ATUALIZAO SOBRE MTODOS E PROCEDIMENTOS PARA OBTENO DE POPULAES MONOSSEXO DE PEIXES: PRODUO DE FMEAS.

Yara Aiko Tabata Agncia Paulista de Tecnologia dos Agronegcios / SAA-SP Estao Experimental de Salmonicultura / CP 361 / CEP 12460-000 Campos do Jordo-SP / yara@aquicultura.br 1. Introduo As tcnicas de controle da sexualidade em peixes apresentam um grande potencial para aumentar a produtividade nos cultivos, pois permitem obter os benefcios associados ao sexo que apresenta as caractersticas morfolgicas, fisiolgicas ou comportamentais de interesse econmico. Nas criaes comerciais, uma das principais vantagens obtidas pelo cultivo monossexo, quando um dos sexos apresenta em relao ao outro, uma marcada superioridade na taxa de crescimento. Contudo, dependendo da espcie, as tcnicas de controle dos sexos podem trazer outros benefcios, tais como: supresso da reproduo, conteno de gastos energticos com a atividade reprodutiva, uniformidade de tamanho na colheita, reduo dos efeitos da maturao sexual na aparncia e na qualidade da carne, bem como a diminuio dos riscos de impacto ambiental decorrente do escape de peixes para os sistemas naturais (Beardmore et al. 2001). Em muitas espcies de peixes cultivados, as fmeas apresentam taxas de crescimento mais elevadas do que os machos, alcanando tamanhos maiores. Em alguns grupos, incluindo os salmondeos, os machos maturam antes de atingir o peso comercial, comprometendo a qualidade e a rentabilidade da criao. A maturao sexual um dos processos biolgicos que mais afetam a produtividade, pois durante este perodo, a energia para o crescimento somtico canalizada para a produo de gametas, resultando na diminuio do crescimento, da eficincia alimentar, da sobrevivncia e da qualidade do pescado (Bye e Lincoln, 1986). Alm disso, aps atingirem a maturao sexual, os salmondeos machos desenvolvem algumas caractersticas sexuais secundrias que consistem, principalmente, na projeo da mandbula em forma de gancho e no espessamento e escurecimento da pele, que so indesejveis sob o ponto de vista comercial. Estas alteraes associadas queda da resistncia e ao aumento do comportamento agressivo os predispem a infeces por fungos e bactrias, que alm de comprometerem a comercializao podem provocar a morte dos animais (Brown e Roberts, 1982). Assim, em algumas espcies, particularmente em truta arco-ris, o cultivo de lotes femininos vantajoso, pois se elimina o problema da maturao sexual precoce dos machos e, ao mesmo tempo, pode-se aumentar a produo de ovos com o mesmo custo de manuteno de reprodutores. 2. Sexualidade em peixes Em peixes, a expresso da sexualidade bastante diversificada, proporcionando um excelente material para os estudos relacionados a diferenciao e a evoluo do sexo entre os animais. Os peixes podem ser classificados como: gonocricos (quando os sexos ocorrem separadamente nos indivduos); hermafroditas (ambos os sexos esto presentes no mesmo indivduo); e unissexuados (espcies onde ocorre apenas o sexo feminino). Em

razo dessa ampla variao, machos e fmeas poderiam ser melhor definidos, respectivamente, como produtores de smen e de ovos (Yamamoto, 1969). As espcies cultivadas, em sua maioria, so do tipo gonocrico, que podem ser divididas em indiferenciadas e diferenciadas. Nas gonocricas indiferenciadas, a gnada primordial, primeiro se desenvolve em uma gnada semelhante a um ovrio, e depois, metade dos indivduos torna-se macho e a outra metade torna-se fmea. Nas espcies diferenciadas, a gnada diferencia-se diretamente em um testculo ou em um ovrio. Hermafroditismo a ocorrncia de tecido ovariano e testicular em um mesmo indivduo. H trs tipos de hermafroditas: sincrnico (onde ovos e espermatozides maturam ao mesmo tempo); protognico (primeiro desenvolvem ovrio e posteriormente, revertem para testculo); protandromico (primeiro desenvolvem testculo e depois ovrio). As espcies unissexuadas apresentam reproduo natural por ginognese, onde o espermatozide do macho de uma espcie bissexual, contribui apenas para a ativao do desenvolvimento do ovo, sem ocorrncia da singamia (Yamazaki, 1983). A expresso do sexo depende de dois eventos: da determinao sexual e da diferenciao sexual. A determinao sexual responsvel pelo sexo gentico (ou genotpico), enquanto que a diferenciao sexual responsvel pelo desenvolvimento das gnadas (sexo gonadal ou fenotpico). A interao desses dois eventos resulta em dois fentipos: macho ou fmea, seja morfolgica, comportamental, ou funcionalmente (Piferrer, 2001). 