Transkripsi DNA Eukaryotic Nukleolus dalam Eukaryotes Eukaryotes memiliki empat segmen ribosomal RNA dalam ribisosome dibandingkan

dengan tiga segmen dalam prokaroytes. Subunit ribosomal yang lebih kecil memiliki 188 buah RNA dan subunit yang lebih besar memiliki 58,5S dan 288 segmen. Semua selain 5S bagian ribosomal RNA diproduksi sebagai bagian dari potongan RNA yang sama. Akan tetapi, sel eukaryotic memiliki banyak tiruand ari gen ribosomal RNA ini tergantung dengan spesiesnya. Sebagai contoh, lalat buah, Drosophila melanogaster memiliki sekitar 130 kopi area DNA dimana disana segmen ribosomal RNA yang lebih besar dikopi. Daerah ini muncul bersamaan dengan kromosom seks (X dan Y) dan secara bersaman dikenal sebagai organisatornukleolar (lihat Bab 3). Subunit RNA yang terkecil juga dihasilkan dari gen yang dikopi tetapi pada poin yang berbeda dalam genome. Sebagai contoh, pada D. melanogaster, subunit 5S diproduksi oleh kromosom 2. Eukaryotes- tidak seperti prokaryotes, yang hanya memiliki satu RNA polymerasememiliki tiga RNA polymerase. Euckaryotic RNA polymerase I (atau polymerase A) hanya mengkopi DNA organisatornukleolar. RNA polymerase II (atau polymerase B) mentranskrip (mengkopi) kebanyakan gen. RNA polymerase III (atau polymerase C) mentranskrip gen kecil terutama 58 gen ribosomal RNA dan mentransfer gen RNA (Tabel 10.3). Selain itu, mitokondria, kloroplas, dan beberapa mikroba memiliki RNA polymerase lainnya. Pada organisator nukleolar, nukleolus membentuk gumpalan gelap yang sama dalam nuklei eukaryotic. Nukleolus adalah tempat dimana ribosom terbentuk. Berbagai macam protein ribosomal yang diproduksi dalam sitoplasma akan berpindah ke nukleus dan pada akhirnya ke nukleolus dimana dengan bentuk akhir ribosomal RNA mereka akan diubah menjadi ribosom. Dalam organisator nukleolar, daerah spacer DNA yang tidak tertranskrip (terkopi) akan memisahkan setiap pengulangan gen ribosomal yang besar. Ini seperti yang ditunjukkan di gambar 10.20 dan dibuatkan diagramnya pada gambar 10.21. Pada mikrograf elektron di gambar 10.20, polaritas transkripsi terlihat jelas dari RNA pendek

pada satu ujung segmen transkripsi dan RNA panjang di ujung lainnya dengan gradasi (tahapan) yang sama diantaranya. Perhatikan bahwa banyak RNA polymerase mentranskripsi (mengkopi/menduplikat) setiap daerah pada waktu yang bersamaan. Daerah antara segmen DNA yang tertranskripsi adalah daerah spacer DNA. Seperti ransfer RNA, ribosomal RNA juga akan dimodofikasi (diubah); beberapa uridinei diubah menjadi pseudouridine dan beberapa gula ribose juga akan termetalasikan. Perubahan ini terjadi di nukleolus disertai dengan partikel-partikel yang terdiri dari segmen-segmen RNA dan protein yang kecil. RNA disebut sebagai partikel ribonukleoprotein nukelolar kecil (snoRNP). Setiap snoRNP yang berbeda memiliki snoRNA yang melengkapi daerah yang mengelilingi nucleotide yang termodifikasi. Sehingga, tempat modifikasi dipilih berdasarkan sifat melengkapi dari snoRNA yang akan mengarahkan tempat terjadinya modifikasi. Perbedaan Antara Transkripsi Eukaryotik dan Prokaryotik Meskipun semua aspek transkripsi berbeda dalam beberapa hal antara prokaryotes dan eukaryotes; kita akan melihat dua perbedaan utama; gabungan transkripsi dan translasi yang mungkin muncul dalam prokaryotes dan modifikasi pascatranskripsional