LUANNA RIBEIRO Luannaribeiro_lua@hotmail.

com

Efeitos somticos
Do ponto de vista biolgico Efeitos genticos (hereditrios)

Reparo correto

DNA restaurado

Clula normal Clula mutada viavl

DNA Lesado

No reparo Reparo errneo

DNA mutado

Apoptose

Clula mutada viavl

Clula Somtica

Clula Germinativa

Catarata; Malformaes; Sndromes da radiao;

Doenas hereditrias (transmissveis)

Diminuio da longevidade; Envelhecimento precoce; Induo do cncer;

Deteco dos Efeitos da Radiao

Detectores Fsicos

Detectores Biolgicos

Limitao

DANO NO REPARADO

Letalidade celular Envelhecimento precoce Malformao Cncer

Indicadores biolgicos Aberraes Cromossomicas Microncleos

Ensaio Cometa

Dosimetria Biolgica

Dosmetros biolgicos

Altamente radiossensveis Populao naturalmente sincrnica de clulas Facilmente coletadas in vitro = in vivo

Agentes ou produtos ambientais (radiao ionizante)

REPARO

DANO
DNA

DANO NO REPARADO

Letalidade celular Envelhecimento precoce Malformao Cncer

TCNICAS (EM NVEL CELULAR) Aberraes cromossmicas Microncleos Troca entre cromtides irms Cometa Hibridizao in situ Dosimetria biolgica Gentica toxicolgica Biomonitoramento Instabilidade genmica

Citogenticas

Bioqumicas Moleculares

IDENTIFICAO DE MANIFESTAES CELULARES OU MUTAES

ABERRAO TIPO CROMATDICO

QUEBRA EM G1

REJUNO

METFASE

FRAGMENTO ACNTRICO

REPLICAO

ANEL COM FRAGMENTO ACNTRICO

DICNTRICO COM FRAGMENTO ACNTRICO

TRICNTRICO COM FRAGMENTO ACNTRICO

ESTIMATIVA DE DOSE ABSORVIDA frequncia de aberraes encontadas em linfcitos de indivduos expostos Curvas dose - resposta LINFCITOS dosmetros biolgicos frequncia observada em lifcitos irradiados in vitro com doses conhecidas

- altamente radiossensveis - populao naturalmente sincrnica de clulas -ampla distribuio corprea - facilmente coletadas - in vitro = in vivo

Moorhead et al. (1960) - desenvolvimento de tcnicas de cultivo de linfcitos humanos in vitro, utilizando um mitogno. Linfcitos (G0 G1) clulas blsticas MITOSE

PHA (Phaseolus vulgaris)

Bender e Gooch (1962) - propuseram a anlise de aberraes cromossmicas para a avaliao quantitativa de dose absorvida de radiao. Colcemid bloqueia a mitose na metfase

- Coleta do sangue (5 mL) - Fracionamento de amostras sanguneas e irradiao com vrias doses (10-500 cGy) - Cultivo a 37oC sangue total + meio de + soro fetal + mitognico + antibitico (0,5 mL) cultura bovino PHA - Adio de colchicina (2h antes da fixao) - Adio de soluo hipotnica (KCl 0,075 M) - Fixao com metanol + cido actico (3:1) - Preparao de l6aminas: fixao a 65oC - Colorao com Giemsa a 2% 1a diviso em cultura: 40 54 h -BrdU -critrios 48h padronizao da tcnica obteno de curva - padro 2a diviso: 72 h

Cada laboratrio

- Sensibilidade da tcnica: estimativa de dose, da ordem de 5 cGy de radiao de baixo LET - para cada dose de radiao: pelo menos 100 metfases analisadas

CROMOSSOMOS

Trocas entre cromtides irms em cromossomos mitticos. Corados com Hoechst 33238 e acridine orange, observados ao microscpio de fluorescncia

Todos os tipos de radiao ionizante mesmo tipo de aberraes cromossmicas em clulas expostas Frequncia de aberraes induzidas depende da dose, depende do tipo de radiao LET = quantidade de E depositada na matria por unidade de comprimento do trajeto (keV/m)

alto LET baixo LET

xxxxxxxx x x x x x x x x

Ilustrao diagramtica da densidade de ionizao relativa por alvo de uma trajetria simples para radiao de alta e baixa LET

Curva dose resposta para dicntricos induzidos em linfcitos sanguneos humano, expostos in vitro ao 60 Co com taxa de dose de 5 cGy.min.-1

