PRCTICA

2.

FOTOSNTESIS: DE PIGMENTOS

EXTRACCIN, VEGETALES

SEPARACIN Y MEDIDA

Y DEL

CUANTIFICACIN

DESPRENDIMIENTO FOTOSINTTICO DE OXGENO

El estudio de los compuestos biolgicos implica su extraccin y separacin del material (clula, tejido, rgano, etc.) en que se encuentren. Uno de los abordajes ms utilizados para este propsito consiste en el uso de tcnicas de cromatografa (proceso de separacin de mezclas complejas mediante particiones entre una fase fluida mvil y una fase estacionaria). Otra tcnica es la de separacin por reparto entre disolventes inmiscible, que permite separar una mezcla de sustancias en funcin de su solubilidad en distintos compuestos inmiscibles. Como aplicacin de estas dos tcnicas, en el desarrollo de esta prctica se extraern 4 tipos de pigmentos vegetales: clorofilas a y b, carotenos y xantofilas. Todos ellos tienen carcter apolar, qunque su graod de polaridad vara en funcin de su composicin qumica. De esta forma, existe un gradiente de polaridad desde el ms apolar al menos apolar.

Esta propiedad permite su separacin, y su distinto color su identificacin. Su color permite tambin su cuantificacin por tcnicas expectrofotomtricas. Finalmente, mediante mtodos polarogrficos, con la ayuda de un oxmetro (electrodo de oxgeno), se medir el desprendimiento fotosinttico de O2 en un cultivo de cianobacterias (microalgas verde-azuladas).

1.- Separacin por reparto en disolventes inmiscibles

Los pigmentos vegetales se extraern en medio lquido (etanol) con calor, y se separarn utilizando disolventes inmiscibles de distinto grado de polaridad.

Prctica

En las mesas hojas de espinaca, distintos disolventes y embudos de decantacin para separar fases inmiscibles.

Mtodo: 1. Extraccin: trocear la hoja de espinaca. Introducir los trozos en un tubo de ensayo de calibre grueso y aadir 10 mL de etanol. Taparlo con algodn y calentarlo al bao Mara durante aproximadamente 5 min (retirarlo cuando el etanol adquiera un color verde intenso). Verter el etanol con los pigmentos disueltos en otro tubo de ensayo. 2. Separacin: Aadir al embudo de cdecantacin (con la llave cerrada) 5 mL de gasolina. Tomar 5 mL de extracto de pigmentos y aadirlos sobre el embudo de decantacin. Se formarn dos fases (A y B)

A B

Aadir 2 mL de agua (o ms, hasta que la fase inferior quede sin pigmentos). Desechar la fase inferior (B).

Aadir en el embudo 3 mL de metanol 92% (v/v). Se formarn dos fases (C y D).

C A D

Recoger ambas fases en sendos tubos de ensayo (usar un tubo de ensayo largo para la fase C)

Aadir al tubo con la fase C 2 mL de KOH-metanlica 30% (p/v) y agitar bien durante 2 min. Se formarn dos fases (E y F).

E C

Cuestiones: 1. Qu contiene cada una de las fases?Por qu esa distribucin? 2. Cmo se separaran los pigmentos de la fase D?

2. Cromatografa en papel

Los pigmentos se separarn en base al mismo principio utiolizado en la prctica anterior, con la diferencia de que en este caso, uno de los disolventes utilizados se mueve sobre un soporte slido (papel).

Prctica

La fase mvil ser un disolvente apolar (mezcla de ter de petrleo/acetona/benceno en proporcin 85/10/5). La fase estacionaria, de naturaleza polar, ser el agua adcorbida en el papel de celulosa utilizado como soporte. La fase mvil ascender por el papel sin mezclarse con el agua, al tiempo que los pigmentos se irn separando en funcin de su polaridad. Los pigmentos ms polares se retendrn ms en la fase estacionaria, mientras que los ms apolares avanzarn ms rpido junto con la fase mvil. La movilidad de cada compuesto respecto al frente del disolvente tiene un valor caracterstico, en unas condiciones experimentales determinadas, que se conoce como coeficoente o factor de reparto (Rf).

