UNIVERSIDAD DE VIGO

DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA, GENTICA E INMUNOLOGA REA DE BIOQUMICA Y BIOLOGA MOLECULAR

MTODOS EN BIOQUMICA Y BIOLOGA MOLECULAR

GUIN DE PRCTICAS

CURSO 2005-2006

MTODOS ESPECTROFOTOMTRICOS. FUNDAMENTO

La espectrofotometra, se basa en la determinacin de un parmetro, la absorbancia, directamente relacionado con la concentracin de una determinada sustancia disuelta en un lquido, que retiene una parte de la luz incidente sobre la disolucin. Esta determinacin se realiza con los colormetros y espectrofotmetros. Los colormetros no pueden trabajar con luz ultravioleta o infrarroja lejana y habitualmente no pueden seleccionar de modo continuo la longitud de onda de la luz utilizada en cada caso, ya que suelen funcionar a base de filtros. Los espectrofotmetros, sin embargo, utilizan prismas o redes de difraccin para obtener cualquier longitud de onda dentro de los lmites de trabajo del aparato. El espectrofotmetro es un instrument o capaz de producir una luz monocromtica, es decir, de una sola longitud de onda y de medir la cantidad de esta luz que absorbe una muestra dada. Aunque pueden variar en diseo todos los espectrofotmetros constan de: Una fuente de luz: para trabajar en el ultravioleta se emplea una lmpara de hidrgeno o bien de deuterio a alta presin, teniendo esta ltima fuente de luz una intensidad tres veces mayor. Para trabajar por encima de los 375 nm (luz visible) la mayora de los instrumentos utilizan bajo voltaje y lmpara de wolframio o tungsteno de alta intensidad. Un monocromador: para seleccionar la longitud de onda. Una cmara de muestra: es el lugar donde se coloca un recipiente transparente denominado cubeta, que contiene la muestra. Para medidas en la regin visible las cubetas de vidrio ptico son suficientes. Sin embargo, por debajo de los 350 nm el vidrio normal absorbe luz y por ello deben usarse cubetas de cuarzo. Un detector de luz Un medidor o registrador: para medir las seales que recibe del detector, que puede ser analgico o digital. Lo descrito se refiere a espectrofotmetros de un slo haz, que se utilizan para realizar medidas separadas unas de otras. Sin embargo, para hacer mediciones contnuas de absorbancia (por ejemplo, para obtener un espectro de absorcin), se han desarrollado los espectrofotmetros de doble haz. La diferencia fundamental es que estos poseen un divisor del rayo justo antes de la muestra. La divisin del rayo puede hacerse con un prisma o bien mediante un disco rotatorio, el cual dirige el haz la mitad del tiempo a travs de la muestra y la otra mitad del tiempo a travs de un patrn de referencia. Electrnicamente las seales que emiten las dos muestras se recombinan y la seal de referencia se sustrae de la seal de muestra, permitindose as la medida del espectro continuo para un compuesto. La representacin de los valores de absorbancia (A) de una sustancia a distintas longitudes de onda () da lugar a una curva que se denomina espectro de absorcin o anlisis espectral y que es caracterstico para cada sustancia. Estas curvas se utilizan para determinar las a las cuales la sustancia tiene absorbancia mxima ( ximos de absorcin) y las de absorcin mnima ( nimos de absorcin). As m m podremos establecer la ptima para trabajar con ese compuesto. Usualmente para lograr la mxima sensibilidad se usa la max, aunque tambin es preciso considerar otros factores como la pendiente del mximo, impurezas, tipo de disolvente, presencia de otros compuestos que absorban a esa , etc.

TCNICA.
a) Elaboracin del espectro de absorcin de un cromforo. 1. Para conseguir un espectro de absorcin de una determinada sustancia primero debemos tener una idea de en que zona debe encontrarse su mximo de absorcin. Para ello, podemos hacer en el espectrofotometro una lectura rpida a distintas . En el caso de las sustancias que absorben en el rango del visible (color visible a simple vista) podemos buscar en la zona correspondiente a su color complementario (ver tabla). As una disolucin de color azul hace sospechar que su mxima absorcin est en la zona del anaranjado. Esto se debe a que el color visible de una solucin corresponde a las longitudes de onda que transmite, no a las que absorbe. Ejemplo: una solucin roja absorbe luz verde y transmite luz roja, por ello se examina en la zona que absorbe (verde, entre 495 y 540 nm). Colores complementarios (nm)
Color Complementario

380

425
violeta amarillo

495
azul naranja verde rojo

540

640
amarillo violeta

670
naranja azul rojo verde

750

2. Posteriormente realizamos una dilucin de la muestra con disolvente hasta que la absorbancia en la zona indicada est alrededor de 0,6-0,8 unidades.

