LAPORAN PRAKTIKUM

ISOLASI -1,3-GLUKANASE DARI BACILLUS LICHEMIFORMIS STRAIN HSA3-1a

NAMA NIM KELOMPOK

: RIFAATUL MAHMUDAH M. : H 311 08 272 : II (DUA)

HARI/TGL PERC. : SENIN/29 NOVEMBER 2010 ASISTEN : NURLAIDA

LABORATORIUM BIOKIMIA JURUSAN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS HASANUDDIN MAKASSAR 2010

LEMBAR PENGESAHAN

Makassar, 10 Desember 2010 Asisten Praktikan

(NURLAIDA)

(RIFAATUL MAHMUDAH M.)

BAB I PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang Enzim merupakan biokatalisator atau katalisator organik yang dihasilkan oleh sel. Enzim mengatur kecepatan dan kekhususan ribuan reaksi kimia yang berlangsung di dalam sel. Walaupun enzim dibuat di dalam sel, tetapi untuk bertindak sebagai katalis tidak harus berada di dalam sel. Reaksi yang dikendalikan oleh enzim antara lain ialah respirasi, pertumbuhan dan perkembangan, kontraksi otot, fotosintesis, fiksasi, nitrogen, dan pencernaan. Teknologi produksi enzim perlu menggunakan mahluk hidup (agen biologi mulai dari organisme tingkat rendah seperti bakteri, jamur, fungi, dan ragi hingga ke tingkat tinggi seperti tanaman, binatang, dan manusia) sebagai pabrik pemroses yang layak secara ekonomi. Enzim-enzim yang secara ekonomi telah masuk pasar kebanyakan berasal dari golongan enzim-enzim hidrolitik, yang masih diproduksi secara konvensional dan belum optimal atau diimport dari negara luar. Enzim-enzim hidrolitik yang banyak digunakan adalah golongan karbohidrase (seperti -amilase, -amilase, glukoamilase, -glukosidase,

glukosidase, pullulanase, glukose isomerase, invertase, laktase, selulase, sellobiase, -glukanase, xilanase, hemiselulase, lakase, dan pektinase), golongan protease (seperti protease asam, protease netral, dan protease basa), dan golongan lipase. Dalam percobaan ini berusaha untuk mengisolasi jenis enzim -1,3glukanase dari mikroba penghasil enzim ekstraseluler yaitu isolate dari Bacillus

Lichemisformis. Adapun produksi enzim dari mikroba ini dilakukan karena memiliki keunggulan dari pada isolasi melalui produksi non enzim yaitu produksi enzim dapat ditingkatkan dalam skala besar dalam ruang yang relatif terbatas, waktu produksi singkat, tempat produksi di mana saja, mudah dikontrol, dan lainlain. Atas dasar inilah maka dilakukan percobaan ini. 1.2. Maksud dan Tujuan Percobaan 1.2.1. Maksud Percobaan Untuk mengetahui dan mempelajari teknik isolasi enzim dari mikroba. 1.2.2. Tujuan Percobaan Untuk mengetahui teknik isolasi enzim Bacillus Lichemiformis Strain HSA3-1a. 1.3. Prinsip Percobaan Mengisolasi enzim -1,3-Glukanase dari mikroba Bacillus Lichemiformis Strain HSA3-1a dalam suatu medium padat dengan cara menginokulasi pada agar cawan dengan jarum ose melalui metode penyebaran kultur mikroba di atas agar pada kondisi optimum yaitu suhu 55 oC dan pH 7. -1,3-Glukanase dari mikroba

