NB: Esta enfermedad ya no aparece en la lista del captulo 1.2.3 del Cdigo de animales acuticos.

Este captulo no ha sido actualizado desde 2003.

CAPTULO 2.1.12

SEPTICEMIA ENTRICA DEL BAGRE (Edwardsiella ictaluri)

RESUMEN
La septicemia entrica del bagre (SEB) est causada por Edwardsiella ictaluri, que pertenece a la familia de las enterobactericeas (11). La SEB supone uno de los problemas ms importantes causados por las enfermedades infecciosas en la industria del bagre de los Estados Unidos de Amrica (EE.UU.). La mayora de los casos de enfermedad causados por E. ictaluri se encuentran en el bagre de canal (Ictalurus punctatus), pero la bacteria se ha aislado de los bagres de Norteamrica mencionados, incluido el bagre azul (I. furcatus), del bagre blanco (Ameiurus catus) y del pez gato (A. nebulosus) (11). La SEB tambin se ha descrito en Clarias batrachus de Tailandia (12) y en varias especies de peces ornamentales (13, 37). Se ha demostrado experimentalmente la susceptibilidad de otras especies, incluidos los salmnidos (4). No se debe confundir la Edwardsiella ictaluri con la E. tarda, otro miembro del mismo gnero, que se encuentra con frecuencia en los animales acuticos y es responsable de infecciones oportunistas en peces y mamferos, incluidos los humanos. Se ha descrito en varios estudios que E. ictaluri es una especie muy homognea desde el punto de vista bioqumico y antignico. (5, 21, 33, 38). Los brotes agudos de la SEB ocurren dentro de un rango limitado de temperatura que va desde los 18C a los 28C. Este rango crtico de temperatura hace que la primavera y el otoo sean los perodos de brotes en las regiones donde normalmente se cultivan los bagres. Sin embargo, puede ocurrir un bajo nivel de mortalidad por SEB en poblaciones de portadores que se encuentren fuera de ese rango de temperatura. Otros factores ambientales (como la pobre calidad del agua, la alta densidad de almacenamiento y otros factores estresantes), predisponen el hospedador a la infeccin por la SEB. Se considera que Edwardsiella ictaluri es, en sentido estricto, un autntico patgeno. Se dan dos formas clnicas de la SEB en el bagre, la encefalitis crnica y la septicemia aguda (20, 22, 30). En la forma crnica, la bacteria infecta el saco olfativo y emigra a lo largo de los nervios olfativos hacia el cerebro, ocasionando inflamacin granulomatosa. Esta meningo-encefalitis causa un comportamiento anormal, en la que alterna la apata y la natacin errtica. En las ltimas etapas de esta enfermedad se desarrolla una hinchazn en el dorso de la cabeza y un proceso inflamatorio deteriora el tejido conjuntivo de esa regin. Esa hinchazn se ulcera dejando al descubierto el cerebro. Esto nos lleva al trmino enfermedad de la perforacin de la cabeza, utilizado en la industria. En la forma aguda de la SEB se cree que la bacteria infecta a travs de la mucosa intestinal (3), y luego establece una bacteremia. El pez afectado presenta hemorragias petequiales alrededor de la boca, en la garganta, el abdomen y en la base de las aletas. Tambin se dan lesiones cutneas hemorrgicas y multifocales que se caracterizan por su dimetro de 2 mm, que se convierten en lceras decoloradas. La anemia, la inflamacin moderada de las branquias y el exoftalmos son signos comunes. Internamente, las hemorragias y los focos necrticos estn diseminadas en el hgado y otros rganos internos. La enteritis hemorrgica, el edema sistmico, la acumulacin de lquido asctico en la cavidad corporal y esplenomegalia, son signos no especficos. El examen histolgico revela una infeccin sistmica de todos los rganos y msculos del esqueleto, y los cambios ms graves son la necrosis intersticial difusa del rin anterior y posterior. Generalmente se observa necrosis focal en el hgado y el bazo. Los peces procedentes de una poblacin que se ha recuperado de la enfermedad se consideran portadores. Esos peces tendrn inmunidad protectora y pueden tener grandes cantidades de anticuerpos especficos de E.-ictaluri. Ocasionalmente, las prdidas debidas a la reaparicin de la SEB tendrn lugar en estas