2.1. Determinao sexual O sexo gentico determinado na fertilizao, pela combinao dos cromossomas provenientes do ovo e do espermatozide (Yamazaki, 1983). A determinao sexual definida como a soma de genes responsveis pela formao das gnadas e de suas caractersticas. Esses genes podem estar espalhados pelo genoma ou a maioria deles, concentrados em um par de cromossomas que, neste caso, so chamados de cromossomas sexuais. H trs modelos de determinao sexual que podem ser aplicados em peixes: cromossmico, polignico e interao gentipo-ambiente (Piferrer, 2001). A determinao sexual cromossmica implica na presena de cromossomas sexuais, onde um par de cromossomas (denominados de heterocromossomas) acumula a maioria dos genes responsveis pelo desenvolvimento sexual. A maioria dos peixes no apresentam heterocromossomas, no sendo morfologicamente distintos. Mas com base em anlises citogenticas, reverso sexual e cruzamentos controlados, oito sistemas cromossmicos j foram descritos. Estes sistemas variam desde sistemas simples, como XX/XY ou WZ/ZZ, at os mais complexos, envolvendo mais que um par de cromossomas sexuais ou diferentes nmeros de cromossomas, dependendo do sexo. O sexo em que os cromossomas so iguais chamado de homogamtico, e heterogamtico, quando os cromossomas so diferentes. Os sistemas cromossmicos XX/XY e ZW/ZZ so os mais freqentes entre as espcies cultivadas e, neles, a proporo sexual na prognie no difere significativamente de 1:1. No sistema XX/XY, as fmeas so homogamticas, e os machos heterogamticos , enquanto que no sistema ZW/ZZ, as fmeas so heterogamticas e os machos homogamticos. A denominao de XY ou ZW usada apenas para evitar confuses, quando se descreve os dois sistemas (Tave, 1993). No sistema polignico de determinao sexual, genes epistticos determinantes do sexo esto presentes tanto nos cromossomas autossmicos, como nos heterocromossomas e o sexo do embrio ser resultante da combinao dos fatores masculinos e femininos, presentes no conjunto cromossmico herdado de cada parental (Hunter e Donaldson,

1983). Neste sistema, a proporo sexual macho:fmea, ser diferente de 1:1. A influncia que esses genes influenciadores ou modificadores do sexo tm sobre a determinao sexual, constitui um problema quando se objetiva a produo de lotes monossexos. Embora a determinao sexual ocorra principalmente sob controle gentico, fatores ambientais, tais como: temperatura, fotoperodo, salinidade e altas densidades de estocagem, podem ter influencia nesse processo. A determinao sexual pela interao gentipo-ambiente, est se tornando evidente em um nmero cada vez maior de espcies, mostrando que possvel controlar o sexo pela manipulao ambiental. 2.2. Diferenciao sexual A diferenciao sexual envolve todos os eventos que ocorrem durante o desenvolvimento, resultando na expresso do sexo gentico no sexo fenotpico. Inclui os primeiros eventos que ocorrem desde a gnada primordial at a diferenciao completa em testculos ou ovrios. Nas espcies gonocricas diferenciadas, a diferenciao sexual ocorre primeiro nas fmeas e depois nos machos. Os primeiros sinais de diferenciao sexual nas fmeas so a entrada das oogonias na meiose e/ou a proliferao das clulas somticas para formar a cavidade ovariana. Nos machos, a diferenciao sexual caracterizada pelo surgimento da espermatogonia, pelo arranjo das clulas germinativas e somticas em lbulos e pela diferenciao do sistema vascular do testculo, incluindo os ductos espermticos. A natureza do indutor endgeno da diferenciao sexual ainda no est totalmente esclarecida, mas, muitas evidncias reforam a idia de que os esterides sexuais so, de fato, indutores naturais da diferenciao sexual em peixes. Mais recentemente, muitas pesquisas tm enfocado a importncia das enzimas esteroidognicas, no processo da diferenciao sexual em peixes e outros vertebrados. Salmes machos funcionais foram obtidos de fmeas genotpicas tratadas com inibidor especfico da aromatase, evidenciando que os estrgenos endgenos so responsveis pela diferenciao ovariana e que a aromatase tem um papel fundamental neste processo (Piferrer, 2001). 