yang muncul secara ekstensif dalam RNA pembawa pesan eukaryoptic. Pada E.Coli translasi (pemindahan) RNA pembawa pesan yang abru tertranskripsikan kedalam sebuah protein dapat terjadi sebelum transkripsi selesai (gambar 10.22). RNA pembawa pesan tersintesiskan dengan arah 5 3 dan translasi mulai didekat ujung 5. Jika sudah ada ujung 5 RNA, ribosome dapat melekat ke RNA pembawa pesan dan bergerak sepanjang arah 5 3 yang akan memperpanjang polypeptide yang sedang tumbuh ektika dia bergerak. Ketika ribosome pertama bergerak menjauh dari ujung 5dari transkrip, ribosome kedua dapat melekat dan mulai pemindahan (translasi). Proses ini terkjadi berulang-ulang seperti yang ditunjukkan jelas oleh mikrograf elektron (gambar 10.22b). Meskipun demikian, pada eukaryotes RNA pembawa pesan tersintesis dalam nukelus tetapi sintesis protein terjadi dalam sitoplasma. (pemisahan wilayah kerja ini tidak ditemukan dalam E.coli karena diantara alasan-alasan lainnya, bakterium tidak memiliki nukleus). Sebelum RNA pembawa pesan eukaryotic meninggalkan nukleus, RNA ini akan dimodifikasi oleh proses yang umumnya tidak terjadi dalam prokaryotes.

Promotor Promotor eukaryotic agak sama dengan promotor prokaryotic; kedua-duanya adalah area DNA pada awal gen dengan sinyal yang memungkinkan pelekatan polymerase RNA dan pemulaian transkripsi. Meskipun demikian dalam eukaryotes, lebih banyak protein terlibat dalam upaya untuk mengenali promotor dan lebih banyak protein terlibat dalam pengendalian transkripsi yang menunjukkan ribuan basis yang terpisah-pisah. Kita akan membahas proses pengendalian (kontrol) ini pada eukaroytes di bab 16. Semua tiga polymerase RNA eukaryotic (I,II dan III) menunjukkan tujuh urutan. TATAAAA yang terdapat di sekitar 25 pada DNA promotor. Ini sama dengan urutan 10 dalam prokaryotes dan dinamakan dengan kotak TATA (atau kotak Hogness setelah dia ditemukan disekitarnya. Diantara sejumlah besar promotor yang telah disusun (diurutkan), sedikit promotor kekurangan kotak TATA dan tetap saja di transkripkan (dikpoikan). Permulaan transkripsi dalam promotor ini tampaknya dikontrol oleh area yang kaya akan CT yang diberinama elemen awal (initiator element/Inr), pada 1 transkrip (dekat dengan tempat awal transkripsi) disertai dengan elemen promotor bawah (downstream promoter element/DPE) pada seitar +28 sampai +34 transkrip. Dalam promoter yang memiliki sedikit TATA, protein yang bernama TFIID membutuhkan elemen-elemen ini untuk melakukan pengikatan. Elemen awal memiliki susunan konsesus TCA(G atau T)T(T atau C) dan elemen promotor bawah memiliki susunan konsesus (A atau G)G(A atau T)CGTG. Kita akan berkonsentrasi pada gen RNA polymerase II dengan kotak TATA. RNA Polymerase II pada ragi adalah protein dengan dua belas subunit. Enzim ini tidak dapat meletakan promotor atau terikat pada DNA secara stabil. Agar terikat pada permulaan gen, RNA polymerase II harus ebrinterkasi dengan beberapa protein yang dinamakan dengan faktor transkripsi umum. Dalam eukaryotes, faktor transkripsi umum dinamakan berdasarkan polymerase dimana mereka berfungsi. Sehingga faktor transkripsi yang menunjukkan adanya kotak TATA untuk gen polymerase II dinamakan dengan TFIID (D adalah huruf keempat di alfabet yang menandakan faktor transkripsi keempat). TFIID terdiri dari satu sub-uniot yang menunjukkan adanya susunan TAT yang dinamakan oleh D.Hogness). Karena RNA polymerase II mentranskrip (mengkopi/menduplikat) gen dalam eukaryotes, maka pembahasan kita akan berkisar

