UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CHIRIQU

FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS

ESCUELA DE QUMICA

INFORME DE LABORATORIO DE BIOQUIMICA

DETERMINACIN DE LA ALFA AMILASA SALIVAL. ESTUDIANTES: DANIEL BEJERANO 4-777-1401 REINA ROS 4- 751-1141 KATHERIN MIRANDA 4-753-2207.

PROFESORA: ALBERTINA MONTENEGRO

FECHA DE ENTREGA: 10/05/2012.

Determinacin de la Alfa Amilasa Salival. 3 de Mayo de 2012.

I.

Objetivos: Determinar cmo puede afectar la temperatura, el pH entre otros factores la actividad enzimtica.
Analizar el papel de la amilasa salival en el proceso de la digestin de los

carbohidratos.
Demostrar la actividad cataltica de la amilasa salival. II.

Marco Terico:

La a-amilasa es una enzima proteica que se encuentra en la saliva humana y cataliza la degradacin del almidn, que es un polisacrido de reserva vegetal. El almidn est formado por dos tipos de molculas: la amilosa y la amilopectina, ambos polisacridos de glucosa. La amilosa se conforma por cadenas lineales de glucosas unidas por enlaces a- C1-C4, mientras que la amilopectina tiene, adems de estos ltimos enlaces, uniones C1 con C6, formando cadenas ramificadas. La a-amilasa rompe uniones C1-C4, tanto en la amilasa como en la amilopectina, dejando dextrinas lineales y ramificadas (oligosacaridos) como productos.1 Para medir la actividad enzimtica de la a-amilasa, se utilizara un test colorimtrico que detecta el almidn. Para ello se contara con una solucin de yodo/ yoduro de potasio (I 2 / IK), ya que el almidn en presencia de esta solucin adquiere una coloracin azulada caracterstica. Esto tiene una explicacin fsica: el yodo se coloca en el interior de la hlice que forma la amilosa (en las regiones hidrofbicos), formando un complejo de color azul. Cuando la a-amilasa acta, degrada la amilosa, se desintegra la hlice y por tanto en presencia de I 2 / IK ya no dar una coloracin azul. Por lo tanto, en este TP mediremos la desaparicin de sustrato (evidenciada por el test colorimtrico) para determinar la actividad de la enzima. Adems, analizaremos como afectan las distintas condiciones en que acta la enzima (pH, temperatura, concentracin de NaCl), as como los efectos que pueden causar diferentes pretratamientos (proteinasa, calor). 2 Factores que afectan la actividad enzimtica:

1. Concentracin del sustrato: .- A mayor concentracin del sustrato, a una concentracin fija de la enzima se obtiene la velocidad mxima. Despus de que se alcanza esta velocidad, un aumento en la concentracin del sustrato no tiene efecto en la velocidad de la reaccin. 2. Concentracin de la enzima: .- Siempre y cuando haya sustrato disponible, un aumento en la concentracin de la enzima aumenta la velocidad enzimtica hacia cierto lmite. 3. Temperatura: .- Un incremento de 10C duplica la velocidad de reaccin, hasta ciertos lmites. El calor es un factor que desnaturaliza las protenas por lo tanto si la temperatura se eleva demasiada, la enzima pierde su actividad. 4. pH: - El pH ptimo de la actividad enzimtica es 7, excepto las enzimas del estmago cuyo pH ptimo es cido. 5. Presencia de cofactores: .- Muchas enzimas dependen de los cofactores, sean activadores o coenzimas para funcionara adecuadamente. Para las enzimas que tienen cofactores, la concentracin del cofactor debe ser igual o mayor que la concentracin de la enzima para obtener una actividad cataltica mxima.3 La -amilosa en agua presenta una ordenacin espiral caracterstica, con 6 7 residuos de glucosa por vuelta. En esta hlice los grupos hidroxilos quedan hacia fuera, mientras que en el interior se disponen los grupos hidrofbicos. En este interior es donde se incluye el yodo, formando un complejo de intenso color azul que permite la identificacin positiva de trazas de almidn. III. Materiales:

Vasos qumicos 100 mL y 250 mL.

Bao trmico Balanza Analtica Digital.

