobacterias

Examen Directo: Baciloscopia Coloraciones

Zielh Nelsen (ZN) Kinyoun Auramina-Rodamina (AR) Luz Luz

Microscopio

Observacin: Aumento de Objetivo

100X 100X 25-40X

Fluorescencia

Medios de Cultivo

Tipo

Composicin

Lowestein Jensen (LJ) Ogawa Kudoh (OK) Middlebrook 7H9 Middlebrook 7H10 y 7H11 Bactec MGIT 960 (BD) Bactec 460

Slido

A base de Huevo

Lquido Slido Lquido Lquido

Formula definida* Formula definida* Automatizado* Automatizado Radiomtrico*

*Comerciales

Mtodos Moleculares
Sondas para Hibridizacin. PCR con enzimas de restriccin: PRA. Secuenciacin del gen 16S ARNr.

Mtodos Qumicos: Perfl de cidos Miclicos

Cromatografa en capa fina. Cromatografa Lquida de Alta Presin: (HPLC).

Mtodos Histlogicos
Biopsia tejidos.

Coloracin de ZN: Bacilos cido Alcohol Resitentes

Clasificacin de Micobacterias segn el riesgo de infeccin en humanos*

Grupo Riesgo I No patgenas

Grupo Riesgo II Potencialmente Patgenas

Grupo Riesgo III Patgenas

M. gordonae M. smegmatis M. mucogenicum M. flavescens M. terrae, M. triviale M. vaccae. M. phlei M. parafortuitum M. chitae, M. porcinum M. neoaurum M. inmunogenicum M. avium , M. abscessus M. chelonae, M. fortuitum, M. xenopi, M. malmoense M. intracellulare, M. kansasii, M. marinum, M.genavense, M.scrofulaceum M. peregrinum. M. tuberculosis, M. bovis.

M. tokaiense, M. triplex M. hiberniae, M. obuense, M. confluentis. M. nonchromogenicum M. cookii, M. interjectum M. branderi, M. gilvum M. aurum, M. sphagni, M. madagascariense, M. moriokaense, M. gadium M. haemophilum, M. paratuberculosis, M. ulcerans M. szulgai M. celatum

M. africanum, M. microti, M.leprae

* (Practical handbook for the phenotypic and genotypic identification of mycobacteria- 2004)

Tcnica PRA PCR Amplificacin de la Protena hsp 65

Fragmento de 439 pb

BstEII HaeIII
25 MW 50 MW

BstEII HaeIII
25 MW 50 MW

300

150

200 150 100

250

200 150 100

100
75 50

75 50

50

50

25

BstEII 325-130

HaeIII 200-60-55

BstEII 240-210 HaeIII 200-70-60

M. chelonae 1

M. abscessus 2

Colonias de Micobacterias No Tuberculosas

Microcolonia de M.fortuitum 10x (Meja GI-CIB)

Microcolonia de M.chelonae 10x (Meja GI-CIB)

Diagrama 2: Identificacin Bioqumica MNT de Crecimiento Rpido

Arylsulfatasa Positiva R. Nitratos Positivos NaCl Positivo Manitol Positivo

M. peregrinum

Negativa Cto. 45C Positivo M. smegmatis Negativo M. chitae

Negativos

Negativo M. chelonae Negativo Cto. 32C

M. fortutitum

Positivo M. abscessus