dengan protein pengikat TATA (TATA binding protein /TBP) dan sampai lusinan protein yang dinamakan dengan faktor yang ada hubungannya dengan TBP (TBP-associated factors/TAF) yang menunjukkan adanya elemen awal yang ada dan membantu penyusunan transkripsi. TFIID sama dengan faktor sigma pada prokaryotic RNA polymerase. Satu aspek pengikatan TBP yang menarik adalah bahwa pengikatan itu akan mengakibatkan pengikatan dan pembukaan DNA yang signifikan (gambar 10.23). Pengikatan mungkina dalah sinyal penting untuk protein pengikat lainnya. Ketika TFIID mengikatkan dirinya pada kotak TATA, akan muncul proses pengikatan faktor transkripsi lainnya. Akan muncul pengikatan faktor transkripsi IIA, IIB, dan IIF seperti halnya juga RNA polymerase II dalam kondisi takterfosforilasi yang akan membentuk preinisiasi kompleks (PIC) yang sama dengan holoenzim pada E.coli (gambar 10.24a). RNA Polymerase II kemudian terfosforilasi, mungkin oleh TFIIH, yang merupakan sebuah kinase: pada poin ini kebanyakan faktor transkripsi akan jatuh dan menyisakan elongasi kompleks yang menjadi penghitungan dasar transkripsi (gambar 10.25). TPIIH juga memiliki peran. Tabel 10.4 meringkas perkiraan peran dari faktor transkripsi umum. Agar muncul transkripsi aktif, level transkripsi yang tinggi, faktor lainnya diperlukan masuk dalam pengendalian dimana promoter ditranskrip (dikopi) dengan aktif. Faktor-faktor lain ini adalah akifator atau faktor transkripsi tertentu yang mengikat susunan DNA yang dinamakan dengan materi penguat. Materi penguat seringkali terdiri dari ratusan atau ribuan pasangan atas dasar dari promotor (gamabr 10.24b). Perhatikan bahwa banyak dari informasi ini dikumpulkan dari catatan kaki, studi mutasional, kloning dan pengisolasian gen dan protein yang terlibat didalamnya dan jemudian menghubungkan kembali berbagai macam kombinasi dalam tabung uji. Studi ini dikombinasikan dengan penelitian kinetis untuk menentukan susunan mana yang stabil, sebuah penelitian imunologis untuk mengisolasi berbagai amcam komponen dengan antibodi dan studi photocrosslinking untuk menentukan moitas mana yang saling berhubungan satu sama lain. Aktifator transkripsional tertentu ini memiliki wilayah yang menunjukkan adanya susunan materi penguat (enhancer) tertentu mereka, wilayah yang dapat menunjukkan adanya protein yang berhubungan dengan polymerase (faktor transkripsi umum) dan

wilayah yang memungkinkan terbentuknya pengikatan faktor transkripsi lainnya (gambar 10.24b). Sama halnya dengan aktifator dan penguat (enhancer), penekan (represor) dapat terikat ke wilayah silencer DNA pada arus jauh promotor untuk menekan transkripsi. Sehingga, banyak gen berhubungan dengan berbagai macam susunan faktor transkripsi yang kompleks yang memunculkan kontrol transkripsi yang rumit (lihat bab 16). Agar faktor transkripsi tertentu dapat terikat pada penguat dan mesin polymerase, mungkin ribuan pasangan dasar yang terpisah, DNA harus melipat dirinya agar mereka menjadi susunan polymerase. Mikrograf elektron dengan jelas menunjukkan DNA yang melipat dirinya dan menekuk membentuk semacam kurva (gambar. 