Pipeta 5 mL

 Placa de Porcelana.
6 Tubos de Ensayos.

Reactivos:

Almidn: Aspecto fsico Polvo fino Color Blanco Olor: variable. Frmula molecular (C6H10O5) x pH 5.0 a 7.0 (solucin al 2%). Densidad 1,5 Gravedad especfica 1,45 Presin de vapor No se aplica. Solubilidad en agua Soluble a 100 C. Puede provocar irritacin de los ojos. Puede provocar irritacin cutnea. Puede provocar irritacin de la nariz, la garganta y los pulmones.

Lugol: Aspecto: lquido Color: amarillento Olor: picante (dbil) Valor de pH: (30,5 g/l agua; 20 C): 6,2 - 6,6. Solubilidad en agua: miscible. Puede provocar: Tras contacto con la piel: irritaciones de aparicin local. Tras ingestin: trastornos gstricos e intestinales. Solucin Amortiguadora: Aspecto: Lquido transparente, incoloro. ESTADO FISICO: Lquido. pH: 7,0. Presin del vapor: Indeterminado. Densidad del vapor (aire = 1): Indeterminado. Punto de ebullicin: 100C. Punto de congelacin: Indeterminado

IV.

Procedimiento: A. Obtencin de la Amilasa Salival:

1. Elegimos a dos voluntarios para salivar aproximadamente 4 mL de saliva. 2. Se diluy en 18 mL de agua destilada.

B. Experimentacin: I.
1.

Efecto de la Concentracin de la Enzima:

S coloc en 4 tubos de ensayos 2 mL de almidn al 0.5%, al primero se le coloc 0.4 mL de agua, al segundo 0.3 mL de agua, al tercero 0.2 mL de agua y al cuarto 0.1 mL de agua. 2. Se le adicion al tubo 1 0,1 mL de la enzima. Accionar el cronmetro, realizar la prueba de Lugol cada minuto. 3. Repetimos con el tubo 2 y adicionamos 0.2 mL de la enzima. Al tubo 3 adicionamos 0.3 mL de la enzima. Al tubo 4 adicionamos 0.4 mL. 4. Calculamos V= 1/t, [E] mL Enzima. Graficamos V vs [E] II. Efecto de la Concentracin del Sustrato:
1. Se coloc en 4 tubos de ensayo distintos volmenes de almidn 0.5 mL, 1.0 mL, 1.5

mL, 2.0 mL; despus se coloc 1.5 mL de agua, 1.0 mL de agua, 0.5 mL de agua; y se homogeniz.
2. Se adicion 0.5 mL de la enzima. Accionamos el cronmetro, y se realizamos la

prueba de Lugol cada minuto.

3. Calculamos V= 1/t. [S], graficar e interpretar.

III .Efecto de la Temperatura:

1. Se coloc en 4 tubos de ensayos 1 mL de la enzima + 5 mL de almidn y se

procedi a colocar en distintas temperaturas bao hielo, 31C, 55C y 80C. Accionamos el cronmetro y realizamos la prueba de Lugol cada minuto.
2. Graficamos t (C) vs V.

IV .Efecto de pH:
1. Se coloc en 3 tubos de ensayos 2 mL de amortiguador de pH 4.4, 6.1 y 9,9 + 2 mL

de almidn.

2. Se adicion entonces 2 mL de la enzima a cada tubo de ensayo, accionamos el

cronmetro y realizamos entonces la prueba de Lugol cada minuto. 3. Graficamos V vs PH. V. Resultados:

Tabla 1: Efecto de Concentracin de Enzima: Tubo 1 2 3 4 0.1 0.2 0.3 0.4 [E] T (min) +3o 25 21 15 V 0.033 0.04 0.048 0.067

Grfica 1: [Concentracin de la E] vs Velocidad de Reaccin

Discusin: Para empezar, se ha de aclarar que las diluciones ptimas para salivas de diferentes personas son distintas porque las caractersticas y concentraciones de los compuestos varan de una persona a otra.