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

Enzim adalah katalis. Enzim menurunkan energi pengaktifan suatu proses dengan jalan menempatkan seluruh gugus reaktif dalam orientasi yang tepat serta membantu berlangsungnya reaksi bersama gugus-gugus asam dan basa. Pada beberapa kasus, enzim menstabilkan (berikatan hingga tercapai keefektifan) keadaan transisi suatu reaksi (Bresnik, 2003). Fungsi suatu enzim adalah sebagai katalis untuk proses biokimia yang terjadi dalam sel maupun luar sel. Suatu enzim dapat mempercepat reaksi 108 sampai 1011 kali lebih cepat apabila reaksi tersebut dilakukan tanpa katalis. Jadi enzim dapat berfungsi sebagai katalis yang sangat efisien, di samping itu mempunyai derajat kekhasan yang tinggi. Seperti juga katalis lainnya, maka enzim dapat menurunkan energi aktivasi suatu reaksi kimia. Reaksi kimia ada yang membutuhkan enenrgi (reaksi endergonik) dan ada pula yang menghasilkan energi atau mengeluarkan energi (eksergonik) (Poedjiadi dan Supriyanti, 2006). Mikroba dapat tumbuh lebih baik pada media yang memenuhi persyaratan untuk pertumbuhannya. Beberapa persyaratan media pertumbuhan mikroba antara lain kandungan nutrisi dalam media, pH, suhu, dan tidak tercemar (tidak terpolusi) oleh toksin, dan lain-lain (Nurwantoro dan Djarijah, 1997). Enzim -1,3-glukanase dari filtrat kultur Trichoderma harzianum BIO

10671 telah berjaya dimurnikan dengan 80 % aseton, diikuti kromatografi penukaran ion menggunakan Neobar AQ dan pemfokusan kromatografi menggunakan kolum Mono P HR 5/20. Dua -1,3-glukanase berukuran 32 kDa dan 66 kDa telah dimurnikan dan ditunjukkan pada SDS-PAGE. pH aptimum bagi

aktivitas enzim ini ialah pada pH 4,5 dan aktivitas maksimum diserap pada 45C. Manakala aktivitas enzim dihalangi 20 45 % oleh 20mM Zn2+, Ca2+, C02+, Mi+, Cu2+, Mn2+ dan Fe2+. Aktivitas hidrolisis -1,3-glukanase tertinggi didapati pada laminarin disebabkan persamaan ikatan -glikosidik dan diikuti masing-masing

pada pustulan, glukan dan selulosa (Mustafa dkk, 2005). Apabila suatu sel mikroba (misalnya, bakteri) ditumbuhkan pada suatu medium yang memenuhi syarat untuk tumbuh, maka mikroba tersebut akan mengadakan multiplikasi secara aseksual dengan pembelahan sel menjadi dua sel vegetatif yang serupa dan selanjutnya proses tersebut berlangsung terus-menerus selama nutrisi, energi, dan persyaratan lingkungan lain masih memenuhi syarat tumbuh (Nurwantoro dan Djarijah, 1997). Prinsip perhitungan cawan yaitu, jika sel mikroba yang masih hidup ditumbuhkan pada medium agar, maka sel mikroba tersebut akan berkembang biak dan akan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop. Metode hitung cawan merupakan metode atau cara yang paling sensitive untuk menghitung jumlah mikroba karena alasan-alasan berikut (Fardiaz, 1989): 1. Hanya sel yang masih hidup yang dihitung 2. Beberapa jenis mikroba dapat dihitung sekaligus 3. Dapat digunkan untuk isolasi dan identifikasi mikroba Selain keuntungan-keuntungan tersebut, metode hitungan cawan

mempunyai kelemahan-kelemahan sebagai berikut (Fardiaz, 1989): 1. Hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel mikroba yang sebenarnya, karena beberapa sel yang berdekatan mungkin membentuk satu koloni 2. Medium dan kondisi yang berbeda dapat menghasilkan silai yang berbeda