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poblaciones, especialmente despus de que se produce estrs. Se ha detectado Edwardsiella ictaluri en el rin de dichos peces despus de 4 meses de exposicin. (2, 14), lo que sugiere que el pez portador acta como reservorio natural para el organismo. Se cree que la eliminacin en las heces es el principal medio de diseminacin en el medio ambiente. La persistencia del patgeno y la prctica comn de la recoleccin parcial continua y la concentracin dentro de un estanque de produccin han contribuido al xito del patgeno y a la prevalencia de la SEB en la industria. Por otra parte, el agente puede sobrevivir en los sedimentos de un estanque durante un largo perodo de tiempo (27), y este puede ser otro factor importante en la reaparicin de la enfermedad en reas concretas. Los investigadores han encontrado la bacteria en el intestino de los pjaros que se alimentan de peces por medio de la prueba de inmunofluorescencia en el alimento, pero, generalmente, E. Ictaluri no puede cultivarse indicando que las bacterias no son viables (34, 40). Esto sugiere que los pjaros no son un medio importante de diseminacin de ese patgeno. La SEB puede controlarse por medio de quimioterapia y/o medidas profilcticas. Los tratamientos antimicrobianos ms comunes son la aplicacin oral de sulfonamida sulfadimetoxina ormetoprim o oxitetraciclina potenciados, pero puede darse resistencia de los plsmidos a esos antibiticos (6). Muchos productores estn ahora centrados en mtodos alternativos para reducir las prdidas. Dichos mtodos se basan en el tratamiento para reducir el estrs del pez, el cese de la alimentacin cuando se detectan prdidas causadas por la SEB (41) y la vacunacin.

TCNICAS DE DIAGNSTICO 1. IDENTIFICACIN DEL AGENTE

La identificacin de Edwardsiella ictaluri se basa en el aislamiento del agente causal y en la caracterizacin por medio de pruebas bioqumicas. Edwardsiella ictaluri puede diferenciarse fcilmente de E. tarda por su incapacidad para producir indol y sulfuro de hidrgeno. (E. tarda produce ambos). Adicionalmente, la dos especies no reaccionan de forma cruzada serolgicamente. 1.1. Aislamiento e identificacin bacteriana a) Muestreo y aislamiento del agente. Deben tomarse muestras bacteriolgicas, de forma asptica, del cerebro y el tejido del rin de peces moribundos o recin muertos. Se siembran en placas de agar con sangre para aislamiento, de infusin de agar cerebro/corazn (ICC) o en placas de agar nutritivo. Las bacterias crecen lentamente pero no necesitan de nutrientes especiales. En cultivos mixtos, E. ictaluri puede crecer en exceso por un crecimiento rpido de la bacteria, pero E. ictaluri est presente en un gran nmero de peces afectados por la SEB. Se ha desarrollado un medio selectivo (EIM) que puede ser til cuando las muestras que se extraen de ambientes fuertemente contaminados, pero su uso no es esencial en circunstancias normales. Para la deteccin de un estado portador en una poblacin sana, se homogeneiza tejido del rin en 0,5 % de Tritn X-100 filtrado en 0,45 m de nitrocelulosa y cultivado en medio agar EIM (8) o se cultiva el tejido de rin homogeneizado toda la noche en lquido de EIM y se siembran 100 l de esta muestra en placas de agar de BHI (14). La administracin intraperitoneal de 0,8 mg/g de Kenalog (acetonida de triamcinolona) a peces portadores sospechosos dos semanas antes de intentar el cultivo aumenta la posibilidad de deteccin de la bacteria (2). La temperatura ptima para la incubacin es de 2830C. Para el muestreo rutinario de poblaciones de peces, vase el captulo I.1, seccin B.1. b) Caractersticas Despus de la incubacin durante 36-48 horas, E. ictaluri aparece como colonias no pigmentadas, lisas, circulares (de entre 1-2 mm. de dimetro), ligeramente convexa y con todos sus bordes. Se trata de un bacilo Gram-negativo que mide 0,752,5 m, de movilidad