10.26). Meskipun RNA polymerase I dan III tampaknya memiliki sinyal penghentian yang sama dengan promotor rho-independen dalam prokaryotes, penghentian transkripsi gen RNA polymerase II lebih kompleks dengan disertai proses mRNA yang lebih lanjut. Sebelum kita bergerak terus, ada beberapa poin lainnya yang butuh kita bahas. Pertama, tidak seperti prokaryotik RNA polymerase, eukoryotic RNA polymerase betulbetul dapat terlihat jelas (menunjukan aktifitas eksonuklease 3 5 ). Kedua, seperti yang kita bahas di bab 15, eukaryotik DNA semakin rumit karena adanya protein histone yang dapat mengganggu jalannya ranskripsi. Sebaliknya, bagian dari RNA polymerase II kompleks terbuatd ari protein yang dapat mengganggu histon yang terikat pada DNA. Selain itu, RNA polymerase II kompleks terdiri dari protein yang berperan sebagai perantara antara aktifator dan polymerase holoenzim. Koordinasi awal transkripsi yang kompleks pada eukaryotes ini diberi nama dengan kontrol kombinatoerial: proses awal yang sangat kompleks mungkin bisa terdiri dari 85 atau lebih polypeptide berbeda. Pada akhirnya, transkripsi dalam archaea, meskipun dibawah kontrol yang lebih sederhana daripada dalam eukaryotes, lebih mirip transkripsi dalam eukaryotes daripada prokaryotes. Studi tentang detail proses transkripsi- proses awal, kontrol dan penghentian-nyaadalah satu dari area dalam ilmu genetika modern yang menarik. Tutup dan Ekor Transkripsi eukaryotik menghasilkan transkrip primer (utama). Berbeda dengan kebanyakan transkrip prokaryotik yang terdiri dari informasi dari beberapa gen, semua transkrip dari eukaryoptes yang lebih tinggi terdiri dari informasi dari hanya satu gen. (Transkrip dari beberapa gen ditemukan dalam beberapa eukaryoptes yang lebih rendah

seperti cacing nematoda). Tiga perubahan utama terjadi dalam trnaskrip utama pada RNA polymerase II sebelum pemindahan ke sitoplasma: modifikasi ke ujung 5 dan 3 dan pembuangan susunan yang mengganggu. Kita menyebut perubahan ini sebagai modifikasi pascatranskripsional. Pada ujung 5 transkrip polymerase II, 7-metil guanosine ditambahkan kedalam arah yang salah, 5 5 (Gambar 10.27). Tutup (cap) ini memungkunkan ribosom untuk menunjukan munculnya RNA pembawa pesan. Di ujung lainnya, ujung 3 transkrip polymerase II, sebuah susunan yang terdiri dari dua puluh sampai dua ratus nukleotide yang mengandung adenin yang disebut dengan ekor poli-A ditambahkan dari enzim poli-A polymerase. Polyadenylation akan muncul setelah ujung 3 transkrip dipindahkan oleh nukleus yang memotong sekitar dua puluh nukeotitel kebawah menuju ke molekul dan membantu pemindahannya dari nukleus. Ketika RNA pembawa pesan pertama kali dipelajari pada cukaryotes, RNA pembawa pesan dalam nukleus ditemukan jauh lebih besar daripada yang ditemukan di sitoplasma dan dinamakan dengan mRNA inti heterogen atau hnRNA. Sekarang terlihat inilah transkrip utamanya, RNA yang tidak memiliki modifikasi pascatranskripsional utama. Mereka adalah RNA pra-pembawa pesan. Intron Eukaryotes memiliki segmen DNA didalam gen yang ditranskripkan kedalam RNA tetapi tidka pernah dipindahkan (atau diubah) menjadi susunan protein. Susunan yang masuk ditengah-tengah proses atau intron dipindahkan dari RNA dalam nukelus sebelum pemindahannya kedalam sitoplasma (gamabr 10.28). P.Sharp dan temannya di MIT dan R. Roberts, T.Broker, L. Chow dan teman-temannya di Universitas Cold Spring Harbor menemukan intron di tahun 1977. (Sharp dan Roberts diberi penghargaan Nobel pada tahun 1993). Contoh gen dengan nitron muncul pada gambar 10.29. Segmen gen antara nitron yang ditranskripkan dan diubah- dan dipindahkan ke sitoplasma dan ditampilkan dinamakan dengan exon. Hasil dari pemindahan intron terlihat jelas ketika RNA pembawa pesan terhibidrasi dengan gen yanga sli (gamabr 10.30). DNA akan membentuk struktur dengan jenis ganda dengan exon didalam RNA sehingga mereka membentuk lingkaran