3. Mikroba yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada medium padat dan membentuk koloni yang kompak dan jelas, tidak menyebar 4. Memerlukan persipan dan waktu inkubasi beberapa hari sehingga pertumbuhan koloni dapat dihitung. Untuk metode tuang, inkubasi dilakukan pada suhu dan waktu tertentu sesuai dengan jenis mikroba yang akan dihitung. Medium agar yang digunakan juga disesuaikan dengan jenis mikroba yang akan ditumbuhkan. Selama inkubasi sel-sel yang masih hidup akan tumbuh dan membentuk koloni (Fardiaz, 1989). Faktor-faktor yang mempengaruhi kehidupan dan pertumbuhan

mikroorganisme (Buckle dkk, 1987) adalah: 1. Suplai zat gizi Seperti halnya makhluk lain, mikroorganisme juga membutuhkan suplai makanan yang akan menjadi sumber energi dan menyediakan unsur-unsur kimia dasar untuk pertumbuhan sel. Unsure-unsur dasar tersebut adalah karbon, nitrogen, hidrogen, oksigen, sulfur, fosfor, magnesium, zat besi dan sejumlah kecil logam lainnya. 2. Waktu Waktu antara masing-masing pembelahan sel berbeda-beda tergantung dari spesies dan kondisi lingkungannya. 3. Suhu Suhu adalah salah satu factor lingkungan terpenting yang mempengaruhi kehidupan dan pertumbuhan organisme. Suhu dapat mempengaruhi

mikroorganisme dalam dua cara yang berlawanan.

a. Apabila suhu naik, kecepatan metabolisme naik dan pertumbuhan dipercepat. Sebaliknya apabila suhu turun, kecepatan metabolisme juga turun dan pertumbuhan diperlambat. b. Apabila suhu naik atau turun, tingkat pertumbuhan mungkin terhenti, komponen sel menjadi tidak aktif dan sel-sel dapat mati. 4. Nilai pH Setiap organisme mempunyai kisaran nilai pH di mana pertumbuhan masih memungkinkan dan masing-masing biasanya mempunyai pH optimum. 5. Aktivitas air Semua organisme membutuhkan air untuk kehidupannya. Air berperan dalam reaksi metabolit dalam sel dan merupakan alat pengangkut zat-zat gizi atau bahan limbah ke dalam dan ke luar sel. Semua kegiatan ini membutuhkan air dalam bentuk cair dan apabila air tersebut mengalami kristalisasi dan membentuk es atau terikat secara kimiawi dalam larutan gula atau garam, maka air tersebut tidak dapat digunakan oleh mikroorganisme. Jumlah air yang terdapat dalam bahan pangan atau larutan dikenal sebagai aktivitas air (water activity = aw). air murni mempunyai nilai aw = 1,0. Jenis mikroorganisme yang berbeda membutuhkan jumlah air yang berbeda pula untuk pertumbuhannya. 6. Ketersediaan oksigen Tidak seperti bentuk kehidupan lainnya, mikroorganisme berbeda nyata dalam kebutuhan oksigen guna metabolismenya. Beberapa kelompok dapat dibedakan sebagai: a. Organisme aerobik, di mana tersedianya oksigen dan penggunaannya dibutuhkan untuk pertumbuhan.

b. Organisme anaerobik, tidak dapat tumbuh dengan adanya oksigen dan bahkan oksigen ini dapat meruapakan racun bagi organisme tersebut. c. Organisme anaerobik fakultatif, di mana oksigen akan dipergunakan apabila tersedia, organisme tetap dapat tumbuh dalam keadaan anaerobik. d. Organisme mikroerofilik (microaerophilic organisms), yaitu mikroorganisme yang lebih dapat tumbuh pada kadar oksigen yang lebih rendah daripada kadar oksigen dalam atmosfer. 7. Faktor-faktor kimia Telah diketahui banyak zat kimia yang dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme atau membunuh mikroorganisme yang telah ada. 8. Radiasi Sinar ultraviolet dengan panjang gelombang tertentu dan radiasi ionisasi seperti sinar X dan sinar gamma dapat mudah terserap oleh sel mikroorganisme. Sinar-sinar tersebut dapat mengganggu metabolisme sel dan umumnya dapat cepat mematikan.