3. Una vez conseguida la dilucin adecuada se prepara un tubo con ella y otro con disolvente puro que actuar como blanco. Con el blanco ajustamos la absorbancia a cero de la longitud de onda mas baja a medir (200 nm). Luego se hace un barrido, lectura de la absorbancia de la disolucin a las distintas longitudes de onda (200-700 nm). Si disponemos de un registrador acoplado al espectrofotmetro ste, automticamente, nos puede suministrar el grfico de absorbancia frente a , y en l podremos observar los mximos de absorcin. b) Comprobacin de la Ley de Lambert-Beer; estudio de su rango de cumplimiento. Segn la Ley de Lambert-Beer, dentro de un determinado rango la absorbancia de una disolucin de una sustancia es proporcional a la concentracin de dicha sustancia en la muestra: siendo:

, el coeficiente de absorcin molar o absortividad molar

c, la concentracin de la sustancia en moles/litro l, el recorrido del haz de luz a travs de la sustancia en cm

A= .c.l

Esto es cierto para concentraciones bajas en las que existe una completa linealidad entre la absorbancia y la concentracin, obtenindose una lnea recta. Pero, si la concentracin es muy alta, pasa a ser funcin de c y la ley deja de cumplirse. Esto puede ocurrir a causa de fenmenos de dispersin o de cambios estructurales a elevadas concentraciones. 1. Preparar, segn se indica ms adelante1, una disolucin de un compuesto que absorba luz de una determinada longitud de onda (azul de bromofenol). 2. A partir de ella realizar una serie de diluciones para obtener 14 disoluciones de concentraciones conocidas. 3. Ajustar el espectrofotmetro a la longitud de onda de mxima absorcin del compuesto (determinada en la primera parte de la prctica). 4. Determinar las absorbancias de las disoluciones preparadas previo ajuste a cero con agua destilada.

CUESTIONES
1. Presentar los resultados en un grfico de absorbancia frente a concentracin. 2. Comentar los resultados. c) Clculo del coeficiente de extincin molar ( m) de un cromforo. El coeficiente de extincin molar o absortividad molar ( m) de una sustancia a una determinada , es caracterstico para esa sustancia en determinadas condiciones y nos permite relacionar la absorbancia de una muestra con su concentracin. Equivale a la absorbancia de una disolucin 1 M de una sustancia con un recorrido luminoso de 1 cm.

A = m . c (M) . l (cm)

-1 vendr expresado en M cm-1. Por lo tanto, m es la pendiente de la recta que se obtiene al representar absorbancia frente a concentracin de la sustancia, si la concentracin se expresa en M.

CUESTIONES
3. Calcular el coeficiente de extincin molar del cromforo utilizado. 4. Calcular la concentracin de un cromforo en una disolucin.

1Azul de bromofenol Preparar 2 ml de una disolucin 100 M en tampn fosfato 0,05 M pH 7,0. A partir de ella preparar, con tampn fosfato, dos diluciones de concentraciones: 30 M y 20 M. A partir de la disolucin 30 M preparar las siguientes: 15 M, 7,5 M, 3,75 M, 1,87 M, 0,93 M y 0,465 M. A partir de la disolucin 20 M preparar las siguientes: 10 M, 5 M, 2,5 M, 1,25 M, 0,625 M y 0,312 M.

EFECTO DEL pH SOBRE LA SOLUBILIDAD DE LAS PROTENAS. FUNDAMENTO

La solubilidad de las protenas globulares en los sistemas acuosos vara mucho segun las propiedades del medio donde se hallen disueltas; estas diferencias pueden utilizarse para lograr la separacin de distintas protenas presentes en una mezcla. Las variables ms importantes que influyen en dicha solubilidad son: el pH la fuerza inica las propiedades dielctricas del disolvente la temperatura Casi todas las protenas globulares son menos solubles a su pH isoelctrico (PI), porque a dicho pH la molcula no posee carga neta y no existen por tanto repulsiones electrostticas entre las molculas de protena vecinas. A valores de pH superiores o inferiores al PI todas las molculas tendrn carga neta del mismo signo. Por dicha razn se repelern entre s y no podr haber coalescencia de las molculas individuales para formar agregados insolubles. La precipitacin isoelctrica consiste en ajustar el pH de una mezcla de protenas al PI de una de ellas; de este modo dicha protena precipitar y quedarn en disolucin aquellas protenas que poseen valores de PI superiores o inferiores a aquel pH. Adems esta tcnica permite determinar el PI de una protena. En esta prctica vamos a determinar el PI de la casena, mediante precipitacin isoelctrica.