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lenta por medio de flagelacin peritrica y es citocromo oxidasa negativo. Esta bacteria crece lentamente o no crece nada a 37C. Despus del aislamiento, la bacteria debe ser identificada por sus caractersticas serolgicos y bioqumicos (10, 11). En el cuadro 1 se muestran algunas de las caractersticas de las especies y biogrupos del gnero Edwardsiella y de bacterias similares que pueden aislarse de los peces, como se indica en el Manual of Determinative Bacteriology de Bergey (9). Puede utilizarse una temperatura ptima de crecimiento de 28-30C para evaluar las caractersticas bioqumicas. Edwardsiella ictaluri es menos activa bioqumicamente que las otras especies de Edwardsiella, pero parece ser homognea (38). No se detecta una variacin clara del biotipo. Edwardsiella ictaluri y E. tarda pueden diferenciarse entre s bioqumicamente por la produccin de indol y de sulfuro de hidrgeno (E. tarda produce los dos, mientras que E. ictaluri no). Tambin E. tarda, Yersinia ruckeri, Hafnia alvei y E. hoshinae crecen bien a 37C, mientras que E. ictaluri no. Edwardsiella ictaluri degrada sulfato de condoitrina y ste puede ser un factor de virulencia importante (7, 32, 38).

Cuadro 1. Diferenciacin de las especies y los biogrupos del gnero Edwardsiella y de otras enterobactericeas
encontrados en los peces*
Hafnia alvei
+ + + d

Caracterstica
Produccin de cidos a partir de: D-Manitol Sacarosa Trehalosa L-Arabinosa Utilizacin de malonato Produccin de indol Produccin de sulfuro de hidrgeno en triple azucar hierro (agar) Motilidad Citrato (de Christensen) * ** ***

Yersinia ruckeri
+ +

E. tarda
Silvestres + + Biogrupo 1 + + + +

E. hoshinae
+ + + () +

E. ictaluri

+ +

+ +

+ (+)

**

Manual of Determinative Bacteriology, de Bergey . Motilidad semanal a 28C, Hawke, 1979. El citrato puede ser negativo en tiras de ensayo rpido (API 20E). La prueba debe realizarse a 25C.

1.2. Deteccin del antgeno bacteriano por mtodos serolgicos Adems de caractersticas bioqumicas bien definidas, las especies tienen una homogeneidad antignica, y la serologa puede diferenciar con facilidad E. ictaluri de otras enterobactericeas (5, 26, 29). Para obtener un diagnstico confirmativo, se han utilizado: la aglutinacin en un porta con antisueros contra E. ictaluri, las tcnicas de inmunofluorescencia (FSTs), el enzimoinmunotincin y el enzimoinmunoensayo ELISA. En estas pruebas se utilizan anticuerpos monoclonales (Mabs) especficos y caracterizados, pero tambin se utilizan antisueros policlonales obtenidos mediante la utilizacin de bacterinas inactivadas con formol para inmunizar a los conejos de acuerdo con los estndares clsicos (1, 16, 28). a) Prueba de aglutinacin Las colonias aisladas se mezclan suavemente en una gota de solucin salina estril en un porta de vidrio limpio, y se aade una gota de antisuero. La aglutinacin de la bacteria se puede evaluar por comparacin con suspensiones similares en suero de conejo normal (control). La dilucin apropiada del suero de reaccin se habr determinado previamente ensayando un control de una cepa de E. ictaluri en diluciones seriadas dobles de este suero.

