ATLAS de HISTOLOG IA VEGETAL y ANIMAL

TECNICAS HISTOLOGICAS 3. CORTE

Pilar Molist Manuel A. Pombal Manuel Meg as Depto. de Biolog Funcional y Ciencias de la Salud a Facultad de Biolog a Universidad de Vigo
(Versin: Noviembre 2011) o

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Tcnicas histolgicas e o

Denominamos proceso histolgico a una serie de mtodos y tcnicas o e e utilizados para poder estudiar las caracter sticas morfolgicas y moleculares o de los tejidos. Hay diversos caminos para estudiar los tejidos, es decir, series de tcnicas que se utilizarn dependiendo de qu caracter e a e stica deseemos observar. En el siguiente esquema se muestran los mtodos y e tcnicas comnmente empleados para el procesamiento de los tejidos. Sin e u embargo, hay que tener en cuenta que existen muchas variantes a estos aminos su eleccin depender del resultado nal que queramos obtener. c o a
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Figura 1: Esquema del proceso histolgico dicotilednea. o o El proceso histolgico comienza con la obtencin del tejido objeto de o o 2

estudio. En el caso de los tejidos vegetales se toman muestras de los distintos rganos que componen el cuerpo de la planta, mientras que para o los tejidos animales podemos optar por dos opciones: coger una porcin de o dicho tejido o procesar una parte, rgano o parte corporal, o el animal o completo. En cualquier caso las muestras son habitualmente jadas con unos soluciones l quidas que contienen unas sustancias denominadas jadores, las cuales mantienen las estructuras celulares y moleculares en sus posiciones iniciales durante el procesamiento posterior. Tambin e podemos jar las molculas de los tejidos por congelacin rpida. Fijar un e o a tejido es como si hicisemos una fotograf del tejido que se e a mantendr hasta su observacin. Sin embargo, el uso de jadores o medios a o de inclusin afectan a veces las caracter o sticas tisulares que queremos observar y por tanto tenemos que recurrir a la congelacin para endurecer o el tejido para despus poder obtener secciones del mismo. e Normalmente, tras la jacin se procede a incluir el tejido para o posteriormente obtener secciones. Cuanto ms delgada queramos que sea a nuestra seccin ms tenemos que endurecer nuestra muestra. Esto se o a consigue embebiendo el tejido con sustancias l quidas que posteriormente polimerizarn (resinas) o se volvern consistentes (ceras). Tambin se a a e puede conseguir el mismo efecto mediante congelacin rpida. Cortes ms o a a gruesos de 40 m se pueden cortar sin necesidad de inclusin usando el o vibratomo. Los medios de inclusin son normalmente no hidrosolubles por o lo que tenemos que sustituir el agua de los tejidos por solventes orgnicos a liposolubles y posteriormente aadir el medio de inclusin. n o Tras la inclusin o la congelacin se procede a cortar los tejidos. Existen o o diferentes aparatos de corte que permiten conseguir secciones ultranas (del orden de nanometros), seminas (de 0.5 a 2 m), nas (entre unas 3 y 10 m) y gruesos (mayores a 10 m). Estas secciones hay que procesarlas para poder observarlas, aunque ciertos tipos de microscop por ejemplo a, con contraste de fase, permiten observar tejidos sin teir. Normalmente las n secciones se tien con colorantes que son hidrosolubles, por lo que hay que n eliminar el medio de inclusin para que los colorantes pueden unirse al o tejido. Las secciones, secciones ultranas, que se observan con el microscopio electrnico se pueden contrastar con metales pesados, opacos a o los electrones, sin eliminar la resina. Los tejidos procesados se observan con los microscopios. Existen dos tipos bsicos de microscopios: electrnico y ptico. Los primeros permiten a o o un gran poder de resolucin, pudindose observar caracter o e sticas ultraestructurales, mientras que los segundos, con menor poder de resolucin, ofrecen una gran versatilidad en cuanto a modos de observar los o 3

tejidos : uorescencia, contraste de fase, polarizacin o contraste de o interferencia diferencial. Como dijimos al comienzo existen mltiples variaciones sobre este u esquema general. Por ejemplo, se pueden observar tejidos con el microscopio electrnico de barrido sin necesidad de incluir ni cortar, pero o slo observaremos supercies. En las siguientes pginas veremos con cierto o a detalle algunas de las tcnicas ms empleadas para la observacin de los e a o tejidos.