DAFTAR PUSTAKA

Buckle, K.A., Edwards, R.A., Fleet, E., dan Wootton, M., 1987, Ilmu Pangan, di terjemahkan oleh Nawangsari Sugiri, UI-Press, Jakarta. Bresnick, S., 2004, Intisari Kimia Organik, diterjemahkan oleh Hadian Kotong, Hipokrates, Jakarta. Fardiaz, S., 1989, Analisis Mikrobiologi Pangan, Departemen Pendidikan dan Kebudayaan Dirjen Perguruan Tinggi Pusat Antar Universitas dan Gizi IPB, Bogor. Mustafa, M., Ramli, S., Ithnin, N., Tohfan, N. F., 2005, Purification and Characterisation of -1,3-glucanase from Trichoderma Harzianum BIO 10671, Jurnal Pertanian J. Trop. Agric. Sci., 28 (1), 23-31, (online) (http://psasir.upm.edu.my/3653/1/Purification_and_Characterisation_of_,B -l,3-giucanase_from.pdf), di akses tanggal 29 November 2010, pukul 07.12 WITA. Nurwantoro dan Djarijah, A.S., 1997, Mikrobiologi Pangan Hewan-Nabati, Kanisus, Yogyakarta. Poedjiadi, A. dan Supriyanti F. M. T., 2006, Dasar-Dasar Biokimia edisi revisi, UI-Press, Jakarta.

BAB III METODE PERCOBAAN

3.1. Bahan Bahan-bahan yang digunakan pada percobaan ini, yaitu bakto agar 1,5 %, yeast ekstrak 0,05 %, NaCl 0,1 %, pepton, 0,01 %, CMC 0,1 %, ammonium sulfat 0,7 %, K2HPO4, MgSO4.7H2O 0,01 %, akuades, alkohol, korek api, aluminium foil, spiritus, sabun dan tissue roll. 3.2. Alat Alat-alat yang digunakan pada percobaan kali ini, yaitu cawan petri, erlenmeyer, ose, spoit 10 mL, batang pengaduk, sendok tanduk, botol semprot, gelas ukur 100 mL, gelas kimia, kaki tiga, kawat kasa, neraca analitik, stirrer bar, magnetik stirrer, autoclave, oven, spektronik 20 D+, kuvet, sentrifus dingin, parafilm dan kertas pH indikator. 3.3. Prosedur Percobaan 3.3.1. Medium Padat Mula-mula ditimbang bakto agar 1,5 gram, yeast ekstrak 0,05 gram, NaCl 0,1 gram, pepton 0,01 gram, dan CMC 0,1 gram dengan menggunakan neraca analitik dan dimasukkan dalam erlenmeyer. Setelah itu, campuran dilarutkan dengan 100 mL akuades. Setelah tercampur, larutan distirrer sampai tercampur sempurna lalu dipanaskan menggunakan spiritus sampai mendidih. Setelah mendidih, larutan dimasukkan dalam autoclave setelah 30 menit, lalu dituang kedalam cawan petri yang sebelumnya telah disterilkan dengan cara dicuci bersih, dibungkus kertas dan dimasukkan kedalam oven. Larutan dituang di dalam enkas