Existe una relacin lineal entre la velocidad de la reaccin y la concentracin de la enzima. En el grfico se observa que al aumentar la concentracin de la enzima, aumenta tambin la velocidad de la reaccin proporcionalmente. Expresado tericamente quiere decir que las velocidades de reaccin dependen generalmente de las concentraciones de las sustancias reaccionantes. Para la mayora de las reacciones, las velocidades son ms elevadas cuando las concentraciones de los reactivos son elevadas. Altas concentraciones significan que un nmero relativamente grande de molculas estn juntas en un volumen dado, bajo estas condiciones, las colisiones entre molculas reaccionantes que las convierten en molculas de producto, son relativamente frecuentes y por consiguiente la reaccin es ms rpida.

Tabla 2: Efecto de Concentracin del Sustrato: Tubo 1 2 3 4 mL (Sustrato) 0.5 1.0 1.5 2.0 T (min) 0.5 4.0 6.3 13 [S] 0.1 0.2 0.3 0.4 V 2 0.25 0.159 0.077

Grfica 2: [Concentracin del Sustrato] vs Velocidad de Reaccin:

Discusin: La saturacin con el sustrato. En general, podemos decir que al aumentar la concentracin de sustrato en el medio, la velocidad de reaccin de un enzima aumenta; por tanto, la influencia de la concentracin de sustrato tiene un efecto positivo en la catlisis enzimtica.

Esto es debido, simplemente, a que al aumentar el nmero de sustratos en el medio, ser mayor la cantidad de producto producido por la reaccin enzimtica. Sin embargo, llega un momento en que la velocidad de la reaccin enzimtica no aumenta aunque aumentemos la concentracin de sustrato, lo cual es debido a que en ese momento todos los enzimas presentes estn actuando a pleno rendimiento y ya no pueden aumentar la produccin de producto. En ese momento se dice que el enzima est saturado por el sustrato.

Tabla 3: Efecto de la Temperatura: Tubo 1 2 3 4 T (C) 9 C 31 C 55 C 80 C t (min) +30 +30 +30 +30 V 0.033 0.033 0.033 0.033

Grfica 3: Temperatura (C) vs Velocidad de Reaccin

Discusin: Las amilasas son enzimas dependientes de cloruro, completamente afuncionales en ausencia de iones de cloruro. Actan a lo largo de cualquier punto de la cadena de los carbohidratos, descomponindolos en dextrina desde la amilopectinan. La estructura terciaria de una protena es muy sensible a los cambios de la temperatura ya que, como sabemos, se mantiene

gracias a fuerzas no covalentes altamente sensibles al calor. Esto hace que la actividad enzimtica muestre una dependencia de la temperatura. A 9C, 55C, 31C y a 80 C, no se presentaron cambios de color en la muestra es decir que el color azul nunca desapareci. Por lo tanto, se podra decir que la alfa amilasa no actu. Mas sin embargo, a temperatura ambiente 31C debi presentar cambios, esto era de esperarse, ya que esta enzima tiene un rango de temperatura ptima y, en el caso de la alfa amilasa, al encontrarse sta en el cuerpo humano (que siempre tiene una temperatura de 37 C)2 , se supone que a temperatura ambiente no va a perder su actividad, pero s disminuirla, ya que los choques intermoleculares van a ser menores. Sin embargo, al disminuir demasiado la temperatura, los choques entre las molculas disminuyen tambin, por lo que la actividad enzimtica baja hasta el punto en el que no se puede ver. Por el contrario, al aumentar la temperatura de incubacin a 80 C, los choques entre las molculas se van a acrecentar de tal forma que la enzima se va a desnaturalizar. Es por ello que se presume que no se observ cambios en las muestras. Tabla 4: Efecto de pH: Tubo 1 2 3 pH 4.4 6.1 9.9 t (min) 5.0 2.0 7.0 V 0.2 0.5 0.14

Grfica 4: pH vs Velocidad de Reaccin:

Discusin:

Todas las enzimas tienen un pH ptimo, en donde tienen mayor actividad, ya medida que se alejan de ese pH (para ambos la dos) disminuye en su actividad. Esto se debe a que algunos restos aminocidicos de las enzimas (en el caso de que sean protenas) tienen cargas y pueden ser los responsables tanto de mantener la estructura tridimensional de la protena como de interaccionar con el sustrato. El pH del medio (es decir, la presencia de ion es H+ y OH-) puede modificar las cargas de estos aminocidos y de este modo incluso desnaturalizar a la enzima. Debemos aclarar que aunque la enzima tenga actividad al pH salival de cada persona (siempre entre 6 y 8, segn la tabla)4, esto no quiere decir que ste sea su pH ptimo. Para determinarlo experimentalmente, medimos la actividad enzimtica a diferentes pH (4.4, 6.1 y 9.9) y as realizamos la curva, para determinar el pH ptimo de la - amilasa a partir de los resulta dos de este. Las soluciones de protenas tienen baja tensin superficial, lo cual determina que cuando estas soluciones se agitan violentamente, se forma espuma. La formacin de espuma es un factor que favorece la desnaturalizacin. VI. Conclusiones:

La funcin ms importante de la saliva es humedecer y lubricar el bolo alimenticio, desde el punto de vista digestivo es importante por contener a la amilasa salival o ptialina, enzima que hidroliza diversos tipos de polisacridos.

Con respecto a la influencia del pH del medio en la actividad enzimtica de la amilasa, podemos decir que a pH extremos (es decir, muy cidos o muy bsicos) la enzima no funciona, o al menos disminuye notablemente su actividad.

A partir de los resultados obtenidos se podra deducir que la - amilasa se desnaturaliza al ser expuesta a una temperatura tan elevada, ya que se produce un exceso de choques entre las mol culas presentes en la saliva como consecuencia del aumento de la energa cintica, produciendo la ruptura de las uniones dbiles (como puentes de hidrogeno, fuerza s de van der Waals , interacciones inicas ) , que afecta la estructura terciaria de la enzima y a su vez la conformacin de su sitio activo , perdiendo la capacidad de romper las uniones C1 - C4 de las glucosas. Y es por esto que e l color azul no desaparece.

 La enzima que utilizamos fue la amilasa salival y un sustrato de almidn, como todas las enzimas estn en condiciones ptimas en donde su actividad enzimtica es mxima, por lo cual utilizamos procesos en los cuales variamos estas condiciones para determinar el punto ptimo en cada condicin en la cual esta actividad enzimtica era mayor.

Cualquier cambio brusco de pH, sabiendo que las enzimas son protenas, puede alterar el carcter inico de los grupos amino y carboxilo en la superficie proteica, afectando as las propiedades catalticas de una enzima. A pH alto o bajo se puede producir la desnaturalizacin de la enzima y en consecuencia su inactivacin. La enzima (E), se combina con el substrato (S) formando en complejo de transicin, enzima-substrato (E-S), mediante una reaccin reversible, cuya energa de activacin es menor que la de la reaccin no catalizada. Cuando se forma el producto de la reaccin (P), se regenera de nuevo la enzima (E) de forma libre, la que puede combinarse de nuevo con otra molcula de substrato (S).

VII.

Bibliografas: Editorial Omega. Pgina 126-131.

1. Cox M. M. y Nelson, D.L. (2006).Lehninger. Principios de Bioqumica. Barcelona.

2. Price, N. and Stevens, L., (1999). Fundamentos de Enzimas: Biologa Celular y

Molecular Cataltica de las Protenas Oxford University Press. Pgina 1132-1140.

3. Rodwel. (2004). Bioqumica de Harper, 13 ed., s.d. Pgina 215-223 4. Mathews, C.K., Van Holde K.E. and Ahern K.G. (2000). Bioqumica. Third edition.

Addison Wesley Longman Inc. USA.

Cuestionario:

1. Describa las caractersticas estructurales del almidn que permite su identificacin con lugol.

Dado que el almidn est integrado por dos fracciones, la amilosa y la amilopectina, debe tenerse en cuenta las reacciones que ambas producen (as como sus respectivos productos de hidrlisis) con el reactivo de Lugol: AMILOSA AMILOPECTINA + Amilasa -------------- AMILODEXTRINAS +IODO = resultado Color azul violeta MALTOSA + GLUCOSA -----------------------+IODO No dan coloracin Almidn. Es un polisacrido formado por molculas de -D-glucosa unidas por enlaces glucosdicos (14) y (16). En la molcula de almidn se distinguen dos tipos de polmero:

Amilosa.- Es un polmero no ramificado formado por largas cadenas de unidades de

-D-glucosa unidas por enlaces -(14). Estas cadenas adoptan una disposicin helicoidal con 6 molculas por vuelta, y tienen masas moleculares relativas que oscilan entre unos pocos miles y 500.000 daltons.