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CORTE.

Las cater sticas tisulares y celulares microscpicas internas se observan o con microscopios pticos o electrnicos de transmisin (excepto si o o o queremos ver supercies, para lo que usamos el microscopio electrnico de o barrido). Con estos aparatos slo se pueden observar grosores muy o pequeos de tejido por problemas de difusin y penetracin de la luz en el n o o caso de los microscopios pticos y de penetracin de los electrones en el o o caso del microscopio electrnico de transmisin. Por tanto tenemos que o o hacer secciones de los tejidos que queremos estudiar, que pueden ir desde un grosor de unos cuantos nanometros hasta centenares de micras. Algunos tejidos como los vegetales, por sus caracter sticas celulares, permiten su observacin en secciones de cientos de micras. Como hemos mencionado en o los cap tulos anteriores, podemos decir que cuanto ms delgada queramos a hacer una seccin de tejido ms endurecido ha de estar dicho tejido. La o a dureza de los tejidos depende de sus caracter sticas (por ejemplo, las paredes celulares hacen a los vegetales tejidos duros), de la jacin que o hayamos realizado y sobre todo del material en que hayamos incluido dicho tejido. Una manera ms directa de endurecer el tejido es mediante a congelacin. o Los aparatos mecnicos para hacer secciones de un grosor de a micrmetros se denominan microtomos y existen diferentes tipos segn el o u grosor que queramos conseguir en nuestras secciones, el medio de inclusin o en el que se encuentre el tejido o si se ha endurecido por congelacin o por o inclusin. Los microtomos ms usados son: o a Microtomo para parana: Se utiliza principalmente para material incluido en parana y se obtienen secciones de 5 a 20 mum de grosor, para observar con el microscopio ptico. o Vibratomo: Corta material no incluido, aunque s jado o duro, en secciones de 30 a centenares de mum de grosor, para observar con el microscopio ptico. o Microtomo de congelacin: Con l se consiguen secciones de 30 a o e unas 100 mum de material congelado para su observacin con el o microscopio ptico. o Criostato: Consigue secciones a partir de material congelado y se obtienen grosores de 10 a 40 mum, para observar con el microscopio ptico. o Ultramicrotomo: Con l se corta material incluido en resinas y se e obtienen secciones del orden de nanometros de grosor, para observar con el microscopio electrnico de transmisin. o o Ultracriotomo: Su uso no est muy extendido pero se suele emplear a 5

cuando se necesitan secciones del orden de nanometro de material que no se debe incluir, para observar con el microscopio electrnico de transmisin. o o Los aparatos de corte ms usados tradicionalmente para estudiar las a caracter sticas generales de los tejidos y de las clulas son el microtomo e para material incluido en parana para observaciones con el microscopio ptico y el ultramicrotomo para observaciones con el microscopio o electrnico de transmisin. El criostato se usa tambin frecuentemente en o o e microscop ptica por el ahorro de tiempo que supone ya que no necesita a o incluir el tejido, incluso se puede cortar material no jado.

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MICROTOMOS de PARAFINA.

Los microtomos para cortar material incluido en parana son probablemente los ms usados en los laboratorios de histolog Todos a a. poseen varias partes comunes: una cuchilla, un portabloques y un sistema mecnico que permite acercar el bloque de parana a la cuchilla una a distancia que se corresponde con el grosor de la seccin que pretendemos o obtener y realizar el corte. Hay dos tipos de microtomo para parana: el de rotacin y el de o deslizamiento. El microtomo de rotacin provoca el corte gracias a la o transformacin de un movimiento de rotacin en otro de ascenso y o o descenso del portamuestras. En el movimiento de bajada sobre la cuchilla se produce un acercamiento del portamuestras hacia la cuchilla segn el u espacio seleccinado. En el puertamuestras existe un sistema que permite orientar la supercie de corte de la muestra respecto a la cuchilla. En estos microtomos la cuchilla se mantiene ja durante el proceso de corte, pero puede regularse el ngulo de ataque a la muestra. Con el microtomo de a deslizamiento se obtienen cortes mediante un movimiento de deslizamiento del bloque sobre la cuchilla, o viceversa. En estos microtomos el movimiento lo proporciona directamente la mano y es de ida y vuelta, siendo en la vuelta cuando se eleva la posicin del bloque, o de la cuchilla, o una distancia que nos dar el grosor del corte. a