lalu dibungkus parafilm dan didiamkan selama 1 hari. Kemudian dibuat 4 kuadran pada cawan petri. 3.3.2. Peremajaan Mikroba Setelah terbentuk medium padat, digoreskan bakteri Bacillus pada medium tersebut. Mula-mula, ose dicelupkan dalam etanol lalu dibakar menggunakan spiritus sampai membara. Dalam keadaan membara, ose ditempelkan pada medium padat lalu digoreskan pada bakteri kemudian digoreskan kembali pada medium padat dan jangan sampai mengenai bagian yang telah ditempelkan tadi. Lakukan berulang-ulang sampai kuadran keempat. Setelah itu, dibungkus kembali dengan parafilm dan dimasukkan kedalam inkubator pada suhu 50 0C. 3.3.3. Inokulum Pembuatan inokulum dimulai dengan penimbangan yeast ekstrak 0,05 gram, ammonium sulfat 0,7 gram, pepton 0,01 gram, NaCl 0,1 gram, K2HPO4 0,01 gram, MgSO4.7H2O 0,01 gram, dan CMC 0,1 gram dengan menggunakan neraca analitik dan dimasukkan dalam erlenmeyer. Setelah itu dilarutkan dalam 100 mL akuades kemudian distirrer sampai tercampur sempurna. Setelah tercampur, larutan kemudian dimasukkan ke dalam autoclave. Setelah 30 menit, larutan dimasukkan ke dalam enkas dan dicelupkan bakteri sebanyak 3 ose. Bakteri yang telah terbentuk pada medium padat di ambil menggunakan ose yang sebelumnya dicelupkan pada etanol dan dipanaskan dengan spiritus sampai membara. Setelah bakteri digores dengan ose, kemudian dicelupkan pada larutan inokulum. Setelah itu, di shaker selama 1 hari.

3.3.4. Medium Produksi Pembuatan inokulum dimulai dengan penimbangan yeast ekstrak 0,045 gram, ammonium sulfat 0,63 gram, pepton 0,009 gram, NaCl 0,09 gram, K2HPO4 0,009 gram, MgSO4.7H2O 0,009 gram, dan CMC 0,09 gram dengan menggunakan neraca analitik dan dimasukkan dalam erlenmeyer. Setelah itu dilarutkan dalam 90 mL akuades kemudian distirrer sampai tercampur sempurna. Setelah tercampur, larutan kemudian dimasukkan ke dalam autoclave. Setelah 30 menit, larutan dimasukkan ke dalam enkas dan di tambahkan 10 mL larutan inokulum yang sebelumnya telah distirrer selama 1 hari. Setelah tercampur, di ambil 30 mL dari medium produksi dan dimasukkan kedalam botol, lalu dimasukkan kedalam lemari es, kemudian 70 mL dari larutan tersebut di shaker selama 72 jam. 3.3.5. Pengukuran Uji Aktivitas -1,3-Glukanase Dua larutan yang memiliki perlakuan berbeda, diukur pHnya menggunakan kertas pH, kemudian di ukur absorbannya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 660 nm dan diukur dengan menggunakan sentifus dingin (4 0C) selama 30 menit. Setelah itu, di amati perubahan yang terjadi.

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil Pengamatan Tabel No 1 2 Waktu Fermentasi (jam) 0 72 pH 7 8 Optical Density (660 nm) 0,042 0,756

4.2. Pembahasan Enzim -1,3-glukanase secara luas ditemukan pada sebagian besar bakteri, jamur, dan tanaman tingkat tinggi. Berdasarkan pada aktivitas hidrolitik dari -1,3-glukanase dan hubungannya dengan infeksi pathogen, -1,3-glukanase dinyatakan sebagai komponen penting dalam mekanisme pertahanan melawan pathogen. Percobaan ini difokuskan pada isolasi enzim dari mikroba, dalam hal ini digunakan isolate Bacillus lichemiformis sebagai penghasil enzim -1,3glukanase. Medium yang digunakan pada percobaan ini adalah medium padat karena bakteri yang akan diremajakan dan diamati berupa pertumbuhan koloni. Medium padat dibuat dengan komposisi yang sesuai dengan semua kebituhan unsur hara yang diperlukan untuk pertumbuhan dan perkembangbikan mikroba yang akan diisolasi. Adapun komponen yang digunakan antara lain bakto agar sebagai pemadat substrat dan komponen media lain, ammonium sulfat sebagai komponen penyedian unsur nitrogen, yeast ekstrak sebagai sumber energi atau unsur karbon,