3. Mtodos de feminizao A produo de lotes monossexos femininos pode ser obtida pelo tratamento hormonal (reverso sexual) e pela induo da ginognese (manipulao cromossmica). 3.1. Produo de lotes monossexos femininos pela tcnica hormonal O controle artificial do sexo em peixes, pela administrao hormonal, iniciou-se com os trabalhos realizados no final de 1930 e princpio de 1940 (reviso em Yamamoto, 1969). Os resultados obtidos nesses estudos proporcionaram no somente informaes sobre os mecanismos genticos da diferenciao sexual, mas tambm demonstraram as potencialidades de suas aplicaes em espcies economicamente importantes, onde os cultivos monossexos so vantajosos. Uma vez que os esteroides sexuais esto envolvidos no processo natural de diferenciao sexual, esse processo pode ser controlado pela administrao de hormnios sexuais, em peixes sexualmenbte indiferenciados, alterando o curso da diferenciao no sentido do sexo desejado. A feminizao pela tcnica hormonal pode ser conduzida, diretamente, pelo fornecimento de estrgenos durante os estgios iniciais do desenvolvimento, ou, indiretamente, pela masculinizao de fmeas genotpicas com andrgenos e posterior

fertilizao de vulos normais com o smen dessas fmeas masculinizadas (Piferrer e Donaldson, 1989). A feminizao direta pode ser aplicada em qualquer espcie, independentemente do sistema de determinao sexual, ou qual o sexo homogamtico ou heterogamtico, enquanto que, a feminizao indireta indicada para aquelas espcies em que as fmeas so homogamticas no sistema de determinao sexual . So vrias as espcies em que o acasalamento de fmeas masculinizadas com fmeas normais produz uma prognie totalmente feminina, entre elas: truta arco-ris, salmo do Atlntico, tilpia do Nilo, medaka, goldfish, etc. (Piferrer, 2001) A utilizao do mtodo indireto o mais indicado, pois os peixes submetidos ao tratamento hormonal so em nmero reduzido e no so destinados ao consumo humano, mas empregados como reprodutores e, ainda, a prognie resultante 100% feminina, pois as fmeas revertidas, embora sejam funcionalmente machos, so genotipicamente femininas (Piferrer e Donaldson, 1988). Alm disso, restries como a alta mortalidade e a reduo no crescimento, foram verificadas durante o tratamento de feminizao por estrgenos tornando este mtodo impraticvel do ponto de vista econmico. Outra desvantagem deste mtodo consiste no fato de que os animais tratados no podem ser utilizados como reprodutores, pois metade deles, supostamente, so machos genotpicos (Johnstone et al., 1979). Por outro lado, o mtodo indireto requer mais de uma gerao para a produo de lotes 100% femininos. Na implantao do mtodo necessrio realizar a separao entre as fmeas masculinizadas e os machos normais, atravs do teste de prognie ou pela observao direta das gnadas (Bye e Lincoln, 1986). Uma vez que o primeiro lote monossexo feminino tenha sido obtido, essa identificao torna-se desnecessria, pois o tratamento de masculinizao pode ser aplicado em uma parcela totalmente feminina. O sucesso da reverso sexual depende do tipo, da natureza e da concentrao do hormnio utilizado, bem como da via de administrao, da poca de incio e da durao do tratamento. A resposta administrao de esterides sexuais varia muito de acordo com o estgio de desenvolvimento, portanto, o perodo em que o tratamento conduzido (fase de maior sensibilidade ao esteride exgeno), mais importante do que a dosagem ou a durao do tratamento (Piferrer e Donaldson, 1993). Segundo