TCNICA
1. Preparar 10 tubos con 2 ml de tampn fosfatos 0,1 M con valores de pH desde 3,0 a 7,5. 2. Aadir a cada tubo 0,2 ml de una disolucin de casena. Tubo blanco: 0,2 ml de disolucin de casena + 2 ml de tampn de pH 8,0. (Transmitancia = 100). 3. Agitar y determinar la turbidez midiendo la transmitancia a 420 nm.

CUESTIONES:
6. Representar grficamente los valores de transmitancia frente a los valores de pH. 7. Interpretar los resultados y determinar el punto isoelctrico de la casena.

SEPARACIN DE FORMAS INTERCAMBIO INICO. FUNDAMENTO

ENZIMTICAS

POR

CROMATOGRAFA

DE

En cromatografa de intercambio inico la separacin de protenas se hace en virtud de su carga neta. Las protenas son anfolitos, es decir, tienen cargas positivas y negativas y su carga neta depende del pH del medio. pI La carga neta de una protena ser cero cuando el pH del medio sea igual a su pH isoelctrico (PI). Por lo tanto, el PI de una protena puede definirse como el pH al cual la 4 protena tiene compensadas sus cargas positivas y carga negativas. Cuando el pH del medio sea mayor que el PI, la neta 6 protena tendr carga neta negativa. Por el contrario, si el pH pH del medio es menor que el PI la protena tendr carga neta positiva. Las enzimas son protenas y muchas veces presentan dos o ms formas enzimticas. En el caso de la -D+ galactosidasa de mamferos, la existencia de formas mltiples es un hecho ampliamente descrito. Estas formas mltiples catalizan la misma reaccin pero difieren en propiedades tales como masa molecular, pH ptimo, pH isoelctrico (PI), e incluso en sus propiedades cinticas. En esta prctica vamos a separar dos formas de -galactosidasa (Forma I y Forma II) de rin de ternera que difieren en su pH isoelctrico, utilizando para ello una columna de cromatografa de intercambio inico. Utilizaremos DEAE (dietilaminoetil) celulosa que es un intercambiador aninico, es decir, est cargada positivamente e intercambia iones de carga negativa (aniones).

TCNICA
a) Obtencin de la muestra. (Este apartado no lo realizar el alumno). El material de partida es rin de rata. Para realizar la cromatografa de intercambio inico se utilizar como muestra un sobrenadante que contenga las enzimas en su forma soluble, libres de restos celulares, de membranas y de protenas no solubles. Para ello se han llevado previamente a cabo los siguientes pasos:
H CH 3 -CH 2 N+ CH 3 -CH 2 CH 2 CH 2

estructura del dietilaminoetil (DEAE)-celulosa

Homogeneizacin del tejido (10 ml de tampn de homogeneizacin por g de tejido). Mediante este mtodo se rompen clulas y orgnulos celulares. Centrifugacin del homogeneizado a 8.000 rpm, durante 15 minutos. Este procedimiento permite obtener un sobrenadante en donde se encontrarn las protenas solubles. b) Montaje de la columna 1. Sujetar una jeringuilla (sin mbolo) a un pie de columna. 2. Colocar un trocito de algodn en la parte inferior de la jeringa. 3. Cerrar la llave de elucin de la columna y aadir agua destilada para empapar el algodn. Abrir la llave de modo que el agua salga gota a gota y, con una varilla de vidrio o pipeta, colocar bien el algodn en el fondo, procurando que no queden burbujas. Cerrar la llave. NO SECAR COMPLETAMENTE LA COLUMNA. 4. Remover bien la DEAE celulosa para que no haya grumos y, con la llave cerrada, depositarla en la columna con una pipeta Pasteur. 5. Abrir la llave para que el tampn eluya muy despacio y, a medida que baje el nivel, aadir ms DEAE. 6. Una vez que el volumen de DEAE celulosa compactado en la columna alcance los 4 ml se mantiene la llave abierta y se hace pasar tampn de equilibrado ( Aprox 15 ml de tampn fosfatos 10 mM, pH 6,0).

7. Se recoge el eluyente en tubos (aproximadamente 3 ml) y se mide el pH. Cuando el pH del eluyente se iguale al del tampn de equilibrado, se cierra la llave de elucin de la columna hasta el momento de su utilizacin. IMPORTANTE! se advierte que la precisin y el cuidado en el montaje de la columna repercuten directamente en el resultado de la prctica. c) Separacin de formas moleculares de -D-galactosidasa

KCl
+ Cl+ +

1. Introducir la muestra en la columna con pipeta pasteur, con mucho ciudado para no distorsionar el frente de la columna. (muestra: 2 ml de sobrenadante). 2. Hacer pasar tampn fosfatos de pH 6,0 por la columna, recogiendo fracciones de 2 ml. Recoger 10 fracciones. De este modo, todas aquellas protenas cuyo PI sea mayor de 6,0 estarn cargadas positivamente y saldrn con el tampn. Quedarn retenidas aquellas protenas que tengan un PI menor que 6,0, puesto que estarn cargadas negativamente y se podrn unir a las cargas positivas de la columna.