Rf = Xp/Xd Xp= distancia alcanzada por el pigmento Xd= distancia alcanzada por el disolvente

Mtodo 1. Extraccin: en el papel de celulosa se dibujan 2 lneas con lpiz. Una a 2 cm de uno de los extremos y otra a 1 cm del otro extremo. cortar una hoja de diente de len en tiras estrechas. sobre la lnea situada a 2 cm del papel de celulosa, colocar un trozo de hoja y machacarla sobre una superficie plana con las pinzas. Retirar los restos de

hoja y repetir el proceso con todoas las tiras, hasta tener una mancha oscura de pigmentos en el papel. 2. Separacin: Tomar un tubo de ensayo seco de calibre grueso y aadir 3 mL de disolvente. Tomar la tira de papel con la muestra de pigmentos y colgarla del tapn de orcho por el extremo opuesto a la muestra (por encima de la marca de 1 cm). Introducir la tira de papel en el tubo de manera que no toque las paredes y que el disolvente moje el extremo de la tira, pero sin llegar a tocar la muestra. Esperar a que el disolvente ascienda por capilaridad hasta aproximadamente la marca superior del papel. Sacar la tira del tubo, dejar secar y medir el Rf de cada mancha de pigmento que aparezca.

Cuestiones 1. A qu pigmento corresponde cada mancha y cules son sus Rf? 2. Qu factores pueden afectar al Rf?

3. Cuantificacin de clorofila a

Los pigmentos fotosintticos tienen capacidad de absorber distintas longitudes de onda dentro del espectro de luz blanca. Cada pigmento tendr un mximo de absorbancia caracterstico en una determinada. Midiendo en una mezcla la DO a la correspondiente a un pigmento determinado, se podr calcular la cantidad del mismo en dicha mezcla.

Prctica

La clorofila a presenta un mximo de absorbancia a 665 nm. Utilizando tcnicas espectrofotomtricas, se cuantificar la cantidad de clorofila a presente en el extracto de pigmentos de hoja de espinca en etanol obtenido en la primera parte de la prctica. Para ello, se aplicar la frmula de Marker.

[clorofila a]g.mL-1 = D.O.665 nm x 13,14

Mtodo 1. Tomar 0.3 mL del extracto etanlico de pigmentos y aadir 2.7 mL de etanol 2. Medir la DO a 665 nm utilizando etanol como blanco

Cuestiones 1. Calcular la concentracin de clorofila a en el extracto inicial de la hoja de espinaca. 2. Cuntos mg de clorofila a se han extrado de la hoja de espinaca? 3. Se han extrado todos los pigmentos? 4. Qu es 13,14 en la frmula de Marker? 5. Interfieren el resto de pigmentos en la determinacin de clorofila a?

4. Medida del desprendimiento de oxgeno fotosinttico

Durante la fase fotosinttica de fotoabsorcin (mal llamada etapa lumnica), ocurre un desprendimiento de O2 gas procedente de la fotolisis del agua en el fotosistema II. La determinacin de este oxgeno liberado es una medida del funcionamiento del aparato fotosinttico, que se puede relacionar con una mayor o menor actividad fotosinttica.

Prctica Las cianobacterias o microalgas verde-azuladas son microorganismos de organizacin procariota que realizan fotosntesis oxignica muy similar a la de las plantas. En la mesa hay un cultivo lquido de la cianobacteria Anabaena PCC 7120. Al iluminar el cultivo, Anabaena producir oxgeno procedente de la fotolisis del agua. Este oxgeno se disolver en agua. Con la ayuda de un electrodo especfico, se detectar el aumento de oxgeno disuelto en el medio de cultivo, lo que dar una medida de la actividad fotosinttica. Mtodo 1. Introducir el electrodo del oxmetro en el cultivo de Anabaena PCC 7120, de forma que est sumergido en el medio lquido pero no toque el fondo del matraz.

2. Sellar la boca del matraz con papel Parafilm, para que no escape el oxgeno. 3. Poner en agitacin el cultivo con el electrodo. 4. Anotar la medida del oxmetro (mg O2 L-1) cada 30 sg. y durante 3 min. Cuestiones 1. Calcular la velocidad de desprendimiento de oxgeno del cultivo de Anabaena (mg O2. L-1 h)