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b) Inmunofluorescencia especfica La prueba de inmunofluorescencia indirecta (IFI) se puede emplear en frotis bacterianos o en frotis de rganos infectados para una confirmacin rpida de un diagnstico clnico (28). Los frotis se secan al aire y se calientan durante 2 minutos a 60C antes de sumergirlos y se incuban durante 5 minutos con anticuerpo especfico de conejo. Luego se lavan en solucin salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,2, y se sumergen durante 5 minutos con anticuerpo secundario especfico de Ig para conejo conjugado con isotiocianato de fluorescena (FITC). Despus de enjuagarlos, se montan los portas con cubreobjetos utilizando un medio de montaje de fosfato tamponado, y se observan microscpicamente para fluorescencia verde brillante bajo epi-iluminacin azul. Se utiliza sobrenadante de cultivo de clulas no diluido cuando se usan Mabs que han sido obtenidos a partir de cultivos de clulas en la primera etapa y un anticuerpo secundario especfico de Ig para ratn conjugado con FITC, que est disponible en el mercado, y a la concentracin de trabajo sugerida (1). Los frotis de suspensiones bacterianas deben ser muy finos. Los controles positivos y negativos (tales como E. tarda), deben teirse en portas separados. c) Enzimoinmunotincin Se ha descrito la tcnica del enzimoinmunotincin para identificar directamente a E. ictaluri en frotis de tejido de peces infectados (28). Los frotis se preparan como para la prueba IFI las primeras etapas son similares, pero en la segunda etapa de incubacin se utiliza inmunoglobulina heteroespecfica contra antisuero de conejo, conjugada con peroxidasa de rbano. Se lleva a cabo una tercera etapa de incubacin con un sustrato (DMOB, Sigma) durante 10 minutos y despus de lavar y secar los frotis, se montan en glicerina tamponada y se observan microscpicamente con trans-iluminacin normal. Si los frotis son muy gruesos, pueden producir retencin no especfica del colorante. Puede resolverse el problema aclarando de nuevo el frotis durante 1/2 minutos en HCL 1N. 1.3. Diagnstico basado en el cido nucleico Los ensayos basados en la amplificacin por PCR de las secuencias estructurales de ARN de las colonias bacterianas y la secuenciacin directa de los productos han sido adoptados por varios laboratorios bacteriolgicos de diagnstico, y algunos de los ensayos estn disponibles en el mercado (MicroSeq, Applied Biosystems). La confirmacin de las especies puede hacerse por amplificacin y secuenciacin de la porcin 16S del opern de ARN ribosmico y la comparacin de la secuencia con el nmero de acceso AF310622 de GenBank.

2. MTODOS ESTNDARIZADOS DE EXAMEN PARA LA SEB

2.1. Deteccin del agente Las tcnicas son las mismas que se describen en la seccin 1. A menos que se apliquen primero en bacterias aisladas y purificadas, cualquier resultado positivo que se obtenga utilizando un mtodo de deteccin, deber ser confirmado, preferiblemente por cultivo y aislamiento de la bacteria. 2.2. Pruebas serolgicas Aunque rara vez se utilizan pruebas de deteccin de anticuerpos para diagnsticos rutinarios y no estn aprobadas como procedimientos oficiales, dichas pruebas podran ser valiosas para el anlisis masivo de grandes cantidades de peces, necesarios para el desarrollo de polticas de control sanitario. La especificidad de la bacteria y la deteccin de la presencia de anticuerpos circulantes en el suero de peces recuperados de la enfermedad, sostienen esta hiptesis. a) Prueba de microaglutinacin La microaglutinacin directa, realizada en microplacas de fondo redondeado de 96 pocillos, tal como se describe para otros patgenos bacterianos (19), puede proporcionar datos