+ +

+ +

+ + + + + + +

+ + + + - + + +

+ Cl+ + + Cl+ Cl- + + +

3. Hacer pasar una disolucin salina concentrada (tampn fosfato pH 6.0 + KCl 0,25 M) recogiendo fracciones de 2 ml. Recoger 10 fracciones. As se eluyen las protenas unidas especficamente al DEAE puesto que las cargas negativas del KCl compiten con las de las protenas, desplazndolas.

DETECCIN DE DOS FORMAS MOLECULARES DE LA ENZIMA BETA-DGALACTOSIDASA. FUNDAMENTO

En la cromatografa de intercambio inico separamos dos formas moleculares de la enzima -Dgalactosidasa de rin de ternera, que denominaremos Forma I y Forma II segn el orden de elucin. Si queremos saber en qu fraccin eluye cada una de estas formas, debemos determinar la actividad enzimtica en cada fraccin obtenida. Por lo tanto, la valoracin ha de hacerse en todos los tubos obtenidos al eluir la columna con tampn y en todos los tubos obtenidos al eluir la columna con KCl. La valoracin de la actividad de la -D-galactosidasa se realizar usando un sustrato sinttico el pnitrofenil--D-galactopiransido cuya hidrlisis, por accin de la enzima, produce cantidades equimolares de -D-galactosa y p-nitrofenol. El p-nitrofenol es un compuesto incoloro a pH cido y amarillo a pH neutro y bsico.

CH2 OH HO OH OH O O NO 2 HO

CH2 OH O OH

+
OH

HO

NO 2

p-nitrofenil- -D-galactopiransido
TCNICA

D-galactosa

p-nitrofenol

FRACCIONES ELUDAS CON TAMPN 1. Preparar tantos tubos como se hayan recogido en la cromatografa. Los volmenes de la tabla se expresan en ml: tubo blanco problemas agua 0,1 tampn pH 4,0 0,15 0,15 sustrato 0,25 0,25 fracciones tampn 0,1

2. Agitar los tubos. 3. Incubar a 37C, 20 minutos. 4. Aadir 0,5 ml de Na2 CO 3 a cada tubo y agitar. 5. Leer la absorbancia, a 400 nm, en espectrofotmetro. FRACCIONES ELUDAS CON KCl 0,25 M 1. Preparar tantos tubos como se hayan recogido en la cromatografa. Los volmenes de la tabla se expresan en ml: tubo blanco problemas 2. 3. 4. 5. agua 0,1 tampn pH 4,0 0,15 0,15 sustrato 0,25 0,25
fracc. KCl 0,25 M

0,1

Agitar los tubos. Incubar a 37C, 20 minutos. Aadir 0,5 ml de Na2 CO 3 a cada tubo y agitar. Leer la absorbancia, a 400 nm, en espectrofotmetro.

IMPORTANTE!: una vez realizada la lectura de los tubos por espectrofotometra: guardar la/s fraccion/es eludas con tampn que tengan mayor absorbancia (forma I) y guardar la/s fraccion/es eludas con KCl 0,25 M que tengan mayor absorbancia (forma II).

CUESTIONES
8. Representar grficamente los valores de absorbancia de cada fraccin frente al nmero de la fraccin. 9. Interpretar los resultados de la cromatografa.

DETERMINACIN DEL GRADO PURIFICACIN DE LAS FORMAS MOLECULARES DE BETA-D-GALACTOSIDASA DESPUS DE LA CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO.
Para determinar el grado de purificacin que hemos obtenido despus de la cromatografa de intercambio inico elaboramos una tabla de purificacin. Para ello debemos conocer el volumen, la concentracin de protenas y el valor de la actividad enzimtica. El volumen es un dato ya conocido; falta por determinar la concentracin de protenas y la actividad enzimtica. a) Determinacin de la concentracin de protenas.

FUNDAMENTO
En esta prctica se determinar la concentracin de protenas en la muestra inicial utilizada en la cromatografa (sobrenadante) y en las fracciones que contienen las formas I y II de la -D-galactosidasa. El mtodo utilizado ser el denominado Mtodo de Lowry, basado en la capacidad que tienen las protenas para formar complejos de coordinacin con el cobre por medio de los enlaces peptdicos y de las cadenas laterales de aminocidos como la tirosina. El reactivo de Folin-Ciocalteau sirve como revelador de la formacin de estos complejos, originando una coloracin azul. La intensidad de este color, que puede ser cuantificado por espectrofotometra, es proporcional a la concentracin de protenas.