Yamamoto (1969), para se promover uma reverso do sexo de modo eficiente, a administrao dos esterides sexuais deve ser iniciada antes do aparecimento dos primeiros sinais da diferenciao e continuar at a fase em que a diferenciao tenha se estabelecido. Nas espcies gonocricas diferenciadas, a reverso do sexo obtida de modo artificial , provavelmente, permanente, pois a ao dos genes determinantes do sexo gonadal restrita ao perodo da diferenciao, enquanto que, nas espcies hermafroditas, os genes ligados ao sexo podem se expressar em estgios mais avanados do desenvolvimento gonadal (Yamazaki, 1983). A truta arco-ris classificada quanto ao tipo de sexualidade, como uma espcie do tipo gonocrico diferenciado, onde a gnada diferencia-se diretamente em um testculo ou em um ovrio (Takashima et al., 1980). Nela, o sexo gentico determinado no momento da fertilizao, pelos cromossomas sexuais, como acontece na maioria dos peixes gonocricos, entretanto, a diferenciao sexual ocorre algum tempo aps a ecloso, no perodo final da absoro do saco vitelnico, quando se inicia a alimentao (Yamazaki, 1983). Os primeiros sinais da diferenciao aparecem primeiro nas fmeas, entre 18 e 28 dias aps a ecloso, a uma temperatura de incubao de 11,5C (Van den Hurk e Sloff, 1981). Nesses estgios iniciais do desenvolvimento, a diferenciao sexual

bastante lbil e a reverso completa e funcional dos sexos pode ser facilmente obtida pela administrao de hormnios esteroidais (Yamamoto, 1969). Estes tratamentos so conduzidos nas fases iniciais do desenvolvimento, muitos meses antes da comercializao e os resduos desses esterides desaparecem em menos de um ms depois de finalizado o tratamento (Piferrer, 2001). A administrao do hormnio pode ser feita por vrios modos, entretanto, sob condies comerciais, a escolha deve levar em considerao a sua praticidade. Dentre as vias de administrao, as mais recomendadas so as que veiculam o hormnio atravs da rao ou atravs de banhos de imerso. Em salmondeos, os banhos de imerso aplicados prximos ecloso, so eficientes para veicular os esterides, pois, essas espcies possuem um grande volume de vitelo, que serve como reservatrio para o hormnio, que absorvido durante a fase de diferenciao sexual (Piferrer, 2001). Dentre os estrgenos, o 17 beta-estradiol tem sido o mais utilizado para se promover a feminizao pois, alm de ser eficiente, natural, sendo menos impactante ao ambiente (Piferrer, 2001). Doses de 20 mg.Kg-1 de dieta, com ou sem imerso prvia de ovos olhados e alevinos em soluo aquosa de 250 g.L-1, foram suficientes para induzir a feminizao em truta arco-ris (Johnstone et al., 1978). A masculinizao tem sido conduzida usando-se 17 alfa-metiltestosterona (MT), que por ser sinttico mais potente do que os naturais e, portanto, a dose empregada menor. Por outro lado, por demandar maior tempo para ser degradado na natureza mais nocivo ao ambiente (Lee e Donaldson, 2001). A dose efetiva de MT, para se obter a reverso sexual de fmeas para machos funcionais, espcie especfica. Okada et al. (1981) analisaram diferentes concentraes de MT em truta arco-ris, usando alevinos todos fmeas, que foram obtidos pela fertilizao de ovos normais com smen de fmeas masculinizadas. Doses que variaram de 0,01 e 100 mg.Kg-1 de rao foram administradas por 8 semanas, a partir do incio da alimentao, a uma temperatura de 10C. A maior porcentagem (84,4%) de machos foi obtida com a dose de 0,5 mg.Kg-1 de dieta. As fmeas masculinizadas apresentam testculos morfologicamente alterados e na maioria das vezes, com ductos espermticos ausentes, sendo necessrio o sacrifcio dos animais e a remoo cirrgica das gnadas para a utilizao do smen. Este smen coletado diretamente do testculo apresenta uma reduo na taxa de fertilizao, provavelmente, em razo da presena de grande quantidade de espermtides. Para racionalizar a produo de lotes monossexos femininos, o smen obtido das fmeas masculinizadas poderia ser criopreservado, dispensando-se deste modo a prtica contnua do tratamento hormonal (Hunter et al., 