Figura 2: Microtomo para parana con mecanismo de rotacin. o Tanto el microtomo de rotacin como el de deslizamiento tienen o ventajas e inconvenientes. La principal ventaja del de rotacin es su o presicin, la posibilidad de obtener secciones seriadas con facilidad y la o automatizacin del proceso de corte. Los microtomos de deslizamiento son o ms sencillos mecnicamente y su disposicin permite cortar bloques ms a a o a 7

grandes o bloques de celoidina, aunque estn cayendo en deshuso. a

Figura 3: Microtomo para parana con mecanismo de deslizamiento. Hay que llevar a cabo una serie de procesos sobre el bloque de parana antes de hacer el primer corte util a nuestra muestra. En primer lugar hay que retallar el bloque hasta hacer una pirmide truncada. Antes de retallar a hay que considerar cual de las caras de esta pirmide ser el frente de a a ataque, es decir, cual ser la que primero se ponga en contacto con la a cuchilla. Esta cara deber ser ms ancha que la opuesta, y ambas han de a a ser paralelas. Con todo ello se consigue una buena orientacin de nuestra o muestra en las secciones, que cada nuevo corte arrastre sin problemas al previamente cortado y que se puedan obtener tiras rectas de cortes. Una vez retallada la pirmide nuestra muestra queda dentro de ella pero no a est en contacto directo con la cara superior o de corte, por lo que es a necesario un proceso de desbastado, es decir, la eliminacin del espesor de o parana que hay entre la supercie del bloque y nuestra muestra. Otro aspecto que hemos de tener en cuentan antes de empezar a cortar es la orientacin de la cuchilla respeto a la supercie de corte de la o pirmide. Lo normal es orientar la cuchilla con un ngulo de uno 10 a a respecto a la supercie de corte, aunque se puede modicar segn nuestras u necesidades. Una vez comenzado el corte de nuestra muestra se obtienen tiras de secciones unidas por las caras paralelas a la cuchilla. Estas tiras se suelen manipular con pinceles o lancetas y, antes de su jacin denitiva en la o supercie de un portaobjetos, han de estirarse para que nuestro tejido quede perfectamente extendido. Aprovechando la hidrofocidad de la parana, las secciones se colocan sobre agua calentada a unos 35 C a 40 C y el calor las hace extenderse sin llegar a su punto de fusin, que o C. El estiramiento se puede realizar en ba os de est en torno a los 60 a n

Figura 4: Preparacin del bloque de parana antes de iniciar la obtencin de secciones o o

utiles.

agua con regulacin trmica o sobre los propios portaobjetos cubiertos de o e agua y colocados sobre una plancha trmica regulable. e La supercie del portaobjetos donde se colocan las tiras de cortes ha de estar previamente tratada para que nuestro tejido quede adherido durante el procesamiento posterior. Para ello los portaobjetos se recubren con soluciones de gelatina, albmina, u otras sustancias y se dejan secar, de u manera que hacen de adhesivo entre el cristal y nuestro tejido. Una vez que el agua se ha evaporado y estn extendidas las tiras de a cortes de parana sobre el portaobjetos, se procede a un secado exahustivo en una estufa a una temperatura de entre 35 C y 40 C durante toda la noche. Una vez secos, los portaobjetos con las secciones estn listos para el a procesamiento posterior.

Figura 5: Una vez se ha retallado y desbastado el bloque se obtienen las secciones en

tiras que sern colocadas sobre un portaobjetos cubierto con agua calentada a unos 40 a

C. El portaobjetos ha sido tratado previamente son soluciones adhesivas. El calor y la

hidrofobicidad de la parana hace que las secciones se estiren sobre la supercie del agua y una vez evaporada queden adheridas al portaobjetos.

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VIBRATOMO.

Puede haber varias razones para evitar la inclusin de un tejido del que o posteriormente obtener secciones. Durante los procesos de inclusin, como o las inclusiones en parana o en resinas tipo epoxy, se ha de someter a las muestras a deshidratacin. Esto ocasiona a veces dao en algunas o n molculas o regiones moleculares que son las que queremos detectar e posteriormente con tcnicas como la inmunocitoqu e mica. Adems, para a observar algunas caracter sticas tisulares o celulares se requieren secciones gruesas del orden de 50 mum, a veces de 100 o 200 mum. Por ejemplo, para estudiar la organizacin espacial de determinadas clulas como las o e neuronas es recomendable hacer cortes de un grosor superior a las 50 mum y emplear inmunocitoqu mica o histoqu mica para ponerlas de maniesto. La obtencin de secciones gruesas sin necesidad de inclusin se pueden o o conseguir de dos manera diferentes: mediante congelacin de la muestra y o corte en un microtomo de congelacin o mediante el uso del vibratomo. o