TCNICA
1. Preparar las siguientes diluciones de cada fraccin que se facilita: fraccin sobrenadante forma I forma II dilucin 1/100 1/5 1/5

2. Estas fracciones diluidas servirn como muestras para preparar los siguientes tubos : tubo Blanco (B) Patrn 1 Patrn 2 Patrn 3 Patrn 4 Sn FI FII 3. 4. 5. 6. H20 0,2 0,15 0,1 0,05 SAB 0,25 mg/ml

muestra 0,2 0,2 0,2

Folin A-C 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

0,05 0,1 0,15 0,2 -

Agitar y esperar 10 minutos. Aadir a cada tubo 0,1 ml de reactivo de Folin-Ciocalteau. Agitar y esperar 10 minutos en oscuridad. Leer los tubos en el espectrofotmetro a 620 nm.

CUESTIONES
10. Elaborar una recta patrn utilizando la concentracin de los patrones y su absorbancia a 620 nm (disolucin inicial de SAB 0,25 mg/ml) 11. Calcular la concentracin de protenas de cada tubo. 12. Calcular la concentracin de protenas real en los problemas.

b) Valoracin de la actividad enzimtica de la -galactosidasa.

FUNDAMENTO
Para completar la tabla de purificacin necesitamos conocer tambin la actividad enzimtica de la D-galactosidasa en todos los pasos del proceso: en la muestra inicial utilizada en la cromatografa (Sobrenadante) y en las fracciones que contienen las Formas I y II de la -D-galactosidasa. Utilizaremos el sustrato sinttico p-nitro-fenil--D-galactopiransido. Las fracciones se diluirn del siguiente modo: Fraccin Sobrenadante (Sn) Fracciones eludas con el tampn (Forma I)
Fracciones eludas con KCl 0,25 M (Forma II)

Dilucin 1/5 sin diluir sin diluir

Estas fracciones diludas servirn como muestras para llevar a cabo la reaccin enzimtica.

TCNICA
FORMA I 1. Preparar los siguientes tubos (volmenes en ml): agua blanco sobrenadante FI 0,1 tampn pH 4,0 0,15 0,15 0,15 sustrato 0,25 0,25 0,25 muestra 0,1 0,1

2. Agitar los tubos. Incubar a 37C durante 30 minutos. 3. Aadir 0,5 ml de carbonato sdico, agitar. 4. Leer absorbancia a 400 nm. FORMA II 1. Preparar los siguientes tubos (volmenes en ml): agua blanco sobrenadante F II 0,1 tampn pH 4.0 0,15 0,15 0,15 sustrato 0,25 0,25 0,25 muestra 0,1 0,1

2. Agitar los tubos. Incubar a 37C durante 20 minutos. 3. Aadir 0.5 ml de carbonato sdico, agitar. 4. Leer absorbancia a 400 nm.

CLCULOS
La actividad enzimtica de una enzima se expresa en unidades de enzima por mililitro. Unidad de enzima (U), se define como la cantidad de enzima que libera 1 mol de producto por minuto en condiciones ptimas de pH y temperatura. Por lo tanto, la actividad enzimtica de la -galactosidasa seran los mol de p-nitrofenol liberados por minuto y por mililitro. Para poder relacionar los valores de absorbancia a 400 nm medidos en el espectrofotmetro, con la cantidad de p-nitrofenol liberado por la accin de la enzima, se utiliza una recta patrn de esta sustancia, lo

que permite obtener un factor constante (0,15) que multiplicado por la absorbancia obtenida en la reaccin enzimtica, nos permita determinar los moles de p-nitrofenol liberados. Con los valores obtenidos podremos calcular una serie de parmetros enzimticos que sern necesarios para la cumplimentacin de la tabla de purificacin. Actividad enzimtica (U ml-1 ) = Abs 400 x 0,15/tiempo (min) x volumen enzima (ml) Actividad total (AT, U) = actividad enzimtica x volumen total (ml) Actividad especfica (AE, U mg-1 ) = actividad enzimtica (U ml-1)/concentracin de protenas (mg ml-1) Rendimiento (%) = [AT de la etapa considerada (U)/AT inicial (U)] x 100 Grado de purificacin = AE de la etapa considerada (U mg-1 )/AE inicial (U mg-1 ) TABLA DE PURIFICACIN DE LA FORMA I Fraccin Volumen (ml) Sn FI TABLA DE PURIFICACIN DE LA FORMA II Fraccin Volumen (ml) Sn F II ConcProt (mg/ml) Prot.Tot (mg) Act. enz (U/ml) Act.Total (U) A.Especif (U/mg) 1 G. Purif Rend (%) 100 ConcProt (mg/ml) Prot.Tot (mg) Act. enz (U/ml) Act.Total (U) A.Especif (U/mg) 1 G. Purif Rend (%) 100

CUESTIONES
13. Completar las tablas de purificacin. 14. Comentar los resultados de la purificacin.