1983; Kavamoto et al., 1991; Silveira et al., 2000). Entretanto, para viabilizar o emprego desta tcnica torna-se necessrio produzir fmeas masculinizadas com ductos espermticos funcionais, como os descritos por Tsumura et al. (1991) e Tabata et al. (2000), uma vez que o smen obtido de fmeas com ductos mostrou-se qualitativamente semelhante ao de machos normais. Por ser aromatizvel, o MT, quando administrado em doses superiores quelas recomendadas para a reverso ou por perodos prolongados, produz a chamada feminizao paradoxal (Solar e Donaldson, 1985). Por outro lado, quando administrado em doses elevadas, ao redor de 25 mg.Kg-1 de rao, promove a esterilizao das gnadas (Mellito da Silveira et al., 1995). Nos casos em que se deseja promover a esterilidade reprodutiva, os autores recomendam a utilizao de banhos de imerso, seguidos do fornecimento do hormnio na dieta (Mellito da Silveira et al., 1995). Embora a esterilizao possa ser induzida por

tal tratamento, a necessidade da exposio a altas doses de hormnios andrognicos limita o seu uso na produo de salmondeos estreis em larga escala. 3.2. Produo de lotes monossexos femininos pela manipulao cromossmica As tcnicas de controle da sexualidade em peixes, atravs da manipulao dos conjuntos cromossmicos, so praticveis devido facilidade com que os gametas desses animais podem ser manipulados e fertilizados artificialmente (Thorgaard, 1983). Neste aspecto, os peixes oferecem vantagens tcnicas em relao aos vertebrados superiores, por possurem um sistema biolgico menos especializado, permitindo certas manipulaes que so impraticveis nos animais domsticos comumente utilizados em produo. Algumas dessas facilidades so: fecundao externa, alta fecundidade, diferenciao sexual controlvel e intervalo de gerao relativamente curto (Tsukamoto e Rigolino, 1993). A manipulao dos conjuntos cromossmicos pode ser realizada durante os ciclos nucleares da diviso celular e, basicamente, compreende a subtrao ou a adio de um conjunto completo, haplide ou diplide, na meiose ou mitose, respectivamente. A subtrao feita pela destruio de um conjunto, ou na clula espermtica ou no ovcito, enquanto que a adio obtida pela ruptura dos fusos metafsicos durante a carioquinese, tanto no tecido somtico (mitose) quanto na clula germinativa (meiose), impedindo a separao dos conjuntos cromossmicos nas clulas filhas (Purdom, 1983). Trs fenmenos podem ser induzidos pela manipulao dos conjuntos cromossmicos: a ginognese, a andrognese e a poliploidia. A ginognese, uma forma de herana inteiramente maternal, consiste na estimulao do desenvolvimento de um ovo por um espermatozide geneticamente inativado e posterior diploidizao pela reteno do 2o corpsculo polar, ou pelo bloqueio da primeira clivagem. A andrognese o reverso da ginognese, onde o embrio formado apenas com a contribuio gentica paternal, geralmente atravs da irradiao dos ovos antes da fertilizao e o resgate da condio diplide, obtido pelo bloqueio da primeira diviso mittica. A induo a poliploidia consiste na produo de indivduos contendo um nmero superior aos dois conjuntos cromossmicos que caracterizam a condio normal (reviso em Arai, 2001). Nos casos em que as fmeas so homogamticas na determinao sexual, como a truta arco-ris (Thorgaard, 1977), a ginognese pode ser usada para a produo de populaes monossexuadas femininas. Entretanto, os indivduos ginogenticos, por serem de herana exclusivamente materna, apresentam maior consanginidade, e nem sempre so recomendados para utilizao direta nos cultivos (Thorgaard, 1986). Alm disso, a produo de ginogenticos em escala comercial ainda impraticvel, devido alta mortalidade resultante do tratamento. Contudo, essas fmeas ginogenticas podem ser masculinizadas com tratamento de andrgenos e utilizadas como doadoras de smen, na produo de lotes 100% femininos. Este processo eliminaria o teste de prognie necessrio para a distino entre machos genotpicos e fmeas masculinizadas (Donaldson e Hunter, 1982; Olito e Brock, 1991). Em um protocolo para induo ginognese, alguns pontos crticos devem ser contornados: inativao gentica dos espermatozides, restaurao da diploidia e avaliao da condio ginogentica. As radiaes ionizantes, como raios X e Gama, podem ser usados na inativao dos espermatozides, entretanto, essas radiaes no tm sido muito eficazes na