Figura 6: Vibratomo. La cubeta, de color negro, ha de estar llena de tampn de trabajo o

durante el proceso de corte de manera que la cuchilla y la muestra, de color rojo, y las secciones que se obtienen estn sumergidos. a

El vibratomo es un aparato con el que se obtienen secciones de un grosor que puede oscilar entre las 40-50 mum hasta varios centenares de mum partiendo de una muestra animal endurecida slo mediante jacin. o o El mecanismo de corte consiste de una plataforma sobre la que se sita la u muestra, que puede regularse en altura y nos permite seleccionar el grosor del corte, y de una cuchilla de borde muy alado que se deplaza horizontalmente sobre la muestra realizando el corte. La caracter stica del vibratomo es que la cuchilla, adems de avanzar sobre la muestra, posee un a movimiento de vibracin lateral a modo de sierra que facilita el corte y o 11

evita arrastrar el tejido. La muestra se encuentra jada, normalmente mediante pegamento de contacto, directamente a un bloque portamuestras que se coloca sobre la plataforma elevadora.

Figura 7: Vista lateral de la cubeta de un vibratomo. No todas las muestras son apropiadas para ser cortadas en un vibratomo. As aquellas que sean muy blandas o que posean porciones , demasiado duras o elsticas son normalmente arrastradas por la cuchilla, a a pesar de que disminuyamos la velocidad de avance y aumentemos la oscilacin de la cuchilla. Es decir, la muestra ha de tener una cierta o consistencia y no poseer elementos distorsionadores del corte.

Figura 8: Pegado de la muestra al bloque portamuestras. Otra caracter stica del vibratomo es que todo el proceso de corte se realiza bajo una solucin acuosa que normalmente es una solucin o o tamponada o una solucin salina. Para ello tanto la muestra como el borde o de corte de la cuchilla han de estar sumergidos y los cortes que se obtienen 12

se denominan cortes en otacin, es decir, no sujetos a ningn soporte. o u Estos cortes se pueden procesar de esta manera, otando, o adherirse a un portaobjetos y procesarlos despus. Sin embargo, el proceso de secado e necesario para la adhesin al portaobjetos suele conllevar alteraciones de la o calidad del tejido. As los cortes se suelen procesar durante toda la tcnica , e en otacin y posteriormente se montan sobre portaobjetos para su o observacin con el microscopio ptico. o o

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MICROTOMOS de CONGELACION.

La congelacin de los tejidos es una manera rpida de endurecerlos sin o a necesidad de inclusin, por lo que la preservacin molecular es mxima. o o a Muy importante si el procesamiento posterior requiere el reconocimiento molecular. Igual preservacin se consigue con los cortes de vibratomo, pero o las muestras congeladas pueden cortarse en secciones ms nas, del orden a de varias mum, cosa muy dif con el vibratomo. Otra ventaja de la cil obtencin de secciones mediante congelacin es que la calidad de las o o secciones no depende del tipo de tejido (excepto tejidos mineralizados como el hueso o aquellos excesivamente cornicados). Por ultimo, es posiblemente la manera ms rpida de obtener secciones puesto que es a a posible congelar la muestra sin necesidad de jacin y cortarla de o inmediato, como las biopsias. Pero para preservar correctamente la estructura del tejido ha de ser una congelacin muy rpida, normalmente o a en isopentano enfriado con nitrgeno l o quido, lo que evita la formacin de o cristales de hielo que deterioran las estructuras celulares.

Figura 9: Microtomo de congelacin. El tubo negro de la derecha es el encargado de o

enfriar el portabloques a temperaturas inferiores a -20 C, lo cual congela a su vez a la muestra (color rojo). Las secciones se recogen de la cuchilla con un pincel y se colocan en tampn de trabajo. o

En el caso de que no se requiera un corte rpido las muestras se jan y a posteriormente se incuban en una solucin anticogelante que contiene o sacarosa y glicerol. Con ello se evita que durante la congelacin se formen o cristales de hielo grandes que puedan daar las estructuras celulares. Como n dijimos anteriormente, se puede congelar de manera muy rpida con a nitrgeno l o quido. Dicha congelacin permite preservar incluso la o

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ultraestructura celular y observarla al microscopio electrnico, siempre con o el uso previo de anticongelantes. Pero normalmente se suele realizar la congelacin de la muestra a temperaturas superiores que dependen del o aparato empleado para realizar los cortes, lo cual hace necesario el uso de anticongelantes.