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CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN MOLECULAR O FILTRACIN EN GEL: DETERMINACIN DE LA MASA MOLECULAR DEL CITOCROMO C. FUNDAMENTO
Uno de los mtodos de separacin de protenas y cidos nucleicos atendiendo al tamao es la tcnica de cromatografa de filtracin en gel. Esta tcnica se basa en la distinta velocidad con que diversos solutos de tamaos variables pasan a travs de una columna llena de un gel formado por partculas porosas esfricas de un polmero insoluble pero muy hidratado, tal como el dextrano o la agarosa (polisacridos), o bien la poliacrilamida. El Sephadex, la Sepharosa y el Bio-gel, utilizados normalmente, son distintas preparaciones comerciales de estos grnulos o esferas. Cuando distintos solutos de tamaos variables pasan a travs de la columna de gel filtracin pueden penetrar (en distinto grado) o no en los grnulos del gel; las molculas pequeas pueden entrar en las esferas pero las grandes no pueden. Como resultado, las molculas pequeas se distribuyen, tanto en la solucin acuosa que est dentro de las esferas, como en la que est fuera; en cambio, las molculas mayores slo ocupan la disolucin externa a las esferas. En consecuencia, las molculas grandes fluyen con ms rapidez a travs de la columna y salen antes porque disponen de un volumen accesible menor. Una sustancia con una masa molecular ( de varios millones de dalton, como el azul dextrano, M) nunca penetra en las partculas del gel, saliendo rpidamente de la columna, mientras que una sustancia de M muy baja, como el cromato potsico, tarda mucho ms que cualquier otra molcula en salir, ya que penetra en las partculas retrasndose su elucin. Dentro de unos determinados mrgenes, el volumen de elucin (Ve) de una molcula es proporcional a su tamao (es decir a su M, supuesta una cierta uniformidad de formas de las partculas), por lo que si se calibra la columna con molculas de M conocida y luego se determina el Ve de una molcula problema, se puede determinar su M aproximada. Existen matrices con distinto tamao de poro y, por lo tanto, distinto rango de fraccionamiento (Sephadex G-25, rango 1.000-5.000 Da; Sephadex G-100, rango 4.000-150.000 Da, etc).

TCNICA
El tipo de gel que se utilizar en esta prctica ser SEPHADEX G-50 Fine, cuyas caractersticas son: Rango de fraccionamiento: 1.500-30.000 Da (para protenas globulares). Acondicionamiento: Del producto comercial Sephadex G-50, se toman 1,5 gramos los cuales se embeben en 50 ml de agua destilada y se mantienen durante 1 hora en bao de agua hirviendo con agitacin ocasional (con esto se consigue una perfecta hidratacin del gel). Cuando el gel est hinchado se aade agua destilada fra. A continuacin se desgasifica el gel sometindolo a vaco, con agitacin. a) Empaquetamiento de la columna (este apartado no lo realizarel alumno). 1. Antes de adicionar el gel, en la columna se pone un poco de lana de vidrio en la parte inferior. 2. Una vez preparado el gel, se procede al llenado de la columna (30 ml), en posicin vertical de modo que el gel quede retenido en el interior y el agua salga por la parte inferior. 3. A continuacin se deja 6-8 horas en reposo para que, por gravedad, el empaquetamiento sea perfecto. 4. Despus del empaquetamiento, el pH de la columna se equilibra con tampn fosfato 50 mM pH 7,5. 5. Se debe controlar que el pH a la salida de la columna sea el mismo que el del tampn de equilibrado. NO SE DEBE DEJAR SECAR LA COLUMNA EN NINGN MOMENTO. 6. Finalmente se cierra la salida de lquido de la columna por medio de una pinza. b) Determinacin del volumen total (V t) y del volumen vaco (V 0) de la columna. 1. Dejar salir tampn de equilibrado hasta enrasar el lquido con el nivel del gel. 2. Inmediatamente se introducen con cuidado (con pipeta pasteur, sin burbujas y por las paredes de la columna) 0,4 ml de una mezcla de azul dextrano (M 2.000.000 Da) y de cromato potsico (M 194 Da). 3. Una vez depositada la muestra se empieza a recoger en tubos el lquido que sale de la columna (eluyente), a razn de 1,0 ml de eluido por tubo, para determinar posteriormente el volumen de elucin (V e ). HAY QUE TENER EN CUENTA QUE LA COLUMNA NO PUEDE SECARSE EN NINGUN MOMENTO, por ello: -Una vez que la muestra ha penetrado en el gel, se vierte ms tampn fosfatos en la parte superior de la columna con cuidado, para no alterar su superficie ni redisolver el azul dextrano o el cromato potsico. -Hay que pasar continuamente tampn de equilibrado hasta que eluyan los marcadores. EL FLUJO DE ELUCIN DEBE MANTENERSE DURANTE TODO EL PROCESO, por ello: -Utilizando una pinza de cierre, se mantiene la apertura de la columna de modo que el flujo sea siempre de 12-15 ml/h (1 gota cada 8-10 segundos). LA COLUMNA DEBE REUTILIZARSE POSTERIORMENTE, por ello: -Una vez eludo el cromato potsico se lava la columna con 4 volmenes totales de tampn de equilibrado (unos 30 ml). A continuacin se cierra la pinza hasta el momento de reutilizar la columna. 11