Aberrao cromossmica resultante de 2 quebras (anis, dicntricos)

y = + D+ D2

Origem

- fragmentos acntricos - cromossomos inteiros a 20 1 5 do ncleo principal

Tamanho- 1

Indicadores - agentes clastognicos - agentes aneugncios Schmidt (1975) clulas da medula ssea de camundongos Countryman e Heddle (1976) relao quantitativa entre a dose e a frequncia de MN em linfcitos humanos

METFASE

EFEITO GENOTXICO ANFASE CLULA NORMAL CLULA ANORMAL

CLULAS -FILHAS NORMAIS

CLULA FILHA NORMAL

CLULA MICRONUCLEADA

Ilustrao esquemtica do mecanismo de formao de microncleos em clulas binucleadas

METFASE EFEITO GENOTXICO ADIO DE CITOCALASINA B

ANFASE CLULA NORMAL CLULA ANORMAL

CLULA NORMAL

CLULA MICRONUCLEADA

Fenech & Morley (1985) cytokinesis block method Citocalasina B Helminthosporum dematoideum inibe a citocinese, mas no a carciocinese clula binucleada (1 diviso nuclear) Cultivo: adio de cito B, 44 horas aps tratamento isotnico preservao do citoplasma para cada dose 500 clulas binucleadas Desvantagem - no oferece toda a informao - 10 a 12 MN / 1000 binucleadas Vantagens - relativamente simples e sensvel - anlise mais rpida - bom indicador de dano gentico - magnitude do dano ocorrido

Microncleos

Similares a estrutura do ncleo Pequena massa nuclear Delimitada e separada do ncleo

Origem

Perdas de fragmentos acntricos; Quebra e troca cromossmica; Perda de cromossomos inteiros;

Teste do MN

Agentes Clastognicos

Agentes Aneugnicos

Biomarcador

Modelos Animais Ideais

Curto ciclo de vida Fcil manuteno em laboratrio Resposta rpida e precisa Boa reproduo
MNZINGER 1987; MOTTA, 1997; CANTINHA, 2008
33

CRESCIMENTO

FENT, 2004

34

MONITORAMENTO

Anlises qumicas

Biomonitoramento

Tcnicas Biomonitoramento

Teste do MN
BARSIENE et al., 2006, CAJARAVILLE et al., 2000

35

Dosimetria Citogentica

Biomonitoramento Ambiental

Mundo

Brasil

Acidente de Chernobyl

Acidente com Csio 137 em Goinia

Microncleo

Aberraes Cromossmicas 36

UNSCEAR, 2000; IAEA, 2001; RIBEIRO et al., 2003; RAMALHO; NASCIMENTO, 1991; CRISTALDI et al,1991

37

38

39

Ostling & Johanson (1984) tcnica eletrofortica de microgel condio neutra quebra na dupla fita

direta visualizao do dano em nvel de clula individual

Singh et al. (1988) condio alcalina

quebra na fita simples

stios lcali-lbeis

TESTE DO COMETA (SINGLE CELL GEL ASSAY)

Rpida

Detectar leses no DNA

Eficiente

Tipo de leso Quebra fita dupla (dsb) Quebra simples fita (ssb) Dano na base Dano no accar ligaes cruzadas (crosslinks) DNA DNA ligaes cruzadas DNA protenas Stos lcali lbeis

Nmero por gray 40 500 1000 1000 2000 800 1600 30 150 200 - 300

-DNA nuclear altamente organizado -Molcula de DNA de clulas de eucarioto -(50 100 cm de comprimento)

105 x

ncleo (5-10 m

Interpretao esquemtica do padro de migrao do DNA, formando estrutura semelhante ao do cometa

Comprimento da imagem ou do Cometa ( cabea + cauda) DNA que migrou

DNA do nucleide
-

Comprimento da Cauda (distncia de migrao de DNA) magnitude de dano ocorrido

-

rea do Cometa Tail moment = quantidade DNA X comprimento na cauda da cauda intensidade de

fluorescncia

Anlise direta do dano no DNA em nvel de clula individual Quantidade pequena de clulas ( da ordem de L) Relativa facilidade na obteno de dados Anlise de 50 clulas / dose Sensibilidade: 5 cGy de radiao de baixa LET Estudo de danos no DNA e reparo: danos oxidativos, dosimetria biolgica, biomonitoramento e estudos de apoptose

Radiao de 60Co

Radiao de 60Co

Radiao de 90Sr

As clulas, englobadas em gel e espalhadas sobre uma lmina, so submetidas a uma corrente eltrica que age como uma fora proporcionando a migrao dos segmentos de DNA livres, resultantes de quebras, para fora do ncleo.