Figura 10: Criostato. El compartimento de color azul es la cmara refrigerada a la a

temperatura seleccionada. En esta cmara se encuentra la muestra, la cuchilla y es donde a se recogen las secciones.

Los dos aparatos ms usados para realizar cortes por congelacin son el a o microtomo de congelacin y el criostato. El microtomo de congelacin o o realiza cortes de decenas de mum de grosor y consiste en una plataforma que se enfr a bajas temperaturas sobre la que se coloca la muestra. Tras a cada corte la plataforma se eleva un espacio correspondiente al grosor de corte seleccionado. En los microtomos de congelacin antiguos se produc o a la congelacin mediante gas carbnico que hab que suministrar o o a regularmente. Actualmente se produce la congelacin (de -30 a menos -40 o C) de la plataforma mediante tubos que parten de un sistema de refrigeracin externo al propio dispositivo de corte. Adems, existe la o a posibilidad de congelar tambin la cuchilla si se desea. En los apartos e actuales la muestra se congela por contacto directo con la plataforma y su temperatura es constante durante todo el tiempo de corte. Las secciones que se obtienen, de decenas a cientos de mum, se recogen con un pincel, se aaden a un recipiente con tampn de trabajo y se trabaja con ellas en n o 15

Figura 11: Criostato. El mecanismo de rotacin y corte del criostato se encuentra dentro o
de una cmara refrigerada. a

otacin, igual que en el caso del vibratomo. o El criostato se utiliza para obtener secciones por congelacin de 10 a 30 o mum, aproximadamente. En este aparato todo el sistema de corte se encuentra encerrado en una cmara refrigerada cuya temperatura se puede a regular, normalmente entre -20 y -30 C. La congelacin se suele hacer en o una plataforma dentro de la propia cmara refrigerada que se encuentra a a una temperatura inferior, en torno a -50 C. Tambin se puede congelar el e tejido externamente con la rapidez que deseemos, por ejemplo con nitrgeno l o quido, pero es conveniente colocar la muestra en la cmara del a criostato hasta que consiga igualar su temperatura con la de sta para e obtener secciones homogneas. Antes de la congelacin, la muestra se e o encastra en un medio que es l quido a temperatura ambiente y slido a la o de corte. Por tanto, tenemos nuestra muestra en un bloque slido, o encastrado pero no incluido. Esto permite manipular la muestra y adherirla a un soporte portamuestras, el cual se jar a un eje que avanza a sobre la cuchilla. La preparacin del bloque y el mecanismo de corte es o similar al que se describi para el microtomo de rotacin para parana. o o Las secciones que se van obteniendo se adhieren por contacto a portaobjetos con supercies adhesivas. Las secciones se descongelan rpidamente en este proceso de pegado puesto que los portaobjetos estn a a a temperatura ambiente y una vez secas pueden procesarse para las tcnicas e que deseemos.

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Figura 12: Criostato. Proceso mediante el que se pegan las secciones a un portaobjetos.

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ULTRAMICROTOMO.

Para la observacin con detalle de la ultraestructura celular es necesario o realizar secciones muy delgadas denominadas ultranas, del orden de nanometros, y observarlas con el microscopio electrnico de transmisin. o o Para ello se incluye nuestra muestra en resina, generalmente de tipo epoxy, que una vez polimerzada resulta en un bloque de gran dureza. La obtencin de secciones ultranas se lleva a cabo con un aparato o denominado ultramicrotomo. Otra manera menos habitual de obtener secciones ultranas es mediante el ultracriotomo, para lo cual la muestra se congela y se corta en una cmara refrigerada a muy bajas temperaturas. a Este ultimo es un mecanismo similar al visto para el criostato. Es un aparato que slo se usa cuando queremos detectar con microscop o a electrnica molculas que son daadas durante el proceso de inclusin. o e n o