inativao total do genoma e fragmentos dos cromossomas paternos podem ser expressos na prognie (Thorgaard et al.,1985). A radiao ultravioleta (germicida), tem sido mais indicada para esses tratamentos (Chourrout, 1984), pois alm de ser eficiente na destruio do DNA dos espermatozides, em doses corretas, no compromete a motilidade espermtica. Porm, dada a sua baixa capacidade de penetrao, antes de ser tratado o smen deve ser diludo, para favorecer a ao da luz ultravioleta nos espermatozides. Aps a inseminao e a ativao do ovo pela hidratao, a segunda diviso meitica reiniciada, ocorre a expulso do segundo corpsculo polar, o incio da segmentao e desenvolvimento do embrio. Os ovcitos fertilizados com espermatozides inativados desenvolvero embries haplides, que so inviveis e morrem durante o desenvolvimento embrionrio, antes ou logo aps a ecloso (Arai, 2001). Nos vertebrados inferiores, a aparncia dos embries haplides bem caracterstica e compreendem severas ms-formaes de cabea, olhos pouco desenvolvidos, reduo do tamanho do corpo e da cauda. A restaurao da diploidia pode ser conduzida atravs da aplicao de tratamentos fsicos (choques de temperatura ou de presso), ou qumicos, nos ovos fertilizados. Estes tratamentos promovem a despolimerizao da tubulina que compem os microtbulos do fuso, impedindo a disjuno dos cromossomas. O choque trmico (frio ou quente), o tratamento mais comumente empregado, pois, alm de no requerer aparelhos especializados, pode tratar grande quantidade de ovos. A temperatura do choque deve ser prxima ao limite de sobrevivncia da espcie. Para os salmondeos, que so peixes de guas frias, os ovos devem ser mergulhados em gua com temperaturas prximas 28C, sendo o diferencial trmico de 18C (Refstie e Donaldson, 1982). Se o choque for aplicado logo aps a fertilizao, o embrio se diploidizar pela reteno do 2o corpsculo polar e denominado de ginogentico meitico. Quando o choque aplicado tardiamente, a diploidizao ocorrer pelo bloqueio da 1a clivagem e o indivduo resultante ser denominado de ginogentico mittico. O nvel de consanginidade desses embries ginogenticos vai depender do modo com que a diploidizao induzida. Se a diploidizao ocorrer pela reteno do 2o corpsculo polar, o grau de endogamia ser determinado pela freqncia de crossing-over na primeira diviso meitica. A consanginidade baixa para as caractersticas que apresentam alta heterozigose residual. Para algumas espcies, incluindo a truta arco-ris, esta heterozigose residual bastante alta e, portanto, nessa espcie, a diploidizao meitica no pode ser considerada uma ferramenta eficiente para promover a endogamia (Purdom, 1993). Contudo, se a diploidizao for induzida pela inibio da 1a clivagem mittica (endomitose), aps a duplicao do genoma haplide, os embries resultantes sero homozigotos para todos os loci. A reproduo ginogentica subseqente ir produzir linhagens de clones constitudas de peixes geneticamente idnticos, enquanto que cruzamentos entre 2 indivduos endomitticos no relacionados iro produzir clones hbridos heterozigotos (Arai, 2001). Portanto, se a ginognese for direcionada para a produo de lotes monossexos femininos, a diploidizao deve ser conduzida pela reteno do 2o corpsculo polar. Para o controle da condio ginogentica, isto , para verificar se nas prognies ginogenticas no houve contribuio gentica paternal, o smen irradiado que utilizado para a ativao do ovo, deve ser obtido de machos portadores de marcadores fenotpicos, de carter dominante, ou de machos de espcies no relacionadas. Tcnicas moleculares

(DNA fingerprinting), que permitem identificar os parentais tambm podem ser empregadas para a certificao da condio ginogentica.

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