Perfil de elucin: Cada uno de los marcadores absorbe selectivamente a una longitud de onda: 620 nm para el azul dextrano y 375 nm para el cromato potsico. La absorbancia a esas longitudes de onda es proporcional a la concentracin de cada producto. Leyendo espectrofotomtricamente a la longitud de onda adecuada y representando la absorbancia frente al nmero de tubo, podremos obtener el perfil de elucin de cada marcador. El volumen de vaco (Vo) de la columna (espacio mnimo entre las partculas del gel) es el volumen total recogido hasta el pico de salida del azul dextrano (masa molecular muy alta). El volumen total (Vt) de la columna es el volumen total recogido hasta el pico de salida del cromato potsico. El volumen de trabajo de la columna es el volumen recogido entre el pico del azul dextrano y el pico del cromato potsico.

Volumen vacio (Vo)

Volumen total (Vt)

CUESTIONES:
15. Dibujar en una grfica el perfil de elucin de los dos marcadores. 16. Determinar volumen vaco, volumen total y volumen de trabajo de la columna. b) Calibracin de la columna2 Para determinar la masa molecular de la protena problema utilizando esta columna, adems de conocer su volumen total y el volumen vaco, debemos calibrarla previamente con patrones de protena de masa molecular conocida. La calibracin se lleva a cabo mediante la determinacin de los volmenes de elucin de dichas protenas patrn. Para ello se pasan por la columna una a una protenas de M conocidas y que se encuentren dentro del rango de fraccionamiento del gel de la columna: Volumen de elucin (ml) Protena patrn Masa molecular (Dalton) Aprotinina 6.500 Lisozima 14.300 18.400 -lactoglobulina Tripsina 23.500 Anhidrasa carbnica 29.000 El proceso para cada patrn es idntico al seguido cuando se pasan el azul dextrano y el cromato. En cada caso una vez aplicada la muestra, la columna se eluye con tampn de equilibrado, recogindose fracciones de 1 ml. De cada una de las fracciones se realiza una valoracin de protena por lectura de la absorbancia de los tubos a 280 nm (proporcional a la concentracin de protena en un determinado rango). Cuando la absorbancia a 280 nm sea cero, la columna se lava con 4 volmenes totales de tampn (30 ml). Los valores de absorbancia obtenidos se representan en una grfica frente al nmero de tubo y se calcula el volumen de elucin ( e) de las protenas patrones, que ser el volumen recogido hasta la V aparicin del pico de protena. CUESTIONES (Realizar dos tipos de grfica) 17. En papel milimetrado, representar en abcisas el volumen de elucin y en ordenadas el logaritmo de la masa molecular de cada patrn. 18. En papel semilogartmico, representar en abcisas el volumen de elucin y en ordenadas la masa molecular de cada protena patrn. c) Determinacin de la masa molecular del citocromo c 1. Utilizar como muestra 0,4 ml de una disolucin de citocromo c (1 mg/ml). 2. Seguir los pasos detallados en el apartado a. 3. Determinar la absorbancia espectrofotomtricamente a 420 nm (longitud de onda de mxima absorcin del citocromo c de cada una de las fracciones de 1 ml recogidas.

CUESTIONES
19. Determinar el volumen de elucin (Ve). 20. Determinar la masa molecular del citocromo c, utilizando la recta de calibrado.

2La calibracin no la realizar el alumno, para no alargar la duracin de la prctica. Con los datos de volumen de elucin de cada patrn que se mencionan a continuacin, el alumno debe elaborar una grfica que permita posteriormente calcular la masa molecular de la protena problema.

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ESTIMACIN DEL TAMAO MOLECULAR DE UN FRAGMENTO DE DNA POR ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA. FUNDAMENTO
La electroforesis en gel de agarosa es el mtodo habitual de separacin, identificacin y purificacin de cidos nucleicos. La visualizacin del DNA en el gel puede realizarse directamente por tincin con distintas sustancias como el bromuro de etidio o el azul de metileno. De este modo se pueden detectar bandas que contengan tan slo nanogramos (ng) de DNA. Tales bandas pueden incluso ser recuperadas del gel y utilizadas para posteriores manipulaciones. Se puede calcular el tamao molecular de un determinado fragmento de DNA si, en el mismo gel, se incluye un conjunto de fragmentos de tamao conocido.