Amilopectina.- Es un polmero muy ramificado (Figura 7.14) formado por molculas

de -D-glucosa. Los sucesivos restos de glucosa a lo largo de las cadenas estn unidos por enlaces (14), y los puntos de ramificacin, que se encuentran espaciados por un nmero de restos de glucosa que oscila entre 24 y 30, consisten en enlaces (16) (Fig. 7.14). Su masa molecular relativa puede alcanzar hasta un milln de Dalton. El almidn acta como sustancia de reserva en las clulas vegetales. Una parte sustancial de los glcidos producidos en la fotosntesis se almacenan en forma de almidn, dando lugar a unos agregados insolubles de gran tamao, los granos de almidn, que se encuentran en todas las clulas vegetales, siendo especialmente abundantes en las de las semillas, frutos y tubrculos.

Las glndulas salivales secretan - amilasa, la cual inicia la hidrlisis del almidn .Esta enzima es una endoglucosidasa que hidroliza enlaces (1-4) glucosdicos internos, pero no ataca los enlaces (1-6). Da como productos finales maltosa, algo de glucosa y dextrinas lmites. El lugol es una disolucin de yodo que tiene una reaccin especfica con el almidn. El reactivo de lugol se intercala por la molcula de almidn y esto se detecta por la coloracin violeta que toma la mezcla. Este polisacrido est formado por molculas de glucosa y es exclusivo de las clulas vegetales. En la digestin qumica aparece la accin de las glndulas salivales. Estas secretan saliva (agua, electrolitos (Na, K), enzimas (amilasa salival y lipasa salival)). La amilasa salival degrada el almidn, (h. De carbono complejo) hasta maltosa (h. De carbono con 2 glucosas). Pero no todo el almidn se degrada en la boca. La obtencin de una sustancia colorida al reaccionar el yodo con el almidn se cree se debe a la formacin de un complejo de coordinacin entre las miscelas de almidn y de iodo. Estas miscelas estn formadas por cadenas polisacridas enrolladas en hlice. El iodo puede colocarse centralmente en estas hlices. El color depende del largo de la seccin lineal de la molcula de almidn. Por eso la amilosa pura, que es el polisacrido exclusivamente lineal dar con el iodo el color ms intenso de un azul profundo. La amilopectina dar un color azul violeta mientras que el glucgeno que es la molcula ms ramificada dar un color caf rojizo. La celulosa no da reaccin de color con el iodo. Las dextrinas formadas por la hidrlisis del almidn dan un color que vara de caf rojizo a la ausencia de color, dependiendo del tamao de la molcula. El color disminuye cuando la temperatura aumenta, hasta desaparecer por completo, y se intensifica al bajar nuevamente la temperatura. Esto indica la formacin y deformacin de los complejos de coordinacin formados entre el iodo y el almidn. La reaccin del iodo con el almidn nos sirve para determinar el grado de hidrlisis del almidn.

2. Seale las dificultades en la realizacin del experimento. Las dificultades que se tuvieron al momento de realizar este experimento fue en parte porque se utilizo una concentracin de almidn muy alta que se encontraba al 1%, lo que hiso que se demorara mas el momento final de la reaccin, lo que quiere decir que para una prxima experiencia es recomendable utilizar una concentracin ms baja; tambin pudo haber afectado el hecho de que los voluntarios que procedieron a salivar no se encontraban en completo ayuno y esto pudo provocar que la amilasa salival no se encontrara muy pura.

3. Qu otra prueba podra emplearse para la realizacin de este experimento? Explique. Otra prueba que se puede emplear para la realizacin de este experimento de alfaamilasa es mediante la tcnica de espectrofotometra, tomando la absorvancia de cada prueba y realizar los grficos al igual como se hizo en este experimento haciendo una relacin respecto a la velocidad de reaccin (pH, sustrato y temperatura) y concentracin (enzima).