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cuantitativos con un coste mnimo cuando no se requiere una sensibilidad muy alta. Todo lo que se necesita es una suspensin de bacterias inactivadas con formol, preparada de acuerdo con la tcnica usual (ej. formalina [0,35% (v/v)] durante toda la noche) y ajustada a una densidad ptica de 0,8 a 525 nm (en torno a 5 108 unidades formadoras de colonias por ml). Se preparan diluciones dobles de sueros en solucin salina isotnica de forma que haya un volumen final de 25 l/pocillo. Se aade antgeno (75 l/pocillo) y se incuban las placas durante 2 horas a 37C y toda la noche a 4C antes de su lectura. Los controles incluyen un suero estndar de conejo de ttulo previamente establecido y antgeno incubado en la solucin salina. b) Hemaglutinacin pasiva Esta tcnica se ha descrito utilizando lipopolisacrido de E. ictaluri (1 mg/ml en PBS, pH 7,2) que recubren de forma pasiva los eritrocitos humanos del grupo O al 4% (29). Los sueros probados deben calentarse durante 30 minutos a 45C para inactivar el complemento y deben absorberse con eritrocitos humanos del grupo 0 para eliminar las aglutininas inespecficas antes de hacer las diluciones en solucin salina tamponada. Se utilizan clulas sanguneas revestidas ajustadas al 1% de concentracin. Se incuban durante 6 horas a temperatura ambiente y durante toda la noche a 4C. Los controles incluyen eritrocitos revestidos y no revestidos en tampn, y clulas revestidas en suero. c) Enzimoinmunoensayo indirecto Se han elaborado mtodos ELISA para detectar los anticuerpos del pez gato contra E. ictaluri y son los ms usados en la investigacin (15, 39). En el primer mtodo se usan bacterias enteras muertas mediante calor en una proporcin de 4 108 clulas/ml PBS, 50 l/pocillo para recubrir las placas ELISA tratadas con poli-L-lisina (39). Se lavan las placas con PBS y luego se bloquean mediante la adicin de 100 l of 100 mM de glicina y 1% de albmina de suero bovino en PBS durante 30 minutos. Luego se incuban las placas durante 30 minutos con diluciones de los sueros analizados, se lavan y se incuban con inmunoglobulina srica anti-especie de peces (puede usarse MAb), se lavan y se incuban con anticuerpos conjugados (bien sea con peroxidasa de rbano o con fosfatasa alcalina) especifico para el anticuerpo secundario. Luego se lava la placa y se aade sustrato cromognico de la enzima, se deja que aparezca el color y se lee la placa. El segundo mtodo es similar pero se usa un antgeno principal soluble (16) obtenido por sonicacin de la bacteria, o simplemente dializando los sobrenadantes de caldos de cultivo de 24-horas y concentrando la muestra hasta conseguir un contenido de protena de 25 g/ml. Se usa en torno a 100 l para recubrir los pocillos de las microplacas. En primer lugar, deben determinarse las concentraciones ptimas de trabajo para cada reactivo utilizado en la prueba. Se ha demostrado que estas tcnicas son tiles par la investigacin de la respuesta inmune del bagre de canal a E. ictaluri, y pueden aplicarse para determinar si las poblaciones de peces han estado expuestas previamente.

REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNSTICO

Se ha revisado por Plumb en 1988 (25) y por Thune et.al. en 1997 (36) la posibilidad de proteger las poblaciones del bagre de canal por medio de la vacunacin. Se sabe que Edwardsiella ictaluri induce una respuesta de anticuerpos despus de la enfermedad natural o la inmunizacin. En EE.UU. se autoriz provisionalmente y se comercializ en 1991 una vacuna comercial contra la SEB que consista en una bacterina inactivada. Esta vacuna no era muy efectiva y no se volvi a comercializar. Algunos factores relacionados con la edad y la induccin de una respuesta inmune celular podran ser de vital importancia en la induccin de potentes defensas anti-E. ictaluri. Algunos estudios recientes realizados por Petrie-Hanson y Ainsworth muestran que el pez gato inmaduro de menos de 3 semanas de edad no responde inmunolgicamente a E. ictaluri (23), y se cree que esto es debido al escaso desarrollo de los rganos linfoides en los peces jvenes (24). El uso de nuevos agentes atenuados parece garantizar una induccin de respuestas inmunes ms efectivas (7, 17, 18, 35). Una cepa modificada est disponible en el

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mercado (17), y cuando se administra a dosis alta a los alevines de 12 das, persiste el tiempo suficiente para inducir una inmunidad protectora (42). Son prometedores los estudios adicionales sobre el desarrollo de cepas genticamente resistentes del pez gato (43) y pueden ayudar a reducir las prdidas causadas por esta importante enfermedad.

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Manual de pruebas de diagnstico para los animales acuticos 2006

Captulo 2.1.12 Septicemia entrica del bagre

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NB: Existe un laboratorio de referencia de la OIE especializado en septicemia entrica del bagre (Edwardsiella ictaluri) (vase el cuadro al final de este Manual de animales acuticos o consltese la lista actualizada en la pgina Web de la OIE : www.oie.int).

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