Figura 13: Ultramicrotomo El ultramicrotomo tiene un diseo de corte similar al microtomo de n parana de rotacin, pero mucho ms preciso y sosticado. Quiz el o a a sistema ms delicado sea el que hace avanzar el bloque sobre la cuchilla a pues debe hacerlo a intervalos de varios nanometros. Actualmente este sistema de avance es mecnico pero en los ultramicrotomos ms antiguos a a era por calor, que produc dilatacin del eje sobre el que se sujetaba la a o muestra. Tambin tiene un sistema completo de orientacin de la muestra e o sobre el borde de la cuchilla para que el plano de corte se pueda orientar perfectamente a la supercie de nuestra muestra. Al realizar cortes muy delgados cualquier vibracin o cambio de temperatura afecta la o homogeneidad del grosor del corte, por tanto el ultramicrotomo debe 18

situarse en una habitacin donde no haya vibraciones y mantenerla a o temperatura constante para evitar dilataciones del brazo que porta la muestra, dentro de lo posible. Adems, estos aparatos se colocan sobre a mesas especiales para disminuir las vibraciones. Todos los ultramicrotomos actuales tienen un panel de control externo al aparato desde donde se controla electrnicamente el proceso de corte: inicio de corte, grosor de la o seccin, velocidad de corte, ventana de corte, iluminacin de la muestra, o o etctera. e Antes de realizar el primer corte ultrano de una muestra, al igual que ocurr con los cortes de parana, es necesario retallar y desbastar el a bloque para crear una pirmide truncada. Aunque todo este proceso se a puede hacer con una cuchilla se suele utilizar un aparato denominado piramitomo que lima y crea las caras de la pirmide con un disposivo a a modo de torno, adems de producir el desbastado para obtener la a supercie de corte. Hay que tener en cuenta que este proceso ha de ser preciso porque la supercie de corte debe ser muy pequea, en torno a n unos 0,5 mm2. Los lados de la supercie de corte deben ser similares a los descritos para el corte en inclusiones de parana, dos lados han de ser paralelos y uno ms grande que el otro. Con esto nos aseguramos que una a nueva seccin empujar a la previa del borde de la cuchilla y que a a conseguiremos tiras rectas de secciones. Antes de hacer las secciones ultranas se suele hacer una seccin semina, de 1 o 2 mum para tener o una imagen de la muestra observable al microscopio ptico. o Las cuchillas empleadas para hacer secciones ultranas son espec cas para este tipo de aparatos puesto que han de tener unos los muy agudos. Las ms comnmente usadas son de vidrio especial y se otienen mediante a u unos aparatos que mediante ralladuras con puntas de diamante y golpes secos sobre barras de vidrio son capaces de producir dichas cuchillas. Sin embargo, la mejor calidad de corte se consigue con cuchillas con lo de diamante, pero son mucha ms caras. Aunque los ultramicrotomos actuales a tienen mecanismos de corte precisos, durante el proceso de corte se pueden obtener secciones de distinto grosor. El grosor de una seccin ultrana se o conoce por el color que produce el reejo de la luz sobre su supercie. Este color puede ser gris (menos de 60 nm), plata (60 a 90 nm), oro plido (90 a a 120 nm), oro intenso (120 a 150 nm), prpura (150 a 190 nm), etctera. u e Las secciones ultranas recin obtenidos quedan otando sobre una e balsa de agua que posee la propia cuchilla y no se recojen sobre portaobjetos sino directamente sobre soportes de n quel o cobre denominados rejillas. Son discos circulares con un enrejado de hilos que dejan cavidades, las cuales son de distino tamao segn el tipo de rejilla, n u 19

Figura 14: Proceso por el que se obtiene una cuchilla para hacer cortes en el ultramicrotomo.

Figura 15: Corte y recogida de secciones en una rejilla. normalmente desde 100 a varios cientos de mum cuadradas. Estas rejillas tienen la ventaja de que permiten una gran nitidez de las imgenes del a tejido que ofrece el microscopio electrnico puesto que los electrones slo o o atraviesan la seccin antes de incidir sobre la pantalla de visualizacin. Sin o o embargo, presentan el problema de que la porcin de seccin que caiga o o

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sobre el hilo de la rejilla quedar oculto. Por ello existen las rejillasde a ojal, que tienen una sola cavidad y sucientemente grande como para que quepa un corte entero. Obviamente es necesario suministrar un soporte para que la seccin no se cuele por la cavidad que es normalmente una o membrana muy na hecha de una sustancia denominada formvar, la cual deja pasar los electrones y sostiene a las secciones.

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