NaCl sebagai sumber mineral Na yang dibutuhkan untuk pertumbuhan, K 2HPO4 sebagai garam yang mempertahankan pH media dalam keadaan netral, MgSO4.7H2O sebagai sumber mineral dalam media. Keberadaan suatu substrat dapat memacu suatu mikroorganisme untuk mensekresi metabolit sekundernya. Media sebelum digunakan disterilkan dalam autoclave untuk mencegah medium tidak ditumbuhi oleh mikroba lain yang tidak diharapkan. Sebelum media dituangkan ke dalam cawan petri bagian mulut dari erlenmeyer dipanaskan dalam nyala api lampu spritus dan pengerjaan dilakukan dalam keadaan aseptik sehingga kontaminasi dan mikroba yang tidak diharapkan dapat dihindari. Pada tahap peremajaan ini dilakukan dengan mengisolasi kembali biakan murni isolate Bacillus Lichemiformis. Isolasi dilakukan dengan jarum ose. Jarum ose yang akan digunakan sebelumnya dicelupkan dalam etanol 70 % dan dipanaskan dalam nyala api hingga membara, supaya memastikan jarum ose bebas dari mikroba atau dalam keadaan steril sehingga siap digunkan untuk memindahkan biakan mikroba. Setelah dipanaskan ose diletakkan dalam medium, sebagai tanda awal penggoresan. Bagian penggoresan pada cawan Petri dibagai menjadi dua bagian, sehingga area penggoresan lebih luas dan mencegah bila bagian tertentu tidak tumbuh. Jarum ose yang steril digunakan untuk mengambil koloni mikroba pada biakan murni selanjutnya dinokulasi pada bagian mediu yang baru dengan menggoreskan secara zig zag pada medium yang telah dibuat. Penggoresan seara zig zag dimaksudkan agar pertumbuhan koloni yang baru bisa menyebar sehingga kemungkinan tumbuhnya lebih besar oleh karena keberadaan substrat yang cukup. Setiap langkah dalam tahap ini dilakukan secara aseptik agar tidak terjadi kontaminasi, oleh karena itu setiap membuka dan menutup cawan

Petri harus dipanaskan dahulu dalam nyala api. Setelah digores media dimasukkan dalam inkubator pada suhu 55 oC selama 3 hari, agar pengeraman mikroba dapat dilakukan secara maksimal pada media tersebut dan juga karena karena isolate Bacillus Lichemiformis merupakan mikroba termofilik yang optimum tumbuh pada suhu tersebut. Selanjutnya mikroba tersebut dipindahkan ke dalam medium produksi untuk memperbesar ruang bagi mikroba untuk berkembang biak. Pada tahap terakhir ialah pengukuran pH dan optical density dengan menggunakan spektrofotometer 20 D+ untuk melihat pertumbuhan mikroba dan disentrifuge untuk mengetahui sifat mikroba. Pengukuran absorbansi pada medium dengan waktu fermentasi 0 jam ialah 0,042, sedangkan pada medium dengan waktu fermentasi 72 jam ialah 0,756s. Hal ini menunjukkan bahwa semakin lama waktu fermentasi, medium semakin keruh, yang menandakan mikroba yang tumbuh semakin banyak. Mikroba tersebut adalah jenis mikroba ekstraseluler, hal ini ditandai dengan larutnya tersebut dalam air.

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan Dari percobaan dapat disimpulkan bahwa enzim -1,3-glukanase dapat diisolasi dari mikroba Bacillus lichemiformis strain HSA3-1a.

5.2 Saran 5.2.1 Untuk Percobaan Agar pada percobaan selanjutnya waktu yang digunakan tidak terlalu lama. 5.2.2 Untuk Laboratorium Bahan-bahan dan alat yang akan digunakan dalam praktikum lebih dilengkapi agar praktikan dapat memperoleh data yang akurat.

Lampiran : Foto Hasil Pengamatan