dengan satu jenis. Intron juga muncul dalam RNA pemindahan eukaryotic dan gen ribosomal. Agar intron dapat dipindahkan, ujung exon harus dikumpulkan dan dihubungkan dalam proses yang dinamakan dengan proses penyambungan. Setidaknya ada dua tipe penyambungan meskipun mereka berhubungan: penyambungan sendiri dan penyambungan dengan bantuan protein. Penyambungan sendiri Di tahun 1982, Thomas Cech dan temannya termasuk Sidney Altman yang mengatakan bahwa RNA dapat memiliki sifat katalis menemukan penyambungan RNA sendiri. (Cech dan Altman diberi hadiah Nobel dalam bidang Kimia). Dengan meneliti intron dalam 355 RNA ribosomal awal pada protozoa tersiliasi, Tetrahymena, Cech dan teman-temannya menemukan bahwa mereka dapat memunculkan pmindahan intron secara in vitro tanpa ada protein. Nucleotide yang mengandung guanine (GMP, GDP atau GTP) harus ada.. gambar 10.31 menunjukkan diagram terjadinya penyambungan sendiri. Intron bertindak sebagai enzim; kita sebut dengan RNA dengan properti enzimatis sebuah ribosom. Selama penyambungan sendiri, ikatan U-A di sisi kiri (5) intron dipindahkan ke GTP. U yang tidak terikat akan memindahkan RNA dengan hubungan U-U dan melepaskan intron (gambar 10.31). Karena semua ikatan dapat dipindahkan secara terbalik (transesterifikasi) dan bukanlah ikatan baru, tidak ada sumber energi eksternal yang kita butuhkan. Intron penyambung sendiri tipe ini dinamakan dengan intron grup I. Struktur sekunder (RNA lingkaran-batang) juga merupakan pemindahan intron yang penting. Smeskipun aktifitas enziamtis ribosim adalah pemindahannya sendiri, struktur sekundernya setelah pemindahan memberikannya kemampuan untuk melakukan katalisasi reaksi lebih lanjut (gambar 10.32). reaksi yang dikatalisasikan oleh ribosim berisfat transesterifikasi dan reaksi hidrolisis yang akan memecahkan molekul RNA menjadi dua bagian. Ribosim juga dapat melakukan fungsi lainnya termasuk pembentukan formasi ikatan peptide yang dibahas di bab 11. Saat ini setidaknya ada tujuh kelas ribosim yang berbeda berdasarkan apda sifat enzimatis mereka. Sebuah ribosim dapat memecah RNA lainnya dan yang muncul di patogen tanaman kecil dinamakan dengan hammerhead ribozyme (gamabr 10.33) karena bentuknya. Karena molekul RNA ini ukurannya kecil

mereka memiliki potensi untuk dimodifikasi dalam laboratorium untuk tujuan tertentu yang berhubungan dengan perawatan klinis dan studi proses RNA selanjutnya. Penyambungan diri juga dapat ditemukan di gen di mitokondria ragi. Intron ini disebut dengan Intron grup II karena mereka menggunakan mekanisme penyambungan yang berbeda yang tidak membutuhkan nukleotide eksternal. Justru, ikatan pertama dipindahkan didalam intron ke adenosine sehingga membentuk struktur lariate (gambar 10.34). Agar terbentuk lariate, ribose adenosine harus membuat tiga ikatan fosfodiester (gambar 10.35).