OH CH2OH O

CH2 O

Estructura del dmero constituyente de la agarosa.

Los geles de agarosa pueden ser preparados en una OH gran variedad de formas, O OH tamaos y porosidades, y pueden O ser sometidos a distintas condiciones electroforticas. La eleccin de los parmetros D-galactosa 3,6-anhidro-L-galactosa ideales viene determinada esencialmente por el tamao de los fragmentos a separar. Mediante geles de agarosa preparados a diferentes concentraciones pueden separarse molculas de DNA cuyo tamao vara entre 200 pares de bases (pb) a 50 kilopares de bases (kb). Normalmente los geles de agarosa se corren en una configuracin horizontal en un campo elctrico constante en corriente y direccin. El bacterifago Lambda es un virus que infecta a la bacteria Escherichia coli. Su genoma consiste en una molcula de DNA bc de aproximadamente 48.500 pb de tamao. La endonucleasa de restriccin HindIII reconoce la secuencia de seis nucletidos 5 AAGCTT 3 en el genoma del fago lambda rompiendo la doble hlice y produciendo un determinado nmero de fragmentos de restriccin a partir del DNA de este virus. En este caso, los fragmentos que se generaron a partir del DNA genmico del fago lambda se utilizarn como marcadores de tamao molecular.

a) Electroforesis en gel de agarosa al 0.8 % en tampn Tris-borato-EDTA (TBE) 1. Sellar una bandeja de electroforesis con cinta adhesiva. 2. Pesar 0,4 g de agarosa y mezclar con 50 ml de tampn 1 x TBE. 3. Fundir en el horno microondas. Dejar enfriar por debajo de 55C, aadir 3 microlitros de bromuro de etidio 10 mg/ml (protegerse con guantes). Mezclar y verter en la bandeja formadora de gel cuidando de que no se formen burbujas. Dejar solidificar durante 30 minutos a temperatura ambiente. 4. Preparar las muestras con tampn de carga de la siguiente manera (volmenes en microlitros): Tubo DNA Lambda/HindIII DNA plsmido linearizado Tampn de carga A 10 3 B 10 3

5. Cargar 10 microlitros de cada muestra (cada una en un pocillo distinto) y con la mayor brevedad y conectar la cubeta de electroforesis a la fuente de alimentacin de corriente contnua. Ajustar la corriente elctrica a 80 Voltios. Desarrollar la electroforesis hasta que el frente de azul de bromofenol alcance al menos la mitad del gel. c) Documentacin del resultado 1. Colocar el gel sobre el transiluminador de luz ultravioleta. 2. Visualizar el resultado utilizando la careta o las gafas protectoras de los ojos. MUY IMPORTANTE! no exponerse nunca a la luz ultravioleta sin la proteccin adecuada. 3. Fotografiar el gel con ayuda de una camara y pelcula de revelado automtico. Apertura de diafragma f = 16 y velocidad de disparo 1 s. 13

CUESTIONES
21. Con ayuda del mapa de restriccin del fago lambda que se facilita, calcular el tamao de los fragmentos resueltos en la calle del marcador. 22. Resumir en una tabla, la distancia recorrida por cada banda (mm) frente la longitud de cada fragmento de DNA (pb) y representar, en una grfica en papel milimetrado, la distancia migrada (mm) frente al logaritmo de pb de los fragmentos del marcador. 23. Con ayuda de la grfica, obtener el tamao molecular (pb) de las bandas de DNA problema. 24. La concentracin en el tubo de Lambda es de 0,1 mg/ml. Calcular la cantidad de DNA y el nmero de molculas presentes en cada banda. Mapa de restriccin del genoma del fago lambda generado con la endonuclesa HindIII (Las coordenadas se expresan en pares de bases).

44141 0 48502

27479 25157 23130

37584 37459 36895

NDICE Prctica Pgina

MTODOS ESPECTROFOTOMTRICOS EFECTO DEL pH SOBRE LA SOLUBILIDAD DE LAS PROTENAS SEPARACIN DE FORMAS ENZIMTICAS POR CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO DETECCIN DE DOS FORMAS MOLECULARES DE LA ENZIMA BETA-D-GALACTOSIDASA DETERMINACIN DEL GRADO DE PURIFICACIN DE LAS FORMAS MOLECULARES DE BETA-D-GALACTOSIDASA DESPUS DE LA CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO CROMATOGRAFIA DE EXCLUSIN MOLECULAR O FILTRACION EN GEL: DETERMINACIN DE LA MASA MOLECULAR DEL CITOCROMO C ESTIMACIN DEL TAMAO MOLECULAR DE UN FRAGMENTO DE DNA POR ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA

2 4 5 7

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